Summary
Мы разработали непрерывный культивирования аппарат для использования с оптогенетика систем для освещения культуры микробов и регулярно клеток изображений в сточные воды с помощью инвертированного микроскопа. Культивирование, отбор проб, изображений и анализа изображений полностью автоматизированы, так что динамические реакции на освещение может быть измерена в течение нескольких дней.
Abstract
Оптогенетика системы используют генетически кодируемых ими белков, которые изменяют конформацию в ответ на определенную длину волны света, чтобы изменить клеточные процессы. Существует потребность в культивировании и измерительных систем, которые включают запрограммированным освещение и стимулирование оптогенетика систем. Мы представляем протокол для построения и использования непрерывного культивирования устройства для освещения микробных клеток с запрограммированным дозами света, и автоматически получать и анализировать изображения клеток в сточных водах. Функционирование этого аппарата в хемостате позволяет скорость роста и клеточная среда строго контролироваться. Поток, выходящий из непрерывной культуры клеток регулярно отбирают и клетки изображаются с помощью многоканальной микроскопии. Культивирование, отбор проб, изображений и анализа изображений полностью автоматизированы таким образом, что динамические характеристики интенсивности флуоресценции и клеточной морфологии клеток, отбираемых из культуральной стоках измеряются в течение нескольких днейбез ввода данных пользователем. Показана полезность этого устройства для культивирования путем динамического индукции продуцирования белка в штамме Saccharomyces CEREVISIAE спроектированной с системой оптогенетика , который активирует транскрипцию.
Introduction
Оптогенетика системы используют свет , чтобы контролировать растущий список клеточных процессов , включая экспрессию генов, 1, 2, 3, 4, 5 локализацию белка, 6 активность белка, 6, 7, 8 Связывание с белками, 8, 9, 10 и деградации белка. 11 Способ культивирования клеток в контролируемой среде с программируемым оптической стимуляции и для измерения их реакции более биологически соответствующих временных рамок необходимо использовать потенциал этих инструментов для исследований в области клеточной биологии и биотехнологии. Наш метод использует преимущества chemostasis для поддержания постоянной скорости роста клеток в хорошо перемешанных, аеспроектировано, и с регулируемой температурой стеклянный сосуд 12 Культивирование, 13 , который подвергается воздействию программированного освещения. Мы изображение отдельные клетки в культуральную стоках с помощью инвертированного микроскопа, чтобы измерить отклик культуры запрограммированным освещения. Культивирование, отбор проб, изображений и анализа изображений полностью автоматизированы таким образом, что интенсивность флуоресценции и клеточная морфология вытекающем культуры клеток может быть измерена в течение нескольких дней, без ввода данных пользователем.
Этот протокол может быть реализован в большинстве лабораторий, знакомых с растущей культуре клеток и микроскопии, а аппарат, используемый недорог и сделаны из легко доступных компонентов. Прозрачный сосуд для культивирования помещается над матрицей светодиодов (LED) , способные излучать 1 мкВт / см 2 -10 мВт / см 2 света. Микробы выращивают в непрерывно культивирования сосуд; один перистальтический насос используется для добавления средств массовой информации вСтепень разбавления, другая используется для вывести культуру при меньшей скорости к микроскопу, и разница выходит через выпускное отверстие перелива. Электрогрелка поддерживает температуру. Воздух непрерывно закачивают в культурального сосуда для поддержания положительного давления, а также смешивать и аэрацию культуру. для воздушного насоса За исключением случаев, питание этих устройств регулируется микроконтроллером, который также принимает входной сигнал от термометра и подключенного настольного компьютера. Выходящий поток клеточной культуры перекачивают в микрожидком устройство на стадии инвертированного микроскопа. Нефлуоресцентной и флуоресцентные изображения автоматически приобрели. Клетки в изображениях характеризуются алгоритмом, который определяет местонахождение каждой ячейки как область интереса (ROI) и измеряет свойства каждого ROI.
Чтобы продемонстрировать применение этого протокола, мы измерили реакцию на различной интенсивности света клеток Saccharomyces CEREVISIAE сконструированных с синим светом тавленныеве оптогенетика систему, которая контролирует транскрипцию флуоресцентного белка. S.cerevisiae , , широко известный как пекарских дрожжей, был выбран потому , что множественные оптогенетика системы для контроля экспрессии генов в этой системе уже существуют 14, 15, 16. Кроме того, эта модель организма обычно используется для исследований в биологии систем 17 и в качестве шасси для биотехнологического применения 18, 19, 20. Наши репрезентативные результаты показывают, что этот протокол может быть использован для контроля транскрипции культуры в течение нескольких дней путем изменения входного интенсивности света и измерения производства флуоресцентного репортера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Рисунок 1: Непрерывный Культивирование аппарат. Эта упрощенная схема показывает, как аппарат должен быть собран, когда он используется для культуры, освещают, и измерения оптических свойств микробов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Обзор протокола. Действия, описанные в затененной области должны повторяться каждый раз, когда используется протокол. Управление в замкнутом контуре можно 34, но не реализована в данном протоколе.
1. Установите термометр с печатной платой
Рисунок 3: Соединения для считывания значений термометра. Эта диаграмма показывает, как цифровой термометр должен быть подключен к печатной плате таким образом, что микроконтроллер может получить обратную связь, чтобы контролировать температуру культуры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Припой Ground, данные и положительные линии напряжения цифрового термометра в их соответствующие сквозные отверстия с маркировкой "GD + V".
- Клип от одного контакта из женского заголовка 3-контактный и обрезать оставшиеся 2 булавки с проводными машинки для стрижки, так что он может поместиться в два сквозных отверстия с маркировкой "R2", а не препятствовать микроконтроллер. Припой это на месте. Соедините два спаянных булавки, вставляя 4,7 кОм резистор в заголовке выводами.
2. Подключите питания ConTROL Компоненты с печатной платой
Рисунок 4: Подключение для управления мощностью в грелку. Эта диаграмма показывает, как PCB и вспомогательные части должны быть собраны для того, чтобы контролировать мощность на грелку. Части для управления перистальтические насосы соединены аналогичным образом. Обратите внимание, что компоненты для термометра были удалены для ясности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Обрежьте 1 см от штырей пяти женских заголовков 3-контактный. Припой их на позиции, на печатной плате (PCB), помеченный как "# 1", "# 2", "# 3", "# 4" и "CB Е."
- Обрежьте 1 см от булавки женского 6-контактный и 8-контактный разъем. Припой эти бок о бокколонна сквозных отверстий маркированы K1 через К14.
- Подключение грелку к печатной плате.
- Вставьте концы 100 кОм в сквозные отверстия с маркировкой K1 и K2 на печатной плате. Вставьте металл-оксид-полупроводник полевой транзистор (MOSFET) в положение, обозначенное # 1 на печатной плате, с этикеткой полевого МОП-транзистора, обращенной к K1 через К14 сквозные отверстия таким образом, чтобы источник штифт находится ближе всего к "# "ярлык, и дренажный штифт отдален от" # "этикетке.
- Обрежьте заземления линии постоянного тока кабеля питания 5 В (DC) и подключить его к J2. Подключите провод заземления линии грелку к J1. Подключить К3 к контакту 3 с 1 кОм сопротивлением. Ток должен теперь только поток от J1 до J2, когда штырь 3 установлен на + 5V.z
Примечание: резистор / MOSFET набор функций как переключатель, который позволяет току течь от контактов J1 на J2, когда контакт 3 микроконтроллера устанавливается на +5 В.
- подключатьмедленный перистальтический насос.
- Вставьте концы 100 кОм в сквозные отверстия с маркировкой К4 и К5 на печатной плате. Вставьте МОП-транзистор в положение, обозначенное # 2 на печатной плате, с этикеткой полевого МОП-транзистора, обращенной к K1 через К14 сквозные отверстия таким образом, чтобы источник штифт находится ближе всего к "#" этикетки, и дренажный штифт на противоположной стороне от "#" метка.
- Разрежьте линию заземления цепи постоянного тока кабеля 12 V питания медленного перистальтического насоса. Подключите перистальтический насос, обращенную конец J3 и стеной бородавка, обращенную конец J4. Подключите К6 к контакту 4 с 1 кОм сопротивлением. Ток должен теперь только поток от J3 до J4, когда штырь 4 установлен на +5 В.
- Подключите быстрый перистальтический насос
- Вставьте концы 100 кОм резистор в сквозные отверстия с маркировкой K7 и K9 на печатной плате. Вставьте МОП-транзистор в положение, обозначенное # 3 на печатной плате, с этикеткой полевого МОП-транзистора, обращенной к K1 через K14 сквозные отверстия с о том, что источник контактный находится ближе всего к "#" этикетке, и дренажный штифт отдален от "#" этикетке.
- Разрежьте линию заземления цепи постоянного тока кабеля 12 V источника питания быстрого перистальтического насоса. Подключите перистальтический насос, обращенную конец J5 и стеной бородавка, обращенную конец J6. Подключение K9 к контакту 5 с 1 кОм сопротивлением. Ток должен теперь только вытекать из J5 к J6, когда штырь 5 установлен на +5 В.
3. Подключите светодиодная матрица с печатной платой
Рисунок 5: Соединения для управления светодиодной матрицы. Эта диаграмма показывает, как светодиодная матрица должна быть подключена к печатной плате. Он также показывает, что печатная плата может быть уложены на микроконтроллере. Обратите внимание, что компоненты для термометра и для управления мощностью постоянного тока с другими устройствами, были удалены для ясности.эс / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Припой 6-контактный, 10-контактный и два 8-контактный разъем заголовки контактов в отверстия сквозные по сторонам печатной платы таким образом, что она может быть уложены на верхней части микроконтроллера.
- Припой 100 нФ и 10 мкФ конденсаторов их отмеченных местах на печатной плате, отметив, что отрицательный вывод 10 мкФ конденсатора (короче свинца) должен быть подключен к сквозного отверстия, отмеченные отрицательным знаком.
- Припой светодиодный драйвер на 2 по 12 набора сквозных отверстий, с углублением на водителя далеко от сквозных отверстий, зарезервированных для светодиодной матрицы.
- Припой 2 колонки мужских заголовков контактов для сквозных отверстий, помеченных для светодиодной матрицы, и обрезать концы этих под макете таким образом, что они не будут препятствовать микроконтроллер. Подключите их к двум 8-проводных полос женских / женских перемычек. Подключите второй набор мужскихконтактные разъемы на другом конце перемычек.
- Вставьте светодиодную матрицу над медианой макете, а затем вставьте второй набор контактных заголовков столбцов по обе стороны от матрицы. Убедитесь, что электрические соединения являются такими же, как если светодиодная матрица была непосредственно соединена с печатной платой с меченым стороне матрицы, соответствующей меченой колонке сквозных отверстий.
- Клип от одного контакта из женского заголовка 3-контактный и обрезать оставшиеся 2 булавки с проводными машинки для стрижки, так что он может поместиться в два сквозных отверстия с маркировкой "R1", а не препятствовать микроконтроллер. Припой это. Соедините два спаянных булавки, вставляя 1 кОм резистор в заголовке выводами.
Примечание: Культивирование судно будет укладываться над светодиодной матрицы. Если провод ленты препятствуют судно, смещение от матрицы. Затем, используя твердую основную проволоку, чтобы преодолеть разрыв между матричными штырями и провода ленты булавки, таким образом, что электрические соединения не CHАнж.
4. Установка программного обеспечения и подключение к Hardware
- Стек PCB на микроконтроллер.
- Следуйте по ссылкам в списке материалов для загрузки интегрированной среды разработки (IDE) и пользовательский код для микроконтроллера.
- Подключение микроконтроллера к микроскопу компьютеру с помощью универсальной последовательной шины (USB) кабель AB. Компилировать и загружать пользовательский код для микроконтроллера.
- Скачать Micro-Manager 21, 22 и 23 Fiji. Настройка Micro-Manager в качестве подключаемого модуля ФИДЖИ путем копирования всех ".dll", каталог "mmplugins", и "mmautofocus" каталог из каталога, где Micro-менеджер был загружен в каталог "Fiji.app". Кроме того, скопируйте "плагины / Micro-Manager" каталога в каталог "Fiji.app/plugins~~HEAD=pobj".
- Скачать "BioreactorController.jar" файл Intо директории "Fiji.app/mmplugins~~HEAD=pobj".
- Открытый Micro-менеджер от ФИДЖИ> Плагины> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. С помощью аппаратного мастера настройки для настройки программного обеспечения для управления микроскопом. Включите устройство "FreeSerialPort" в мастере с меткой порта, к которому подключен кабель USB AB.
5. Сделайте и Охарактеризовать светонепроницаемыми Корпус для культурального сосуда
- Стек три 8-контактный IC розетки в качестве строительных блоков на макете на каждом углу светодиодной матрицы таким образом, что культивирование судно может покоиться на них выше матрицы.
- Закрепить часть диффузионной бумаги под верхним слоем из гнезд, таким образом, что свет, падающий на судно от культивирования светодиодной матрицы диффузно.
- Вырежьте три 8 "на 6" порциями черной пены. Вырезать часть, которая имеет те же размеры, как электронная макете (2,3 "х 3,5") от внутренней части первой ТВтO, и часть, которая является размер прямоугольника, сделанного гнездах IC (0,9 "х 1,8") с внутренней стороны третьего. Штабелировать эти слои над светодиодной матрицы таким образом, чтобы последний слой, содержащий 0,9 "х 1,8" апертура лежит вровень с верхней части гнезда IC, и окружает светодиодная матрица.
- Вырезать дополнительный лист черной пены пополам, чтобы сделать прямоугольник 6 "на 24". Ролл это в полую колонну черного пены, что для культивирования сосуд может поместиться в с комнатой для трубок и проводов, таким образом, что она будет термически и оптически изолирования для культивирования сосуд.
- Сосредоточьте полый столб черного пены над светодиодной матрицы, и отметьте границу столбца на слой черной пены под ним. Эта граница будет отмечать, где она должна быть сосредоточена в будущем.
- Вырежьте 3 "х 3" часть черной пены. Используйте это позже в качестве крышки, который может быть закреплен в верхней части колонны, чтобы блокировать внешний свет.
- Закрепить датчик фотодиод мощности к й е культивированием колпачок судна с лентой, прикрепить крышку, и вставьте в сосуд для культивирования корпуса.
- В Micro-Manager, перейдите к Plugins> биореактора Controller. Установите матрицу для освещения на подмножества диапазона возможных интенсивностей на 30-секундные интервалы.
- Запись интенсивности света, как показано на измеритель мощности консоли, подключенной к датчику мощности. Эти измерения позволят фактическая интенсивность света, чтобы быть известным, когда количество светодиодов, которые светятся, и широтно-импульсной модуляцией (ШИМ) тока для этих светодиодов установлен.
6. Подготовить культурального сосуда
Рисунок 6: Емкость подключения. Эта диаграмма показывает, как сосуд и трубки аппарата должен быть подключен перед автоклавной.пустым "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Отметьте высоту, соответствующую каждому 2 мл приращению жидкости в диапазоне от 10 до 30 мл в культурального сосуда. Вставьте 10 мл стерильной деионизированной воды, отметьте уровень воды, добавьте 2 мл, отметьте уровень воды, и повторять, пока уровень 30 мл не отмечено. Накройте маркировки с ясной лентой так, чтобы они не так легко удалены, и утилизировать жидкости.
- Поместите длинный конец порта алюминия через силиконовой прокладкой, в культурального сосуда. Винт на крышке.
- Накройте один выход порта короткий алюминий с 1/16 "ID силиконовой трубки. Вставьте дистальный конец, вставив женский замок Люэра , а затем соединительный разъем замка с мужской Luer. Этот выход является дополнительным, и не будет использоваться (труба 6 на рисунке 6 ).
- Соедините два коротких сегментов 1/16 "ID силиконовой трубки с мужскими и женскими Luer замков. Подключите один конец к розетке короткого алюминиевого порта и подключить Количесл конец с мужской Luer и вилки замка женского Луер. Судно будет прививали через эту трубу (труба 7 / 7.1 на рисунке 6).
- Подключите два 1/16 "ID трубки к концам 1/16" ID перистальтический и разъемов. Подключите один конец к короткому алюминиевом порту и подключите другой (трубы 4 на рисунке 6). В дальнейшем это будет подключен к мультимедийному колбу.
7. Подготовьте носитель колба
- Подключите 1/16 "внутренний диаметр (ID) силиконовую трубку к длинной алюминиевой порту. Трубка должна быть достаточно длинной, чтобы достигнуть флягу носителя. Подключите 1/8" люэровского ID Мужского на коротком отрезке 1/16 " ID трубки, подключить к предыдущей трубке ,, а затем вставить этот короткий отрезок в резиновую пробку на колбе медиа (труба 3 на рисунке 6).
- Зажмите трубку. Такое соединение позволяет воздуху поступать из медиа колбы в культуральный сосуд. Когда колба СМИ позже накачке воздуха следующиеd эта трубка unclamped, культура будет неоднородным, так газированная, и выдерживают при положительном давлении поступающими пузырьков.
- Вставьте 1/16 "ID трубки достаточно долго, чтобы достичь дна колбы в пробку, через которую будут передаваться СМИ. Подключите другой 1/16" идентификатор трубки к этому, а затем 3/16 "ID трубки что. Подключите это с внутренним диаметром 3/16 "женский замок Люэра и вилкой мужчина люэровского (труба 1 / 1.1 на рисунке 6).
- Третье отверстие в пробке должна быть заполнена с коротким сегментом 1/16 "ID трубки, соединенные с двумя другими сегментами труб среднего диаметра и вставлен в дистальном конце (трубка 2 / 2,1 на рисунке 6). Это будет подключен с вакуумным насосом, а затем в аквариуме насоса.
Примечание: Если трубка не может легко проходить через отверстия в резиновой пробкой, срезанные концы трубок с перекосом. Затем, наклонная конец которого выталкивается через отверстие можно использовать, чтобы вытащить остальные через.
- Вставьте мужской замок Люэра в сегмент 1/16 "ID силиконовой трубки, а затем плотно вставьте 0.022" ID политетрафторэтилена (PTFE) трубки. Отдельно приложите женский замок Люэра к 1/16 "ID трубки. Затем один конец нити вдоль трубки PTFE для подключения замков , а другой короткий алюминиевый порт (труба 5 на рисунке 6).
- Подключите открытую 1/50 "ID силиконовой трубки к 1/50" ID перистальтической трубки и разъемы. Для этого необходимо соединить три сегмента 1/50 "ID трубки и два сегмента 0,022" ID PTFE трубки, чередуя их. Подключите к вытекающего колбу через 1/16 "ID трубкой (трубная 5 на рисунке 6).
- Подключите один конец 1/16 "ID силиконовой трубки ко второй длинной трубки порта алюминия, а другой конец к вытекающему колбы. Эта алюминиевая трубка устанавливает объем культуры, а также избыток культуры перетекает в вытекающем контейнер (труба 8 в
- Автоклава сборку с последующим культивированием при температуре 121 ° С и 15 фунтов на квадратный дюйм (общий стерилизации) в течение 30 мин.
Примечание: Трубки, через которую Колбу носитель заполнен, через которую носитель Колбу вакуумируют, и через которую культивирования сосуд засевают имеют несколько сегментов трубки таким образом, что, если дистальный сегмент загрязнена, то ее можно удалить, чтобы выявить стерильный сегмент. - Автоклава сборку с последующим культивированием при температуре 121 ° С и 15 фунтов на квадратный дюйм (общий стерилизации) в течение 30 мин.
9. Подготовьте Микрожидкостных канал
- Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS) и отвердителя в соотношении 9: 1. Дега и вылить на мастер кремния формы.
- Вылечить PDMS в течение 2 ч при температуре 65 ° С, а затем разрезать ее от маски с лезвием бритвы. Вырезать вокруг PDMS, пока он не освободит из пресс-формы. Не толкайте вниз и ломая хрупкую пластину.
- Используйте 1,2 мм ID отверстий биопсия перфоратора для пробивки отверстий на обоих концах канала.
- Плазменный облигационной PDMS к покровного стекла 24.
- Лента длинная концы покровного стекла на опорной алюминиевой раме таким образом, что канал ПДМС центрирована на алюминиевой раме, а затем выпекать PDMS снова в течение 2 ч при 65 ° С.
10. Наполните СМИ Колба
Рисунок 7: Добавление средств массовой информации. Эта диаграмма показывает, как средства массовой информации должны быть вакуум-фильтрации в СМИ колбу. Это гарантирует, что носитель остается стерильным. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Сделать соответствующие средства массовой информации. Если система непрерывного культивирования будет работать в качестве хемостате, используют средства массовой информации ограничены для определенного питательного вещества.
Примечание: Примеры стандартного состава средств массовой информации для исследований с S.cerevisiae , которые были ранее опубликованы 25,= "Xref"> 26, 27, 28, 29. - Присоединить вакуумный фильтр к бутылке емкостью 100 мл, снимите крышку сосок, затем удалите белую заглушку из сосков вакуумного фильтра с стерильным пинцетом.
- Подключение к внутренним диаметром 3/16 "силиконовую трубку к соску, другой свободный трубка медиа - колбу , к вакуумному насосу (трубы 1 и 2 на рисунке 7, соответственно), а также гарантировать , что трубка , соединяющая медиа колбу для культивирования сосуд зажимают закрыть (трубки 3 на рисунке 7).
- Заполните фильтр с помощью средств массовой информации, включите вакуумный насос, а затем отфильтровать остальную часть средств массовой информации. Зажим 1/16 "ID силиконовой трубки, соединенный с вакуумом (трубы 2 на рисунке 7) и выключите вакуумный насос.
- Удалите Leurs из промежуточного сегмента 1/16 "ID трубки соединен с вакуумным насосом, так что незараженных конец трубки доступен. Вставка-йе синий конец стерильной воздушный фильтр шприца в эту трубу.
- Зажим 3/16 "ID силиконовой трубки (трубки 1 на рисунке 7) и отсоедините мужской Луер от него. Отсоедините вилку от женской Луер медиа - впускной трубы Культивирование судна. Соедините эти мужские и женские Luers для того, чтобы средства массовой информации , чтобы быть закачивают в культурального сосуда.
- Снимите вакуумный фильтр и увенчать 100 мл флакон носителя, который был присоединен к вакуум-фильтра.
- За день до культивирования сосуд будет прививали, прививают одну колонию оптогенетика микроба в пробирку с 4 мл средства массовой информации, собранных в предыдущем шаге, и пусть она расти в течение ночи при 30 ° C или оптимальной температуре роста температуры культуру в при перемешивании.
11. Сборка аппарата Вокруг микроскопа
- Установить непрерывную сборку культивирования рядом с микроскопом со средствами массовой информации колбы выше культурального сосуда и effluлор колбу ниже культурального сосуда, таким образом, что труба состоит из сегментов 0,022 "ID PTFE трубки (трубки 5 на рисунке 6) может достигать предметный столик микроскопа. Плотно лентой вниз резиновыми ограничителями на медиа - колбы и вытекающего контейнера.
- Отключите концы 0,022 "ID PTFE трубки из 1/50" ID силиконовой трубки , соединяющие их (трубку 5 на рисунке 6), и подключить эти концы в входе и выходе из микрожидкостных устройства.
- Подключите белый конец воздушного фильтра шприца аквариума насоса. Давление воздуха будет толкать носитель в культурального сосуда.
- Когда носитель достигает уровня исходящего порта, оберните 1/16 "ID медиа впускной трубы и разъемы вокруг медленного перистальтического насоса (труба 4 на рисунке 6) и 1/50" ID образца трубы на выходе и разъемы вокруг поста перистальтический насос (труба 5 на рисунке 6).
- Аэрируйте носителя путем разжим воздуха втбыть между медиа-колбы и культурального сосуда.
- Лента грелку и термометр для культивирования сосуд таким образом, чтобы его температура может регулироваться. Катушка медиа трубку вдоль культурального сосуда, так что поступающие средства массовой информации будет при той же температуре, что и сосуд.
Примечание: ШИМ тока на грелку регулируется микроконтроллер, который использует входы от термометра, чтобы сохранить для культивирования сосуд заданной температуры воды. - Вставьте сосуда для культивирования в черной пены шкафа над светодиодной матрицы, и убедитесь, что трубы не сдавлены.
- В Micro-Manager, перейдите к Plugins> биореактора Controller. Установите "соотношение медиа-насоса на" поле до 0,1 и "отношение насоса образца на" поле 0. Скорость потока будет очень низким, но больше, чем скорость испарения.
- Закрепить входящий воздушной трубки между СМИ колбу и культурального сосуда. Выньте вилку из прививка трубки (трубки 7 на рисунке
- Закройте корпус так, чтобы свет не входит, и пусть культуры растут в течение ночи.
12. откалибровать Насосные тарифы
- В Micro-Manager, перейдите к Plugins> биореактора Controller. Установите "отношение насоса носителя на" поле до 0,5 и "отношение насоса образца на" поле 0.
- Отсоедините переливную трубку из вытекающего потока колбы (трубка 8 на рисунке 6) и трубкой для отбора проб из вытекающего потока колбы (трубки 8 на рисунке 6) и собирают сточные воды в отдельных сосудах. Сбор стоков в течение 1 ч, начиная после того, как насосы в течение 15 мин.
- Рассчитывают скорость потока сред в культурального сосуда из объема собранного в емкости, как:
- Отрегулируйте значение "коэффициента насоса СМИ на" поле с помощью этой линейной оценки:
где
- Итерации через эту процедуру калибровки, пока разность между требуемым расходом и измеренной скорости потока не является <0,2 мл / ч, где скорость потока усредняется по 1-часового периода.
- Увеличение значения "соотношение образца на" поле и не калибровать его аналогичным образом до тех пор , примерно 4/5 го объема , выходящего из сосуда для культивирования , откачивают с помощью насоса для отбора проб и примерно 1/5 го объема уходит через переполнение порта.
- Пусть плотность культуры в непрерывном культивирования устройства уравновешивания в этих условиях в течение ночи.
Примечание: Если скорости целевого потока не может быть достигнуто, изменениеперистальтический насос трубки. Жидкость перекачивается с более высокой скоростью, когда используется больший диаметр трубки. Выполните шаг 14, а затем вернуться к шагу 8.4. - Отрегулируйте значение "коэффициента насоса СМИ на" поле с помощью этой линейной оценки:
13. Собирайте микроскоп Изображения культивируемыми микроорганизмами
- Заполните Stage Список Позиция в Micro-Manager с набором непересекающихся положений, в которых изображения клеток, сданной в микрожидкостных канал будет находиться в фокальной плоскости.
- Откройте плагин "Биореактор Controller". Выберите нужный курс LED времени матрица, каналов визуализации и других экспериментальных установок от подсказкам. Сбор и анализ изображений.
- Хотя эксперимент работает, убедитесь, что средства массовой информации в средствах массовой информации колбе остается прозрачным. Если это облачно, то она была загрязнена.
14. Пост-эксперимент
- Утилизировать СМИ, избыток культуры клеток и сточных вод.
- Пополняйте медиа колбу с 200 мл 20% -ного этанола, смешанного с деионизированной водой. Запуск хемостата, как это было ранеебыла запущена во время эксперимента, чтобы смыть остатки клеток и средств массовой информации.
- Когда раствор спирта сливают из средств массовой колбы, разобрать хемостата полностью.
- Мытье посуды и трубы с теплой водой и мягким моющим средством и тщательно промойте деионизированной водой. Оставьте сохнуть.
- Откройте файл "microcontrollerRecords.csv", чтобы просмотреть температуру и состояние матрицы LED над ходом эксперимента, файл "Summary.csv", чтобы просмотреть сводные данные из каждого набора изображений и "Результаты <п> .csv" файлы для просмотра данных , суммирующих каждый ROI от каждого периода времени, где п п го набора данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот аппарат был использован , чтобы стимулировать культуру S.cerevisiae , выражающую желтый флуоресцентный белок (YFP) в ответ на синего света через индуцируемого оптогенетика системы транскрипции на основе белка пары CRY2 / CIB1 30. Клетки выращивали chemostatically в фосфатном ограниченных средах со средней скоростью разбавления 0,2 ± 0,008. Фосфаты ограничение обычно используется в экспериментах S. CEREVISIAE хемостатическую контролировать скорость роста и эффекты фосфата ограничения хорошо охарактеризованы. 31, 32, 33 Стоки из непрерывно-разбавленного культурального сосуда отбирали на микрожидком устройства на инвертированный микроскоп. Изображения автоматически анализировали , как показано на рисунке 8. Отдельные клетки были идентифицированы в фоновом режиме, вычитают фазоконтрастных изображений и их YFP Concentraции оценивали по их флуоресценции, измеренная от фоновых-вычитали флуоресцентных изображений.
Флюоресцентность 169,677 клеток анализировали с 33,600 изображений, полученных из сточных вод 28 мест в микрожидком устройстве в течение 70 ч эксперимента. Мы использовали инвертированный микроскоп, оборудованный системой флуоресцентного освещения и камеры CMOS. Изображения YFP были приобретены с 500/20 нм возбуждения фильтром, фильтром 535/30 нм излучения и дихроичным T515lp. Изображения были сделаны с контрастным объективом 40X фазы при Кёлер освещении. Изображения были записаны в 16-битной глубиной цвета 87 пикселей на микрометр в квадрате. Культуру воздействию разной интенсивности синего света в течение 6 часов с интервалом, а затем в полной темноте в течение 6 часов с интервалом. Культура была выставлена на свет до первого измерения, поэтому его интенсивность флуоресценции уменьшается в течение первого периода темноты. </ Р>
На рисунке 9 показана флуоресценцию за счет производства YFP при активации оптогенетика системы в ответ на освещении сосуда для культивирования. Он демонстрирует полезность измерений одноклеточ- флуоресценции над населением измерения среднего одноклеточные выявить распределение населения интенсивности флюоресценции. Обратите внимание на выброс 42 ч 26 мин. После просмотра соответствующих изображений, было очевидно, что там были скопления клеток в большинстве изображений, используемых для генерирования составного изображения фона, в результате чего артефактами, напоминающими клетки в фоновом режиме, вычитают изображения. Кроме того, пузырь из культурального сосуда, перекачивали в микрожидкостных канала и части его края были ошибочно, как клетки с помощью алгоритма анализа изображений. Так как ни пузырь, ни артефакты вычитания фона соответствуют фактическим клеток, их измеряют интенсивность флуоресценцииниже, чем автофлуоресценции клеток. Эта цифра демонстрирует качество данных, которые могут быть автоматически приобретенную в течение 3 дней. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8: Визуальный описание алгоритма анализа изображений. Эти изображения были обрезаны и расширены для удобства просмотра. (A) Шесть изображений приобретаются для генерации фона вычитали фазового контраста изображения клеточной культуры. После того, как основное изображение приобретается, пять дополнительных изображений приобретаются с насосом отходящий дискретизации кратковременно включается между каждым приобретением, чтобы гарантировать, что клетки смещаются. Составное изображение фона генерируется из пяти составных изображений. Значение каждого пикселяна заднем плане изображения медианное значение того же пикселя через составных изображений 5. (B) Фоновое изображение вычитают затем преобразуется в двоичный код. Бинарная затем дилатационной и отверстия в пределах непрерывных сечений двоичном заполнены. Желтые контуры соответствуют выбранным регионам интереса (ROI), в зависимости от размера и округлости критериев. (C) Эти ROI отображаются на флуоресцентное изображение, где флюоресценция каждой ячейки измеряется как значение самого яркого пикселя в пределах ROI. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9: Распределение населения по интенсивности флуоресценции с течением времени. В этих подрисунки логарифм измеренного фторомотображается ценции, следуя стандартной практикой в проточной цитометрии. Линия A и B указывает на интенсивность света , поглощаемого или дифрагированного культурой, которая измеряется как разница в интенсивности между света , прошедшего через стерильные средства массовой информации и света , прошедшего через клеточную культуру в культурального сосуда. Он представлен в зависимости от второй оси ординат. (A) и усов коробка участок (5 - й процентиль, 25 - й процентиль, медиана, 75 - й процентиль, 95 - й процентиль) логарифма измеренной флуоресценции населения с течением времени. (B) 2-мерной гистограммы тех же самых данных, где цвет соответствует нормированной частоты клеток с измеренной флуоресценции в диапазоне от соответствующего бункера. Цвета были пересчитаны в диапазоне данных без выброса в 42 ч 26 мин включен. Нормированная частота выброса в самом нижнем флуоресцентной бункера0.7. (С) одномерные гистограммы логарифма измеренной флуоресценции населения до первого записанного воздействия света и после того, как наибольшего воздействия света. Это свидетельствует о том, что свет-индуцированная экспрессия YFP в этот штамм является бимодальным. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали этот аппарат с гибкостью в виду. Весь код, используемый является свободным и открытым исходным кодом. Процесс анализа изображений по умолчанию для ячеек сегмента проста и работает быстро. Пользовательский анализ может быть реализован путем записи ввод данных пользователем при анализе репрезентативной изображение с графическим пользовательским интерфейсом ФИДЖИ, преобразование входа в BeanShell сценария, а затем установить плагин для вызова скрипта. Когда он вызывается, этот сценарий будет послан массив строк под названием "образы", содержащие пути к файлам самый последний набор фоновых изображений, вычитали. Изображения и данные сохраняются как они собраны так, чтобы они не были потеряны, если эксперимент заканчивается внезапно. Синий светодиодный массив был выбран для индукции нашу оптогенетика систему, но она может быть заменена светодиодами разных цветов. Есть дополнительные входные и выходные контакты доступны на микроконтроллер, а также сквозные отверстия для дополнительного переключателя MOSFET и переключателя реле на печатной плате, которые позволяют легкоДля этой системы должна быть адаптирована для более сложных целей. Например, чтобы сделать этот аппарат работать как turbidostat, использовать дополнительные контакты микроконтроллера для питания светодиода и чтения значений от светового датчика, привязанным к культурального сосуда, а затем модифицировать программное обеспечение для измерения мутности и разбавить сосуда соответственно ,
Необходимо соблюдать осторожность, чтобы гарантировать, что культура не загрязнена, для защиты чувствительного оборудования микроскопии, а также для того, чтобы скорость потока жидкости соответствуют. Загрязнения до начала, когда культивирования сосуд намеренно заражают могут быть обнаружены путем ждать несколько дней перед заражением судна и проверки того, что нет никакого роста внутри. Для того, чтобы избежать просыпания культуры клеток на объектив микроскопа, проверьте, что Микрожидкостных устройство не будет течь по первой культуре насосная клеток через него над впитывающей тканью. Если поток средств массовой информации в культурального сосуда, противоречива, она, как правило, потому что трубка вокругРолики перистальтического насоса стала слишком свободно. Если поток воздуха из аквариума насоса противоречива, убедитесь, что нет U-образные изгибы в сточную трубу, где жидкость может бассейном и непоследовательно резиста поток воздуха. Если трубка забьется после эксперимента, потому что средства массовой информации иссяк внутри него, замочить засоренные трубы в ванне с горячей водой, чтобы растворить помеху.
Есть внутренние ограничения к этому протоколу, которые следует учитывать при планировании эксперимента или анализа результатов. В зависимости от степени разбавления и длины трубки, используемой, существует задержка примерно 10 мин, в течение которого культура клеток закачивается из культурального сосуда, в микроскоп. Таким образом, он не очень хорошо подходит к изучению событий, имевших место в течение более коротких временных масштабах. Кроме того, в то время как эксперимент может работать непрерывно в течение приблизительно десяти дней, ограничено только объемом информации, эволюция культуры клеток следует рассматривать как длительность эксперимента увеличивается. Limiтин питательных веществ в средствах массовой информации оказывает глубокое воздействие на метаболизм и экспрессии генов 35, 36, 37, 38, 39 и , следовательно , должны быть определены на основе аспекте физиологии исследуемого. При анализе результатов, изображения, особенно изображения из отдаленных точек данных, должны быть пересмотрены на предмет ошибок в способе, которым трансформирования были идентифицированы с помощью обычного анализа изображений. Вполне возможно пузыри или артефакты, чтобы быть ошибочно приняты за клетки, тем самым искажая измеряемую флуоресценцию. Один простой способ устранения таких ошибочных измерений является отбросить все трансформирования с интенсивностью флуоресценции ниже интенсивности автофлуоресценции.
Этот протокол будет полезен для измерения интенсивности флуоресценции и / или клеточную морфологию вытекающего культуры клеток в ответ на свет в организмах, которые могут расти в непрерывной культуре, установитеTLE к последовательному фокальной плоскости, когда не перемешанной, и автоматически определяются по алгоритму на основе метода анализа изображений. Алгоритм идентификации ячейки по умолчанию, используемый здесь, будет самым непосредственным образом применимо к примерно сферическим микробов, которые напоминают многообещающий дрожжей. Один из альтернативных вариантов 40 к этому протоколу является выращивание микробов в наборе периодических культурах, а затем образец одной партии для каждой временной точки и характеризуют пробу с помощью проточной цитометрии. Тем не менее, преимущества протокола, описанного здесь, что образцы, взятые из той же культуры, многие образцы могут быть приняты, и процесс автоматизирован. Этот протокол также улучшает аналогичным способом , в котором оптогенетика дрожжи непрерывно культивируют и изображается под микроскопом 34 за счет приобретения нескольких изображений быстро и не смещающий идентификацию трансформирования с помощью флуоресценции. Большим преимуществом этого протокола является то, что многие измерения отдельных клеток могут быть регулярно приобретены в течение нескольких дней withoут ввода данных пользователем. После измерения отклика микробной культуры к освещенности, следующим шагом может стать реализация в силикомарганца управления с замкнутым контуром ответа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы иметь в виду Молли Лазар и Veronica Дельгадо за помощь в тестировании протокола Киран Sweeney за полезные обсуждения и редактирования, и Тейлор Скотт, Мой Ан-adirekkun, и Стефани Геллер за критическое прочтение рукописи. Меган Николь Маклин, доктор философии держит премии Карьера в Научно-интерфейс из Wellcome Фонда Burroughs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
| Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
| Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
| Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
| Adjustable 30W 110V soldering iron - XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Mini Solder spool - 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter - 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| 0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| 10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver - MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
| 8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
| 24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
| Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
| Break Away Headers - 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
| Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
| Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
| Miniature 8x8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
| Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
| Resistor Kit - 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
| IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
| Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
| 5V 2A (2000mA) switching power supply - UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
| 12 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
| Electric Heating Pad - 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
| Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
| Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
| 9 VDC 1000mA regulated switching power adapter - UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
| High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
| Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
| FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
| Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
| Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| USB Cable A to B - 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
| bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
| Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
| Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
| Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
| 100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
| Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
| Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
| 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
| Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
| 2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
| Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
| Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
| Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
| Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
| 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
| Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
| 0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
| Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
| American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
| Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
| Microscope cover glass 22x60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
| Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |
References
- Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
- Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
- Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
- Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
- Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
- Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
- Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
- Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
- Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144 (2015).
- Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
- van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
- Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
- Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
- Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
- Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
- McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
- McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
- Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
- Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
- Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104 (2011).
- Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
- Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).
