Summary
यहाँ, हम तय कोशिकाओं में कल्पना और जालिका और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच बातचीत अंतर्जात उच्च संवेदनशीलता के साथ यों तो एक प्रक्रिया का वर्णन। प्रोटोकॉल एक माइटोकॉन्ड्रिया जुड़े झिल्ली इंटरफेस में inositol 1,4,5-triphosphate रिसेप्टर / ग्लूकोज विनियमित प्रोटीन 75 / वोल्टेज पर निर्भर आयनों चैनल / cyclophilin डी जटिल को निशाना सीटू निकटता बंधाव परख में अनुकूलित की सुविधा है।
Introduction
माइटोकांड्रिया और जालिका (ईआर) सेल में स्वतंत्र अंगों नहीं हैं, लेकिन वे संपर्क साइटों माइटोकॉन्ड्रिया जुड़े जालिका झिल्ली (एमएएम) के रूप में परिभाषित में संरचनात्मक और कार्यात्मक बातचीत। वास्तव में, MAMS क्षेत्रों में जहां ईआर की झिल्ली और माइटोकॉन्ड्रिया बारीकी apposed कर रहे हैं के अनुरूप, दोनों पक्षों से प्रोटीन के बीच बातचीत की इजाजत दी। बहरहाल, इन अंगों की झिल्लियों इन क्षेत्रों के भीतर फ्यूज नहीं है, इसलिए वे अपनी अलग संस्थाओं बनाए रखें। MAMS, माइटोकॉन्ड्रिया के लिए ईआर से एक महत्वपूर्ण (सीए 2) कैल्शियम में भूमिका और फॉस्फोलिपिड हस्तांतरण खेलने ऊर्जा चयापचय और सेल अस्तित्व 1-3 प्रभावित।
ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच सहयोग पहली इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ 1970 के दशक में कल्पना की गई थी। तब से, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 4,5, इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी 6.7 या ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया विशेष की fluorophore इम्युनो-स्थानीयकरणएस / फ्लोरोसेंट प्रोटीन 8 प्रतिष्ठित ईआर माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। एमएएम के विश्लेषण के लिए एक और उपयोगी उपकरण subcellular विभाजन के उपयोग पर आधारित है। यह अंतर ultracentrifugation एक Percoll ढाल 9 के लिए युग्मित द्वारा एमएएम अंशों के अलगाव की अनुमति देता है। हालांकि, अंतिम उत्पाद समृद्ध एमएएम भिन्न, बजाय शुद्ध अंशों में शामिल है। कुल मिलाकर, इन रणनीतियों का विशेष रूप से संवेदनशील और / या मात्रात्मक नहीं हैं, और वे आसानी से बड़ी स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। वैकल्पिक रूप से, दवा-inducible फ्लोरोसेंट अंतर-organelle linkers का उपयोग कर आनुवंशिक दृष्टिकोण में उभरा है, लेकिन वे प्रोटीन 10 की अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर पर organelle बातचीत के विश्लेषण की अनुमति नहीं है।
एमएएम 11 पर IP3R / GRP75 / VDAC परिसर के Szabadkai की खोज पर आधारित है, हम ईआर माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक विधि विकसित की है। हम सीटू निकटता ligati में इस्तेमाल कियापरख का पता लगाने और VDAC1 और IP3R1 के बीच बातचीत यों तो दो organelle-सतह प्रोटीन तय कोशिकाओं 12 में एमएएम इंटरफेस में सीए 2 -channeling परिसर में शामिल किया गया। संक्षेप में, हम बाहरी mitochondrial झिल्ली (माउस विरोधी VDAC1 प्राथमिक एंटीबॉडी) और IP3R1 ईआर झिल्ली पर (खरगोश विरोधी IP3R1 प्राथमिक एंटीबॉडी) (चित्रा 1, एक पैनल) पर VDAC1 की जांच की। फिर, परख के अनुसार, हम दोनों विरोधी माउस और विरोधी खरगोश आईजीजी (माउस और खरगोश निकटता बंधाव परख जांच) है, जो पूरक oligonucleotide एक्सटेंशन संयुग्मित हैं जोड़ा। दो लक्षित प्रोटीन 40 एनएम से नीचे दूरी पर हैं, ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स एक परिपत्र डीएनए टेम्पलेट (चित्रा 1, पैनल बी) के गठन की अनुमति देने के लिए बाद में जोड़ा कनेक्टर ओलिगोस के साथ संकरण कर सकते हैं। यह परिपत्र डीएनए अणु ligated है और प्रवर्धित, covalently निकटता जांच में से एक से जुड़ी एक एकल असहाय डीएनए उत्पाद बनाने (चित्रा 1, पैनल ग) 6, निकटता बंधाव और प्रवर्धन किया जा सकता है, बाद में पता लगाने के लिए अग्रणी टेक्सास रेड लेबल ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स जांच (चित्रा 1, पैनल डी के संकरण के कारण 10 एनएम से पर्वतमाला के बाद )। प्रत्येक फ्लोरोसेंट डॉट इस प्रकार व्यक्ति की कोशिकाओं में सीटू ईआर माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता VDAC1 / IP3R1 के बीच बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है।
चित्रा 1: द्वारा जालिका-माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत का पता लगाने के योजनाबद्ध चित्रण सीटू निकटता Ligation परख में। क) एक माउस प्राथमिक एंटीबॉडी VDAC1 और एक खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी IP3R1 के खिलाफ निर्देशित एमएएम इंटरफेस में निकटता में उनकी epitopes करने के लिए बाध्य कर सकते हैं के खिलाफ निर्देशित, ख) निकटता बंधाव जांच की एक जोड़ी के अलावामाउस और खरगोश आईजीजी के खिलाफ निर्देशित। ये जांच डीएनए किस्में है कि कनेक्टर ओलिगोस के बंधाव के लिए टेम्पलेट्स फार्म कर सकते हैं संलग्न है। ग) बंधाव के बाद गठित परिपत्र डीएनए किनारा टेक्सास रेड लेबल oligonucleotides का उपयोग कर से परिलक्षित किया जा सकता है और डी) एक फ्लोरोसेंट डॉट के रूप में माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सीटू निकटता बंधाव परख प्रयोगों में इसी प्रकार के एंटीबॉडी के GRP75 / IP3R1 जोड़ी, साथ ही cyclophilin डी (CypD) के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है / IP3R1 एंटीबॉडी, विचार है कि CypD एमएएम इंटरफेस में IP3R / GRP75 / VDAC परिसर के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया था 12-14।
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Protocol
1. समाधान की तैयारी
- पीबीएस के 14.5 मिलीलीटर में 37% formaldehyde के 5.5 मिलीलीटर गिराए द्वारा पीबीएस (कम नमक) में 10% formaldehyde तैयार करें। पीबीएस के 50 मिलीलीटर में ग्लाइसिन की 3.8 ग्राम भंग करके 1 एम ग्लाइसिन, पीएच 8.0, तैयार करें; 1x पीबीएस में 100 मिमी ग्लाइसिन प्राप्त करने के लिए इस समाधान पतला।
- 1x पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-X100 तैयार करें। 3.0 एम सोडियम क्लोराइड और 0.30 एम trisodium 25 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 7.0 के साथ एक विआयनीकृत पानी बफर में तैयार साइट्रेट का उपयोग करके 20x खारा सोडियम साइट्रेट (एसएससी) तैयार करें। 1x करने के लिए इस बफर पतला और विआयनीकृत पानी का उपयोग 0.01x।
2. कोशिकाओं का निर्धारण
नोट: हम इस अध्ययन में Huh7 हिपेटोकार्सिनोमा सेल लाइन का इस्तेमाल किया है, लेकिन इस विधि अन्य पक्षपाती सेल संस्कृतियों के लिए लागू है।
- प्लेट Huh7 कोशिकाओं (DMEM 1 जी / एल ग्लूकोज में सुसंस्कृत, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और 0.01% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन शेयर के साथ पूरक) uncoated 35 मिमी गिलास नीचे पकवान प्रति 150,000 कोशिकाओं पर। जब प्राथमिक सेल पर कामसंस्कृतियों, कोलेजन लेपित व्यंजन का उपयोग करें।
- अगले दिन, संस्कृति के माध्यम से हटा दें। पीबीएस और महाप्राण के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें। के formaldehyde 10% 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और कमरे के तापमान (आरटी) आंदोलन के तहत पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
- 1 एम ग्लाइसिन के 1 मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया बंद करो और बारी-बारी से मिश्रण। स्टॉप प्रतिक्रिया समाधान निकालें और 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो; रोटेशन और महाप्राण द्वारा आंदोलन। कोशिकाओं के लिए 100 मिमी ग्लाइसिन के 1 मिलीलीटर जोड़ें और आंदोलन के तहत आरटी पर 15 मिनट, और फिर महाप्राण के लिए उन्हें सेते हैं।
नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है और निम्न चरणों एक और दिन के लिए स्थगित किया जा सकता है। उस मामले में, 100 मिमी ग्लाइसिन के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए यदि आवश्यक हो।
3. प्रकोष्ठों के Permeabilization
- 1x पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-X100 के 1 मिलीलीटर जोड़ें, आंदोलन के तहत आरटी पर 15 मिनट, और फिर महाप्राण लिए सेते हैं। जब प्राथमिक सेल संस्कृतियों पर काम कर रहे 20 मिनट - इस ऊष्मायन समय 15 तक बढ़ाया जा सकता हैes (जैसे, प्राथमिक चूहों hepatocytes)। 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें; महाप्राण।
4. अवरुद्ध
- (किट द्वारा प्रदान की) प्रत्येक नमूने के समाधान को रोकने के 40 μl जोड़ें; इस मात्रा आदेश नमूना कवर करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। एक आर्द्रता चैम्बर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए व्यंजन सेते हैं।
- व्यंजन के बंद अवरुद्ध समाधान टैप करें। के रूप में इस reproducibility को प्रभावित करेगा, प्रत्येक स्लाइड के लिए बराबर अवशिष्ट मात्रा में प्राप्त करने के लिए प्रयास करें। चलो नमूने सूखी मत करो!
5. प्राथमिक एंटीबॉडी
- 1x पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला और व्यंजन (VDAC1 माउस एंटीबॉडी: 1/100, IP3R1 खरगोश एंटीबॉडी: 1/500) का हल जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, GRP75 या CypD एंटीबॉडी (दोनों माउस 1/500 पर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी) VDAC1 के बजाय प्रयोग किया जा सकता है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रता चैम्बर में रातोंरात सेते हैं। स्लाइड Tris बफर खारा का उपयोग दो बार 0.01% बीच (टीबीएस-टी) के साथ धोएं।
- निकटता बंधाव परख जांच किट द्वारा प्रदान की जाती हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों के अनुसार जांच के लिए चुनें।
- एंटीबॉडी मंदक में 5: दो निकटता बंधाव परख जांच 1 तैयार करें। मिश्रण आरटी पर 20 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति दें। पतला निकटता बंधाव परख जांच के समाधान जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक पूर्व गर्म आर्द्रता चैम्बर में व्यंजन सेते हैं। व्यंजन टीबीएस-टी के साथ दो बार धोएं।
7. Ligation
- सीटू पता लगाने अभिकर्मक टेक्सास लाल किट में प्रयोग करें।
- उच्च शुद्धता पानी में 5 और मिश्रण अच्छी तरह: 5x बंधाव शेयर (किट द्वारा प्रदान की) 1 पतला। 1x बंधाव समाधान (किट द्वारा प्रदान की) में ligase पतला 1:40 और भंवर। तुरंत नमूने के अलावा पहले तक ligase जोड़ने के लिए प्रतीक्षा करें।
- प्रत्येक नमूने के लिए इस समाधान (35 मिमी गिलास नीचे व्यंजनों के लिए 40 μl) एक पूर्व गर्म आर्द्रता चाम में जोड़ें और सेते स्लाइड्सदिसंबर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए। स्लाइड टीबीएस-टी के साथ दो बार धोएं।
8. प्रवर्धन
नोट: सावधान, प्रकाश के प्रति संवेदनशील अभिकर्मकों रहें।
- उच्च शुद्धता पानी में 5: 5x प्रवर्धन शेयर (किट द्वारा प्रदान की) 1 पतला। ठंड ब्लॉक का उपयोग कर फ्रीजर से पोलीमर्स निकालें (-20 डिग्री सेल्सियस)। (किट द्वारा प्रदान की) पोलीमर्स 1x प्रवर्धन समाधान और भंवर में 1:80 पतला। मिश्रण का उपयोग करने से पहले तुरंत पोलीमर्स जोड़ें।
- प्रत्येक नमूने के लिए इस समाधान (35 मिमी गिलास नीचे व्यंजनों के लिए 40 μl) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस से कम 100 मिनट के लिए एक पूर्व गर्म आर्द्रता चैम्बर में स्लाइड्स सेते हैं। स्लाइड्स के बंद प्रवर्धन-पोलीमरेज़ समाधान टैप करें।
9. अंतिम धुलाई
- 2 मिनट के लिए 1x एसएससी धोने बफर में स्लाइड्स धो लें। 2 मिनट के लिए 0.01x एसएससी धोने बफर में स्लाइड्स धो लें। व्यंजन अंधेरे में आरटी पर सूखे।
10 इमेजिंग के लिए तैयारी
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग हमारे अनुभव के आधार पर, हम सुरक्षित रूप से दृश्य और तय कोशिकाओं में ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत की मात्रा का ठहराव के लिए इस विधि की सिफारिश कर सकते हैं। Huh7 हिपेटोकार्सिनोमा सेल लाइन में सीटू निकटता बंधाव परख-कल्पना की ईआर माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत, एंटीबॉडी के कई जोड़े का उपयोग करने में की छवियों प्रतिनिधि, दिखाए जाते हैं। के रूप में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रा 2 में दिखाया गया है, प्रत्येक लाल बिंदी दो लक्षित प्रोटीन के बीच बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है, और नाभिक नीले रंग में दिखाई देते हैं। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, केवल एक प्राथमिक एंटीबॉडी के उपयोग के कोई संकेत (चित्रा 2, पैनल क) के नेतृत्व में, सीटू निकटता बंधाव परख संकेत पीढ़ी में लिए दोहरी मान्यता आवश्यकता मान्य। प्रतिष्ठित है, हम ईआर माइटोकॉन्ड्रिया एंटीबॉडी के VDAC1 / IP3R1 जोड़ी (चित्रा 2, पैनल बी) का उपयोग कर बातचीत का विश्लेषण। सीटू निकटता बंधाव परख experimen में इसी प्रकार केटीएस भी एंटीबॉडी (चित्रा 2, पैनलों सी और डी, क्रमशः) के GRP75 / IP3R1 या CypD / IP3R1 जोड़े के साथ किया जा सकता है क्योंकि GRP75 एक निगरानी एमएएम इंटरफेस 11 पर VDAC और IP3R युग्मन है और CypD के साथ बातचीत करने के लिए प्रदर्शन किया गया VDAC / GRP75 / IP3R सीए 2 जटिल 12-14 -channeling। फ्लोरोसेंट डॉट्स की मात्रा या तो बूँद-खोजक 15 या ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। के रूप में कोशिकाओं के नाभिक नीले रंग में चिह्नित कर रहे हैं, सेल प्रति ईआर माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत के quantifications प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त हैं। हम अच्छी तरह से इस परख 12 मान्य है, और हम निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि इन लक्षित प्रोटीन ईआर माइटोकॉन्ड्रिया बातचीत का अध्ययन करने के लिए अच्छा उम्मीदवार हैं।
चित्रा 2: द्वारा VDAC1 / IP3R1, GRP75 / IP3R1 और CypD / IP3R1 सहभागिता के दृश्य सीटू निकटता Ligatio मेंHuh7 प्रकोष्ठों में एन परख। सेल नाभिक नीले रंग में दिखाई देते हैं, और दो लक्षित प्रोटीन के बीच बातचीत लाल रंग में चित्रित कर रहे हैं (63x बढ़ाई; पैमाने बार = 20 माइक्रोन)। हम जानते हैं कि VDAC1, GRP75, और CypD IP3R1 के साथ बातचीत दिखा। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम है कि केवल एक प्राथमिक एंटीबॉडी लाल प्रतिदीप्ति करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है प्रदर्शित करता है। परख को मान्य करने के लिए, कई अन्य नियंत्रण को दिखाना है कि VDAC1, GRP75, और CypD अन्य ईआर प्रोटीन के साथ बातचीत नहीं करते प्रदर्शन किया गया है और IP3R1 अन्य mitochondrial प्रोटीन के साथ बातचीत नहीं करता है कि (नहीं दिखाया डेटा, रेफरी देखते हैं। 9 और 13)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Acknowledgments
हम हमारी प्रयोगशाला में सभी लोगों को जो अनुकूलन और प्रोटोकॉल को मान्य करने के लिए योगदान धन्यवाद। इस काम INSERM और राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-09-JCJC-0116 और ANR-11-BSV1-033-02) द्वारा समर्थित किया गया। ईटी उच्च शिक्षा और अनुसंधान के फ्रेंच मंत्रालय से एक शोध फैलोशिप द्वारा उसे पीएचडी के दौरान समर्थन किया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | |
| Glycine | Sigma | G-8898 | |
| Triton | Sigma | T8532 | |
| 35 mm Glass bottom culture dishes | MatTeK corporation | P35G-0-14-C | |
| Blocking solution | Sigma | DUO-92004 or DUO-92002 | provided in the Duolink PLA probes, Sigma |
| VDAC1 antibody | Abcam | ab14734 | |
| IP3R1-H80 antibody | Santa Cruz | sc28614 | |
| CypD antibody | Abcam | ab110324 | |
| Grp75 antibody | Santa Cruz | sc13967 | |
| TBS 10x | euromedex | ET220 | Dilute to obtain 1x |
| Tween 100x | euromedex | 2001-B | dilute in TBS to obtain 0,01% |
| PLA Probes Mouse MINUS | Sigma | DUO-92004 | Duolink, Sigma |
| PLA Probes Rabbit PLUS | Sigma | DUO-92002 | Duolink, Sigma |
| Duolink detection reagents red | Sigma | DUO-92008 | Duolink, Sigma |
| Ligation solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Ligase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Amplification solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Polymerase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Duolink Mounting Medium | Sigma | DUO80102 | Duolink, Sigma |
| Softwares | |||
| Blob-finder software | BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm | ||
| ImageJ software | Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | ||
References
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