Summary
Här beskriver vi ett förfarande för att visualisera och kvantifiera med hög känslighet de endogena interaktioner mellan det endoplasmatiska retiklet och mitokondrier i fixerade celler. Protokollet har en optimerad in situ närhet ligering analys med inriktning på inositol 1,4,5-trifosfat receptor / glukos-reglerad protein 75 / spänningsberoende anjon kanal / cyklofilin D komplexet vid mitokondrierna associerade membran gränssnitt.
Introduction
Mitokondrier och endoplasmatiskt retikulum (ER) inte är självständiga organeller i cellen, men de interagerar strukturellt och funktionellt vid kontaktställen som definieras som mitokondrier associerade endoplasmatiska retiklet membran (MAM). I själva verket mams motsvarar regioner där membranen i ER och mitokondrier är nära apposed, så att interaktioner mellan proteiner från båda sidor. Ändå gör membranen i dessa organeller inte smälter inom dessa områden, så att de behåller sina separata enheter. De mams spelar en avgörande roll i kalcium (Ca2 +) och fosfolipid överföring från ER till mitokondrierna, påverkar energimetabolism och cellöverlevnad 1-3.
Sambandet mellan ER och mitokondrier först visualiseras på 1970-talet med elektronmikroskopi. Sedan dess transmissionselektronmikroskopi 4,5 elektron tomografi 6,7 eller immun lokalisering av ER och mitokondrier specifika fluoroforens / fluorescerande proteiner 8 var klassiskt använts för att studera ER-mitokondrier interaktioner. En annan användbar verktyg för analys av MAM är baserad på användningen av subcellulär fraktionering. Den tillåter isolering av MAM fraktioner genom differentiell ultracentrifugering kopplad till en Percoll gradient 9. Men innehåller slutprodukten anrikade MAM fraktioner, snarare än rena fraktioner. Helt och hållet, är dessa strategier inte särskilt känsliga och / eller kvantitativ, och de är inte lätta att stora screening. Alternativt har genetiska tillvägagångssätt med läkemedels inducerbar fluorescerande interorganell linkers framkommit, men de tillåter inte analysen av organell interaktion på endogena expressionsnivåer av proteiner 10.
Baserat på Szabadkai upptäckt av IP3R / GRP75 / VDAC komplexet vid MAM 11, utvecklade vi en kvantitativ metod för att analysera ER-mitokondrier interaktioner. Vi använde in situ närhet ligatipå analys för att detektera och kvantifiera interaktioner mellan VDAC1 och IP3R1, två organell-ytproteiner som är inblandade i Ca 2 + -channeling komplexet vid MAM-gränssnittet i fixerade celler 12. I korthet sonde vi VDAC1 vid den yttre mitokondriemembranet (mus-anti-VDAC1 primär antikropp) och IP3R1 vid ER-membranet (kanin-anti-IP3R1 primär antikropp) (figur 1, fält A). Sedan, enligt analysen, tillsatte vi både anti-mus- och anti-kanin IgG (mus och kanin närhet ligering analyssonder), som är konjugerade till komplementära oligonukleotid-förlängningar. Om de två riktade proteinerna är på ett avstånd under 40 nm, kan oligonukleotiderna hybridisera med anslutnings oligos därefter tillsatta för att tillåta bildningen av en cirkulär DNA-mall (Figur 1, panel b). Detta cirkulär DNA-molekyl ligeras och förstärks, vilket skapar en enda DNA-produkt kovalent fäst till en av närhetssonder (Figur 1, panel C) 6, närhet ligering och amplifiering kan ske, vilket leder till efterföljande detektering på grund av hybridisering av Texas Red-märkta oligonukleotidprober (fig 1, panel D ). Varje fluorescerande prick representerar interaktioner mellan VDAC1 / IP3R1, vilket möjliggör kvantifiering av in situ ER-mitokondrier interaktioner i enskilda celler.
Figur 1: Schematisk illustration av detektion av det endoplasmatiska retiklet-mitokondrier interaktioner med In Situ Proximity Ligation Assay. a) En mus primär antikropp riktad mot VDAC1 och en kanin primär antikropp riktad mot IP3R1 kan binda till deras epitoper i närhet vid MAM gränssnitt, b) Tillsats av ett par av närhets ligerings proberriktat mot mus och kanin-IgG. Dessa sönder har fäst DNA-strängar som kan bilda mallar för ligeringen av anslutnings oligos. c) Det cirkulära DNA-strängen som bildas efter ligation kan förstärkas och d) visualiseras genom mikroskop som en fluorescerande prick med Texas Red-märkta oligonukleotider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Liknande in situ närhet ligerings analysexperiment kan utföras med GRP75 / IP3R1 par av antikroppar, såväl som cyklofilin D (CypD) / IP3R1 antikroppar, med tanke på att CypD visades interagera med IP3R / GRP75 / VDAC komplexet vid MAM gränssnittet 12-14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av lösningar
- Förbered 10% formaldehyd i PBS (låg salthalt) genom att späda 5,5 ml av 37% formaldehyd i 14,5 ml PBS. Förbereda en M glycin, pH 8,0, genom att lösa upp 3,8 g glycin i 50 ml PBS; Späd denna lösning för att erhålla 100 mM glycin i 1x PBS.
- Bered 0,1% Triton-X100 i 1x PBS. Förbereda 20x Saline Natriumcitrat (SSC) genom att använda 3,0 M natriumklorid och 0,30 M trinatriumcitrat framställd på ett avjoniserat vatten buffert med pH 7,0 vid 25 ° C. Späd denna buffert till 1x och 0.01x med hjälp av avjoniserat vatten.
2. Fixering av celler
OBS: Vi använde Huh7 hepatokarcinom cellinjen i denna studie, men denna metod är tillämpbar på andra adherenta cellkulturer.
- Platt Huh7-celler (odlade i DMEM 1 g / L glukos, kompletterat med 10% fetalt kalvserum och 0,01% penicillin-streptomycin lager) vid 150.000 celler per obelagd 35-mm glas-nedre skålen. När man arbetar med primärcellkulturer, använder kollagenbelagda rätter.
- Nästa dag, ta bort odlingsmediet. Tvätta cellerna med 1 ml PBS och aspirera. Fixera cellerna genom tillsats av 1 ml formaldehyd 10% och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (RT) under omrörning.
- Stoppa reaktionen med 1 ml 1 M glycin och blanda genom rotation. Avlägsna stoppreaktionslösningen och tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml 1 x PBS; agitera genom rotation och aspirera. Tillsätt 1 ml 100 mM glycin till cellerna och inkubera dem i 15 min vid RT under omrörning, och sedan aspirera.
OBS: Protokollet kan stoppas här och följande steg kan skjutas upp till en annan dag. I det fallet, tillsätt 1 ml av 100 mM glycin och hålls vid 4 ° C, om så är nödvändigt.
3. Permeabilization av celler
- Tillsätt 1 ml 0,1% Triton-X100 i 1x PBS, inkubera under 15 min vid RT under omrörning, och sedan aspirera. Denna inkubationstid kan ökas upp till 15 - 20 min när man arbetar på primärcell cultures (t.ex. primära möss hepatocyter). Tvätta cellerna genom tillsats av 1 ml 1 x PBS; aspirera.
4. Blockering
- Tillsätt 40 | il blockeringslösning till varje prov (tillhandahålls av kitet); denna volym kan höjas för att täcka provet. Inkubera rätter för 30 min vid 37 ° C i en fuktkammare.
- Tryck på blockerande lösningen bort av rätter. Försök att få lika restvolymer för varje bild, eftersom detta kommer att påverka reproducerbarhet. Låt inte proverna torka!
5. Primära antikroppar
- Späd primära antikroppar i 1x PBS och tillsätt lösningen till skålarna (VDAC1 musantikroppen: 1/100, IP3R1 kaninantikropp: 1/500). Alternativt kan GRP75 eller CypD antikroppar (både musantikroppar används vid 1/500) användas i stället för VDAC1.
- Inkubera över natten i en fuktkammare vid 4 ° C. Tvätta bilderna två gånger med Tris-buffrad saltlösning med 0,01% Tween (TBS-T).
- Proximity ligering analyssonder tillhandahålls av satsen. Välj sonder beroende på art av primära antikroppar.
- Förbered två närhetsligation assay sonder 1: 5 i antikroppsspädningsmedel. Låt blandningen stå under 20 min vid RT. Tillsätt utspädd närhet ligering analyssondlösningen. Inkubera skålarna i en förvärmd fuktkammare under 1 timme vid 37 ° C. Diska två gånger med TBS-T.
7. Ligering
- Använda in situ-detektionsreagens Texas röd kit.
- Späd 5x ligerings lager (tillhandahålls av satsen) 1: 5 i högrent vatten och blanda väl. Späd ligas i 1x ligation lösning (från satsen) 01:40 och virvel. Vänta med att lägga ligas tills omedelbart före tillsats till proven.
- Tillsätt denna lösning till varje prov (40 ul för 35 mm glasbottnade rätter) och Inkubera glasen i en förvärmd fukt chamber för 30 min vid 37 ° C. Tvätta bilderna två gånger med TBS-T.
8. Amplifiering
OBS: Var försiktig, ljuskänsliga reagens.
- Späd 5x förstärkningslager (tillhandahålls av satsen) 1: 5 i hög renhet vatten. Avlägsna polymeras från frysen med hjälp av frysning blocket (-20 ° C). Späd polymeras (från satsen) 1:80 i 1x förstärkningslösning och skaka. Tillsätt polymeras omedelbart före användning av blandningen.
- Tillsätt denna lösning till varje prov (40 ul för 35 mm glasbottnade rätter). Inkubera objektglasen i en förvärmd fuktkammare för 100 min vid 37 ° C. Tryck på Amplification-polymeras lösning av av bilderna.
9. Slut Tvätt
- Tvätta bilderna i 1 x SSC tvättningsbuffert under 2 min. Tvätta bilderna i 0.01x SSC tvättningsbuffert under 2 min. Låt disken torka vid RT i mörker.
10. Förberedelse för Imaging
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baserat på vår erfarenhet av att använda detta protokoll, kan vi säkert rekommendera denna metod för visualisering och kvantifiering av ER-mitokondrier interaktioner i fixerade celler. Representativa bilder av in situ närhet ligering analys-visualiseras ER-mitokondrier interaktioner i Huh7 hepatokarcinom cellinje, med hjälp av flera par av antikroppar, visas. Såsom visas i fig 2 genom fluorescerande mikroskopi, representerar varje red dot en interaktion mellan de två riktade proteiner och kärnor visas i blått. Som en negativ kontroll, användning av endast en primär antikropp ledde till ingen signal (figur 2, panel a), validera kravet på dubbel erkännande för in situ närhet ligering analyssignalgenerering. Klassiskt analyserar vi ER-mitokondrier interaktioner med hjälp av VDAC1 / IP3R1 par av antikroppar (figur 2, panel b). Liknande in situ närhet ligering analys experiments kan också utföras med GRP75 / IP3R1 eller CypD / IP3R1 par av antikroppar (Figur 2, paneler C och D, respektive), eftersom GRP75 är ett förkläde koppling VDAC och IP3R vid MAM-gränssnittet 11 och CypD visades att interagera med den VDAC / GRP75 / IP3R Ca 2 + -channeling komplex 12-14. Kvantifiering av fluorescerande prickar kan utföras med användning antingen Blob-finder 15 eller ImageJ programvara. När kärnorna hos cellerna är märkta i blått, kvantifieringar av ER-mitokondrier interaktioner per cell är lämplig att utföra. Vi validerade grundligt denna analys 12, och vi kan konstatera att dessa riktade proteiner är goda kandidater för att studera ER-mitokondrier interaktioner.
Figur 2: Visualisering av VDAC1 / IP3R1, GRP75 / IP3R1 och CypD / IP3R1 Interaktioner genom in situ Proximity Ligation Innehåll i Huh7 Cells. Cellkärnor visas i blått, och samspelet mellan de två riktade proteinerna avbildas i rött (63X förstoring; skala bar = 20 pm). Vi visar att VDAC1, GRP75 och CypD interagera med IP3R1. Som en negativ kontroll, visar vi att endast en primär antikropp inte leder till röd fluorescens. Att validera analysen har flera andra kontroller utförts för att visa att VDAC1, GRP75, och CypD inte interagerar med andra ER-proteiner och att IP3R1 inte interagerar med andra mitokondriella proteiner (data ej visade, se ref. 9 och 13). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar alla människor i vårt laboratorium som har bidragit till att optimera och validera protokoll. Detta arbete stöddes av INSERM och nationella forskningsinstitut (ANR-09-JCJC-0116 OCH ANR-11-BSV1-033-02). ET stöddes under sin doktorsexamen från en forskartjänst från det franska ministeriet för högre utbildning och forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | |
| Glycine | Sigma | G-8898 | |
| Triton | Sigma | T8532 | |
| 35 mm Glass bottom culture dishes | MatTeK corporation | P35G-0-14-C | |
| Blocking solution | Sigma | DUO-92004 or DUO-92002 | provided in the Duolink PLA probes, Sigma |
| VDAC1 antibody | Abcam | ab14734 | |
| IP3R1-H80 antibody | Santa Cruz | sc28614 | |
| CypD antibody | Abcam | ab110324 | |
| Grp75 antibody | Santa Cruz | sc13967 | |
| TBS 10x | euromedex | ET220 | Dilute to obtain 1x |
| Tween 100x | euromedex | 2001-B | dilute in TBS to obtain 0,01% |
| PLA Probes Mouse MINUS | Sigma | DUO-92004 | Duolink, Sigma |
| PLA Probes Rabbit PLUS | Sigma | DUO-92002 | Duolink, Sigma |
| Duolink detection reagents red | Sigma | DUO-92008 | Duolink, Sigma |
| Ligation solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Ligase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Amplification solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Polymerase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Duolink Mounting Medium | Sigma | DUO80102 | Duolink, Sigma |
| Softwares | |||
| Blob-finder software | BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm | ||
| ImageJ software | Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | ||
References
- Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
- Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
- Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
- Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169 (2012).
- Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
- Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
- Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
- Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
- Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
- Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
- Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
- Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
- De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
- Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).
