Summary
Her beskriver vi en fremgangsmåde til at visualisere og kvantificere med høj følsomhed de endogene interaktioner mellem det endoplasmatiske reticulum og mitokondrier i fikserede celler. Protokollen har en optimeret in situ nærhed ligeringsassayet målretning inositol 1,4,5-triphosphat receptor / glucose-reguleret protein 75 / spændingsafhængig anion kanal / cyclophilin D kompleks ved mitokondrierne-associerede membran interface.
Introduction
Mitokondrier og endoplasmatisk reticulum (ER) er ikke selvstændige organeller i cellen, men de interagerer strukturelt og funktionelt på kontaktsteder defineret som mitochondrier-associeret endoplasmatisk reticulum membraner (MAM). Faktisk MAMS svarer til områder, hvor membranerne af ER og mitokondrier er tæt apposed, så interaktioner mellem proteiner fra begge sider. Ikke desto mindre har de membraner disse organeller ikke smelte inden for disse regioner, så de bevarer deres selvstændige enheder. De mams spiller en afgørende rolle i calcium (Ca 2+) og phospholipid overførsel fra ER til mitokondrier, påvirker stofskiftet energi og celleoverlevelse 1-3.
Associationen mellem ER og mitokondrier blev først visualiseret i 1970'erne med elektronmikroskopi. Siden da, transmission elektronmikroskopi 4,5, elektron tomografi 6,7 eller immuno-lokalisering af ER og mitokondrier-specifikke fluorophors / fluorescerende proteiner 8 blev klassisk anvendt til at undersøge ER-mitochondrier interaktioner. Et andet nyttigt værktøj til analyse af MAM er baseret på anvendelsen af subcellulær fraktionering. Den tillader isolering af MAM fraktioner ved differentiel ultracentrifugering koblet til en Percoll-gradient 9. Imidlertid indeholder berigede MAM fraktioner, snarere end rene fraktioner, det endelige produkt. Tilsammen er disse strategier ikke særlig følsom og / eller kvantitative, og de er ikke let modtagelig for stor screening. Alternativt er genetiske metoder, der anvender lægemiddel-inducerbar fluorescerende inter-organel linkere opstået, men de tillader ikke analysen af organel interaktioner på de endogene ekspressionsniveauer af proteiner 10.
Baseret på Szabadkai opdagelse af IP3R / Grp75 / VDAC kompleks ved MAM 11, udviklede vi en kvantitativ metode til at analysere ER-mitokondrier interaktioner. Vi brugte den in situ nærhed ligatipå assay til påvisning og kvantificering af interaktioner mellem VDAC1 og IP3R1, to organel-overflade proteiner involveret i Ca2 + -channeling kompleks ved MAM grænsefladen i fikserede celler 12. Kort fortalt, vi probet VDAC1 ved den ydre mitokondrielle membran (muse-anti-VDAC1 primært antistof) og IP3R1 på ER-membranen (kanin-anti-IP3R1 primært antistof) (figur 1, panel a). Så ifølge assayet, vi tilføjet både anti-muse og anti-kanin IgG (mus og kanin nærhed ligering assayprober), som er konjugeret til komplementært oligonukleotid extensions. Hvis de to målrettede proteiner er i en afstand under 40 nm, kan oligonukleotiderne hybridisere med de senere tilføjes stik oligoer at tillade dannelse af et cirkulært DNA-template (figur 1, felt B). Denne cirkulært DNA-molekyle ligeres og forstærkes, hvilket skaber en enkeltstrenget DNA produkt covalent bundet til en af de proximity prober (figur 1, felt C) 6, kan nærhed ligering og amplifikation udføres, hvilket fører til efterfølgende påvisning på grund af hybridisering af Texas Red-mærket oligonukleotidprober (figur 1, felt D ). Hver fluorescerende prik repræsenterer interaktioner mellem VDAC1 / IP3R1, hvilket således tillader kvantificering af in situ ER-mitochondria interaktioner i individuelle celler.
Figur 1: Skematisk illustration af påvisning af endoplasmatisk reticulum-mitokondrier interaktioner ved in situ Proximity ligeringsassayet. a) En mus primært antistof rettet mod VDAC1 og et kanin-primært antistof rettet mod IP3R1 kan binde til deres epitoper i nærhed heraf på MAM interface, b) Tilsætning af et par proximity ligeringsprodukter proberrettet mod mus og kanin IgG. Disse prober har vedhæftet DNA-strenge, som kan danne skabeloner til ligering af stik oligoer. c) Den cirkulære DNA-streng dannet efter ligering kan forstærkes og d) visualiseret ved mikroskopi som en fluorescerende prik ved hjælp Texas Red-mærket oligonukleotider. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tilsvarende in situ nærhed ligeringsassayet eksperimenter kan udføres med Grp75 / IP3R1 par antistoffer, samt cyclophilin D (CypD) / IP3R1 antistoffer, i betragtning af at CypD blev vist at interagere med IP3R / Grp75 / VDAC kompleks ved MAM grænsefladen 12-14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af opløsninger
- Forbered 10% formaldehyd i PBS (lavt saltindhold) ved at fortynde 5,5 ml 37% formaldehyd i 14,5 ml PBS. Forberede 1 M glycin, pH 8,0, ved at opløse 3,8 g glycin i 50 ml PBS; fortyndes denne opløsning til opnåelse 100 mM glycin i 1X PBS.
- Forbered 0,1% Triton-X100 i 1x PBS. Forbered 20x Saline natriumcitrat (SSC) ved anvendelse af 3,0 M natriumchlorid og 0,30 M trinatriumcitrat fremstillet på en deioniseret vand puffer med pH 7,0 ved 25 ° C. Fortynd denne buffer til 1x og 0.01x hjælp demineraliseret vand.
2. Fiksering af celler
BEMÆRK: Vi brugte HuH7 hepatocarcinoma cellelinje i denne undersøgelse, men denne metode kan anvendes på andre klæbende cellekulturer.
- Plate HuH7 celler (dyrket i DMEM, 1 g / l glucose, suppleret med 10% føtalt kalveserum og 0,01% penicillin-streptomycin lager) ved 150.000 celler pr ubestrøget 35-mm glasbund skålen. Når du arbejder på primær cellekulturer, brug collagenovertrukne skåle.
- Den næste dag fjernes dyrkningsmediet. Vask cellerne med 1 ml PBS og aspireres. Fikseres cellerne ved tilsætning af 1 ml formaldehyd 10% og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) under omrøring.
- Standser reaktionen med 1 ml 1 M glycin og blandes ved rotation. Fjern stop reaktionsopløsningen og vask cellerne ved tilsætning af 1 ml 1x PBS; agitere ved rotation og aspirat. Der tilsættes 1 ml 100 mM glycin til cellerne og inkuberes dem i 15 minutter ved stuetemperatur under omrøring, og derefter aspirat.
BEMÆRK: Protokollen kan stoppes her og de følgende trin kan udskydes til en anden dag. I så fald tilsættes 1 ml 100 mM glycin og holde ved 4 ° C, hvis det er nødvendigt.
3. Permeabilisering Celler
- Der tilsættes 1 ml 0,1% Triton-X100 i 1x PBS, inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur under omrøring, og derefter aspirat. Denne inkubationstid kan øges på indtil 15 - 20 min ved arbejde på primær celle cultures (fx primære mus hepatocytter). Vask cellerne ved at tilsætte 1 ml 1x PBS; aspirat.
4. Blokering
- Tilsæt 40 pi blokeringsopløsning til hver prøve (tilvejebragt af kittet); denne mængde kan øges for at dække prøven. Inkubér skålene i 30 minutter ved 37 ° C i et fugtighedskammer.
- Tryk på blokerende opløsning ud af retterne. Prøv at opnå lige resterende mængder for hvert dias, da dette vil påvirke reproducerbarhed. Lad ikke prøverne tørre!
5. primære antistoffer
- Fortynd de primære antistoffer i 1 x PBS og tilsæt opløsningen til skålene (VDAC1 muse-antistof: 1/100, IP3R1 kaninantistof: 1/500). Alternativt kan Grp75 eller CypD antistoffer (både mus antistoffer bruges på 1/500) anvendes i stedet for VDAC1.
- Inkuber natten over i et fugtigt kammer ved 4 ° C. Vask præparatglassene to gange ved anvendelse Tris saltvand med 0,01% Tween (TBS-T).
- Proximity ligering assayprober leveres af kittet. Vælg sonder efter arten af primære antistoffer.
- Forbered to nærhed ligeringsassayet sonder 1: 5 i antistoffortyndingsmiddel. Lad blandingen henstå i 20 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt fortyndede nærhed ligeringsassayet probeopløsning. Inkubér skålene i en forvarmet fugtighedskammer i 1 time ved 37 ° C. Vaske op to gange med TBS-T.
7. Ligation
- Brug in situ påvisningsreagens Texas red kit.
- Fortynd 5x ligation lager (leveres af sættet) 1: 5 i høj renhed vand og bland godt. Fortynd ligasen i 1x ligering opløsning (tilvejebragt af kittet) 01:40 og vortex. Vent med at tilføje ligase indtil umiddelbart før tilsætning til prøverne.
- Føj denne løsning til hver prøve (40 pi for 35 mm glas-bund retter) og inkuberes dias i en forvarmet luftfugtighed chamber i 30 minutter ved 37 ° C. Vask dias to gange med TBS-T.
8. Forstærkning
BEMÆRK: Vær forsigtig, lysfølsomme reagenser.
- Fortynd 5x forstærkning lager (leveres af sættet) 1: 5 i høj renhed vand. Fjern polymerasen fra fryseren ved hjælp af frysning blok (-20 ° C). Fortynd polymerase (leveret af kittet) 1:80 i 1x forstærkning opløsning og vortex. Tilføj polymerasen umiddelbart før brug af blandingen.
- Føj denne løsning til hver prøve (40 pi for 35 mm glas-bottom retter). Glassene inkuberes tildækket i en forvarmet fugtighedskammer i 100 min ved 37 ° C. Tryk på Amplification-Polymerase løsning ud af dias.
9. Afsluttende Vask
- Vask dias i 1x SSC vaskebuffer i 2 min. Vask dias i 0.01x SSC vaskebuffer i 2 min. Lad servicet tørrer ved stuetemperatur i mørke.
10. Forberedelse til Imaging
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baseret på vores erfaring med at bruge denne protokol, kan vi trygt anbefale denne metode til visualisering og kvantificering af ER-mitokondrier interaktioner i faste celler. Repræsentative billeder af in situ nærhed ligeringsassayet-visualiseret ER-mitochondrier interaktioner i HuH7 leverkarcinom cellelinie, der anvender flere par antistoffer, er vist. Som vist i figur 2 ved fluorescerende mikroskopi, hver rød prik repræsenterer en interaktion mellem de to målrettede proteiner og kerner vises med blåt. Som en negativ kontrol, anvendelse af kun én primær antistof førte til noget signal (Figur 2, panel a), validering kravet om dobbelt anerkendelse til in situ nærhed ligeringsassayet signal generation. Klassisk analyserer vi ER-mitochondrier interaktioner vha VDAC1 / IP3R1 par antistoffer (figur 2, panel b). Tilsvarende in situ nærhed ligeringsassayet Experiments kunne også udføres med Grp75 / IP3R1 eller CypD / IP3R1 par antistoffer (figur 2, paneler c og d, henholdsvis), da Grp75 er en chaperone kobling VDAC og IP3R på MAM grænsefladen 11 og CypD blev demonstreret at interagere med den VDAC / Grp75 / IP3R Ca2 + -channeling kompleks 12-14. Kvantificering af fluorescerende prikker kan udføres ved anvendelse enten Blob-finder 15 eller ImageJ software. Som kernerne i cellerne er mærket med blåt, kvantificering af ER-mitochondrierne interaktioner per celle er egnede til at udføre. Vi valideret grundigt denne assay 12, og vi kan konkludere, at disse målrettede proteiner er gode kandidater til at studere ER-mitokondrier interaktioner.
Figur 2: Visualisering af VDAC1 / IP3R1, Grp75 / IP3R1 og CypD / IP3R1 interaktioner med In Situ Nærhed Ligation Indhold i HuH7 Cells. Cellekerner vises i blåt, og samspillet mellem de to målrettede proteiner er afbildet i rødt (63X forstørrelse, skala bar = 20 pm). Vi viser, at VDAC1, Grp75, og CypD interagere med IP3R1. Som en negativ kontrol, viser vi, at kun én primær antistof ikke fører til rød fluorescens. For at validere analysen har flere andre kontroller blevet udført for at vise, at VDAC1, Grp75, og CypD ikke interagerer med andre ER proteiner, og at IP3R1 ikke interagerer med andre mitokondrielle proteiner (data ikke vist, se ref. 9 og 13). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker alle de mennesker i vores laboratorium, der har bidraget til at optimere og validere protokollen. Dette arbejde blev støttet af INSERM og det nationale forsknings- agentur (ANR-09-JCJC-0116 OG ANR-11-BSV1-033-02). ET blev støttet under hendes ph.d. af en forskergruppe stipendium fra den franske ministerium for videregående uddannelse og forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | |
| Glycine | Sigma | G-8898 | |
| Triton | Sigma | T8532 | |
| 35 mm Glass bottom culture dishes | MatTeK corporation | P35G-0-14-C | |
| Blocking solution | Sigma | DUO-92004 or DUO-92002 | provided in the Duolink PLA probes, Sigma |
| VDAC1 antibody | Abcam | ab14734 | |
| IP3R1-H80 antibody | Santa Cruz | sc28614 | |
| CypD antibody | Abcam | ab110324 | |
| Grp75 antibody | Santa Cruz | sc13967 | |
| TBS 10x | euromedex | ET220 | Dilute to obtain 1x |
| Tween 100x | euromedex | 2001-B | dilute in TBS to obtain 0,01% |
| PLA Probes Mouse MINUS | Sigma | DUO-92004 | Duolink, Sigma |
| PLA Probes Rabbit PLUS | Sigma | DUO-92002 | Duolink, Sigma |
| Duolink detection reagents red | Sigma | DUO-92008 | Duolink, Sigma |
| Ligation solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Ligase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Amplification solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Polymerase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Duolink Mounting Medium | Sigma | DUO80102 | Duolink, Sigma |
| Softwares | |||
| Blob-finder software | BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm | ||
| ImageJ software | Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | ||
References
- Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
- Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
- Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
- Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169 (2012).
- Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
- Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
- Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
- Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
- Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
- Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
- Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
- Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
- De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
- Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).
