Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Изучение эндоплазматического ретикулума и митохондрии взаимодействий путем doi: 10.3791/54899 Published: December 10, 2016

Summary

Здесь мы опишем процедуру визуализации и количественной оценки с высокой чувствительностью эндогенные взаимодействия между эндоплазматического ретикулума и митохондрий в фиксированных клетках. Протокол оснащен оптимизированной Ситу лигирования анализа близости в ориентации инозита 1,4,5-трифосфат / белок глюкозы регулируемого рецептора 75 / зависящие от напряжения анион канала / циклофилин D комплекса на границе раздела мембраны митохондрии-ассоциированной.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Митохондрии и эндоплазматический ретикулум (ЭР) не являются независимыми органелл в клетке, но они взаимодействуют конструктивно и функционально на контактных участках, определенных в качестве митохондриальной ассоциированный эндоплазматического ретикулума мембраны (МАМ). На самом деле, MAMS соответствуют областям, где мембраны ЭР и митохондрии тесно соединенный, позволяя взаимодействия между белками с обеих сторон. Тем не менее, мембраны этих органелл не сливаться в этих регионах, поэтому они сохраняют свои отдельные объекты. В MAMS играют решающую роль в кальция (Ca 2+) и фосфолипидов перенос из ER в митохондрии, воздействуя энергетический метаболизм и выживание клеток 1-3.

Связь между ER и митохондрий впервые была визуализирована в 1970-е годы с электронной микроскопии. С тех пор, просвечивающая электронная микроскопия 4,5, электронная томография 6,7 или иммуно-локализация ER и митохондрии конкретных флуорофорас / флуоресцентные белки , 8 были классически использованы для изучения ER-митохондрии взаимодействий. Еще один полезный инструмент для анализа МАМ основан на использовании внутриклеточного фракционирования. Это позволяет изолировать МАМ фракций путем дифференциального ультрацентрифугирования , соединенного с градиентом Percoll 9. Тем не менее, конечный продукт содержит обогащенные MAM фракции, а не чистых фракций. В целом, эти стратегии не являются особенно чувствительными и / или количественный характер, и они не легко поддаются большой скрининга. В качестве альтернативы, генетические подходы , использующие наркотики индуцируемого флуоресцентных между органелл линкеры появились, но они не позволяют анализ органелл взаимодействий на эндогенные уровни экспрессии белков 10.

На основании открытия Szabadkai о комплексе IP3R / GRP75 / VDAC в МАМ 11, мы разработали количественный метод для анализа ER-митохондрии взаимодействий. Мы использовали на месте близости ligati вна анализе для выявления и количественной оценки взаимодействий между VDAC1 и IP3R1, два органелл поверхностные белки , участвующие в -channeling комплекса Са 2+ на границе раздела МАМ в фиксированных ячейках 12. Коротко говоря, мы зондировали VDAC1 на внешней мембране митохондрий (мышиное анти-VDAC1 первичного антитела) и IP3R1 на ER мембране (кроличье анти-IP3R1 первичным антителом) (рис 1, а) панели. Затем, в соответствии с анализом, мы добавили как анти-мышь и анти-кроличьего IgG (мыши и кролика Пробирной Расстояние Лигирование зонды), которые сопрягаются с комплементарными олигонуклеотидными расширений. Если две целевые белки находятся на расстоянии менее 40 нм, олигонуклеотиды могут гибридизоваться с последовательно добавляют олиго разъем для того чтобы позволить формирование шаблона круговой ДНК (рисунок 1, б) панель. Эта круговая молекула ДНК лигируют и усиливается, создавая одноцепочечной ДНК продукт , ковалентно присоединенную к одному из бесконтактными датчиками (фиг.1, панель C) 6, близость Лигирование и усиление может быть сделано, что приводит к последующему обнаружению вследствие гибридизации техасский красный-меченных зондов (рисунок 1, Панель D ). Каждая люминесцентная точка представляет взаимодействие между VDAC1 / IP3R1, что позволяет количественно оценить на месте ER-митохондрии взаимодействий в отдельных клетках.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схематическое изображение обнаружения эндоплазматического ретикулума-митохондриях взаимодействий по In Situ Пробирной Расстояние Лигирование. а) первичной мыши антитело , направленное против VDAC1 и кролика первичным антителом , направленным против IP3R1 могут связываться с их эпитопов в непосредственной близости на границе раздела МАМ, б) добавление пары зондов Расстояние Лигированиенаправленной против мыши и кролика IgG. Эти зонды прикрепили нити ДНК, которые могут образовывать шаблоны для перевязки соединителя олиго. в) Круговая нить ДНК образована после перевязки может быть усилено и d) с помощью микроскопии визуализированы в качестве флуоресцентного точки, используя техасский красный-меченных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Аналогичные эксперименты анализа Situ близость лигирования в может быть выполнена с GRP75 / IP3R1 пары антител, а также циклофилина D (CypD) / IP3R1 антитела, принимая во внимание , что CypD было показано взаимодействие с комплексом IP3R / GRP75 / VDAC на границе раздела МАМ 12-14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте 10% формальдегида в PBS (с низким содержанием соли) путем разбавления 5,5 мл 37% формальдегида в 14,5 мл PBS. Готовят 1 М глицина, рН 8,0, при растворении 3,8 г глицина в 50 мл PBS; разбавить этот раствор, чтобы получить 100 мМ глицина в 1x PBS.
  2. Готовят 0,1% Triton-X100 в 1x PBS. Готовят 20x Saline цитрат натрия (SSC) с использованием 3,0 М хлорида натрия и 0,30 М тринатрийцитрат, полученный в деионизированной воде буфере с рН 7,0 при 25 ° C. Развести этот буфер для 1x и 0.01x с использованием деионизированной воды.

2. Фиксация клеток

Примечание: Мы использовали линию клеток гепатокарцинома HuH7 в данном исследовании, но этот метод применим к другим адгезивных клеточных культур.

  1. Пластинчатые HuH7 клетки (культивированные в среде DMEM 1 г / л глюкозы, с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка и 0,01% пенициллина-стрептомицина) в наличии 150000 клеток на немелованной 35-мм со стеклянным дном блюдо. При работе на первичной ячейкекультуры, используют коллаген покрытием блюд.
  2. На следующий день, удалить культуральной среды. Вымойте клеток с 1 мл PBS и аспирата. Зафиксировать клетки, путем добавления 1 мл 10% формальдегида и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) при перемешивании.
  3. Остановить реакцию с 1 мл 1 М глицина и перемешать с помощью вращения. Удалите реакционный стоп раствор и промыть клетки путем добавления 1 мл 1x PBS; перемешивать вращением и аспирата. Добавить 1 мл 100 мМ глицина к клеткам и инкубируют их в течение 15 мин при комнатной температуре при перемешивании, а затем аспирата.
    Примечание: Протокол может быть остановлен здесь и следующие шаги могут быть перенесено на другой день. В этом случае, прибавляют 1 мл 100 мМ глицина и хранить при температуре 4 ° С, при необходимости.

3. пермеабилизирующего КЛЕТОК

  1. Добавить 1 мл 0,1% Triton-X100 в 1x PBS, инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре при перемешивании, а затем аспирата. Это время инкубации может быть увеличено до 15 - 20 мин при работе на первичной клеточной КУЛЬТУРАэс (например, первичные гепатоциты мышей). Вымойте клеток путем добавления 1 мл 1x PBS; аспирата.

4. Блокирование

  1. Добавьте 40 мкл блокирующего раствора для каждого образца (при условии, комплектом); этот объем может быть увеличен для того, чтобы покрыть образец. Инкубируйте блюда в течение 30 мин при 37 ° С во влажной камере.
  2. Нажмите блокирующую решение прочь блюд. Постарайтесь получить равные остаточные объемы для каждого слайда, так как это будет влиять на воспроизводимости. Не позволяйте образцы высохнуть!

5. Первичные антитела

  1. Развести первичных антител в 1x PBS и добавляют раствор к блюдам (VDAC1 антитела мыши: 1/100, IP3R1 кролика антитела: 1/500). В качестве альтернативы, GRP75 или CypD антитела (оба мышиные антитела, используемые в 1/500) могут быть использованы вместо VDAC1.
  2. Выдержите в течение ночи во влажной камере при 4 ° С. Вымойте слайды два раза с использованием Tris-солевом буферном растворе с 0,01% Tween (TBS-T).
  1. Пробирной Расстояние Лигирование зондов обеспечиваются комплектом. Выбор зондов в зависимости от вида первичных антител.
  2. Приготовьте два Пробирной Расстояние Лигирование зондов 1: 5 в разбавителе антитела. Разрешить смесь сидеть в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавьте разведенный близость перевязки раствора для анализа зонда. Инкубируйте блюда в камере предварительно нагретую влажности в течение 1 часа при 37 ° С. Мыть посуду два раза TBS-T.

7. Лигирование

  1. С помощью Ситу реагента обнаружения Texas красный комплект в.
  2. Развести перевязки запас 5x (поставляемый комплект) 1: 5 в воде высокой чистоты и хорошо перемешать. Развести лигазы в растворе 1х лигирования (предоставляется комплект) 1:40 и вихрь. Подождите, чтобы добавить лигазы до момента непосредственно перед добавлением к образцам.
  3. Добавьте это решение каждого образца (40 мкл для 35-мм стеклянным дном посуды) и инкубировать слайды в чам предварительно нагретой влажностиBER в течение 30 мин при температуре 37 ° С. Вымойте слайды два раза TBS-T.

8. Amplification

Примечание: Будьте осторожны, светочувствительные реагенты.

  1. Развести 5x усиления запаса (при условии, комплектом) 1: 5 в воде высокой чистоты. Удалите полимераза из морозильника использованием замораживания блока (-20 ° С). Развести полимеразы (поставляемый комплект) 1:80 в 1х растворе и усиления вихря. Добавьте полимеразу непосредственно перед использованием смеси.
  2. Добавьте это решение каждого образца (40 мкл для 35-мм стеклянным дном посуды). Инкубируйте слайдов в камере предварительно нагретую влажности в течение 100 мин при 37 ° С. Нажмите Amplification-полимеразной решение выключить из слайдов.

9. Окончательный Стиральная

  1. Вымойте слайды в 1x SSC буфером для промывки в течение 2 мин. Вымойте слайды в 0.01x SSC буфера для промывки в течение 2 мин. Пусть блюда высохнуть при комнатной температуре в темноте.

10. Подготовка к визуализации

Установите слайды, используя минимальный объем монтажной среды, содержащей DAPI (водный и не затвердевает), убедившись, что пузырьки воздуха не попадают под покровным. Лак для ногтей может быть использован для герметизации краев. Подождите примерно 15 минут до анализа с использованием флуоресценции или конфокальной микроскопии (возбуждение: 594 нм, эмиссия: 624 нм, коэффициент увеличения: 63X).
  • После того, как изображения, хранить слайды при температуре -20 ° С в темноте.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Основываясь на нашем опыте, используя этот протокол, мы можем смело рекомендовать этот метод для визуализации и количественного ER-митохондрии взаимодействий в фиксированных клетках. Типичные изображения Ситу Пробирной Расстояние Лигирование-визуализируется ER-митохондрии взаимодействий в клеточной линии HuH7 гепатокарциномой, используя несколько пар антител, показаны. Как показано на рисунке 2 с помощью флуоресцентной микроскопии, каждая красная точка представляет собой взаимодействие между двумя целевых белков и ядра отображаются синим цветом. В качестве отрицательного контроля, использование только одного первичного антитела привели к отсутствию сигнала (рисунок 2, а) панели, проверки требования двойного распознавания для анализа в генерации сигнала на месте близость лигирования. Классически, мы анализируем ER-митохондрии взаимодействий с использованием VDAC1 / IP3R1 пары антител (рисунок 2, б) панели. Подобный Ситу Пробирной Расстояние Лигирование эксперименталь вTS также может быть выполнена с GRP75 / IP3R1 или CypD / IP3R1 пар антител (рис 2, панели , в и г, соответственно), так как GRP75 является шаперонная муфта VDAC и IP3R на границе раздела МАМ 11 и CypD было продемонстрировано взаимодействие с VDAC / GRP75 / IP3R Ca 2+ -channeling сложный 12-14. Количественное люминесцентных точек может быть выполнена с использованием либо Blob-Finder 15 или программного обеспечения ImageJ. В качестве ядра клеток помечены синим цветом, количественными ЭР-митохондрии взаимодействий на клетку пригодны для выполнения. Мы тщательно проверены этот анализ 12, и мы можем сделать вывод , что эти целевые белки являются хорошими кандидатами для изучения ER-митохондрии взаимодействий.

    фигура 2
    Рисунок 2: Визуализация VDAC1 / IP3R1, GRP75 / IP3R1 и CypD / IP3R1 взаимодействий по In Situ Proximity LigatioАнализ п в HuH7 клетках. клеточных ядер отображаются синим цветом, а также взаимодействие между этими двумя целевых белков изображены красным цветом (63x увеличением; масштаб бар = 20 мкм). Покажем, что VDAC1, GRP75 и CypD взаимодействуют с IP3R1. В качестве отрицательного контроля, мы показали, что только одно первичное антитело не приводит к красной флуоресценции. Для проверки анализа, несколько других элементов управления были выполнены, чтобы продемонстрировать, что VDAC1, GRP75, и CypD не взаимодействуют с другими белками, ER и что IP3R1 не взаимодействует с другими митохондриальных белков (данные не показаны, см. 9 и 13). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Мы благодарим всех людей в нашей лаборатории, которые способствовали оптимизации и проверки протокола. Эта работа была поддержана INSERM и национальным исследовательским агентством (ANR-09-JCJC-0116 И ANR-11-BSV1-033-02). ET была поддержана во время ее PhD по научным стипендии от французского министерства высшего образования и научных исследований.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Formaldehyde Sigma F-8775
    Glycine Sigma G-8898
    Triton Sigma T8532
    35 mm Glass bottom culture dishes MatTeK corporation P35G-0-14-C
    Blocking solution Sigma DUO-92004 or DUO-92002 provided in the Duolink PLA probes, Sigma
    VDAC1 antibody Abcam ab14734
    IP3R1-H80 antibody Santa Cruz sc28614
    CypD antibody Abcam ab110324
    Grp75 antibody Santa Cruz sc13967
    TBS 10x euromedex ET220 Dilute to obtain 1x
    Tween 100x euromedex 2001-B dilute in TBS to obtain 0,01%
    PLA Probes Mouse MINUS Sigma DUO-92004 Duolink, Sigma
    PLA Probes Rabbit PLUS Sigma DUO-92002 Duolink, Sigma
    Duolink detection reagents red Sigma DUO-92008 Duolink, Sigma
    Ligation solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Ligase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Amplification solution Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Polymerase Sigma DUO-92008 Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
    Duolink Mounting Medium Sigma DUO80102 Duolink, Sigma
    Softwares
    Blob-finder software BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
    ImageJ software Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
    2. Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
    3. Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
    4. Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169 (2012).
    5. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
    6. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
    7. Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
    8. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
    9. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
    10. Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
    11. Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
    12. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
    13. Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
    14. Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
    15. Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
    16. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. (2016).
    17. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
    18. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
    19. De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
    20. Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).
    Изучение эндоплазматического ретикулума и митохондрии взаимодействий путем<em&gt; В Ситу</em&gt; Пробирной Расстояние Лигирование в Фиксированные клетки
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Tubbs, E., Rieusset, J. Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells. J. Vis. Exp. (118), e54899, doi:10.3791/54899 (2016).More

    Tubbs, E., Rieusset, J. Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells. J. Vis. Exp. (118), e54899, doi:10.3791/54899 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter