Summary
我们修改和实施描述人类诱导多能干细胞（iPS细胞）的快速，可重复，高效分化成兴奋皮层神经元12先前公布的协议。具体地讲，我们的修改允许对神经元细胞密度和使用的控制上的微电极阵列以测量在网络级电生理特性。
Abstract
从人类诱导多能干细胞来源的神经元（iPS细胞）为研究神经系统疾病有前途的新工具。在过去的十年中，用于区分人iPS细胞向神经元的许多协议已被开发出来。然而，这些协议通常具有较高的变异性，重复性低，效率低下缓慢。此外，这些协议中得到的神经元通常未成熟和缺乏无论是在单细胞和网络电平足够功能活性除非神经元是几个月中培养。部分由于这些限制，hiPSC衍生神经元网络的功能性质仍然没有得到很好的表征。在这里，我们适应最近公布的协议，说明产量从iPS细胞人的神经元的转录因子神经元素- 2 月12日被迫表达。这个协议是快速（产生3周内成熟神经元）和高效，具有transduc近100％的转换效率编细胞（> DAPI阳性细胞95％是MAP2阳性）。此外，该协议产生兴奋性神经元，将允许对神经障碍的细胞类型的具体贡献的调查的均质群体。我们通过产生稳定转导hiPSC细胞，让我们在神经元的总数显式控制修改的原始协议。然后将这些细胞用于生成微电极阵列hiPSC衍生的神经元网络。以这种方式，hiPSC衍生的神经元网络的自发电生理学活性可以测量和表征，而在细胞密度方面保持interexperimental一致性。所提出的协议是广泛适用的，尤其是对人类神经元网络的机械和药理研究。
Introduction
人类诱导多能干细胞（iPS细胞）分化的协议的发展， 在体外产生提供了用于研究神经系统疾病一个强大的新工具的人类神经元。直到最近，这些疾病的研究受到严重缺乏使用人类神经元模型系统的阻碍。虽然啮齿类动物可用于研究神经系统疾病，这些研究的结果不能容易地转换为人类1。鉴于这些限制，hiPSC衍生的神经元是可以用来阐明分子机制神经障碍和用于体外药物筛选一个有前途的替代模型。
在过去的十年中，多个协议转换人iPS细胞向神经元已经开发2-8。但是，这些协议在许多方面仍然受到限制。首先，协议通常费时：有足够的成熟产生的神经元（ 即 synap本身形成）和功能活动需要培养程序，这使得很难9大规模研究个月。此外，hiPSC到神经元的转换效率是低的。协议通常产生神经元的异质群体，并因此不允许神经元细胞的特定亚群的研究。此外，该协议是不可复制的，产生不同的结果，不同的iPSC系10,11。最后，成熟阶段，将所得神经元的功能性质也是可变的10。
为了解决这些问题，Zhang 等。 （2013）12开发的，通过过表达转录因子神经元素-2快速，可重复产生的iPS细胞的神经元人类的协议。所报告的作者，分化发生相对快速地（仅2 - 诱导神经元素-2的表达后3周），该协议是可重复的（神经元特性独立于的Starting hiPSC线），以及hiPSC到神经元的转换效率高（几乎100％）。与他们的协议产生的神经元的人口均匀（类似上层皮层神经元），允许神经元疾病的细胞类型的具体贡献进行调查。此外，它们的hiPSC衍生神经元仅20天之后显示出成熟的属性（ 例如 ，能力，以形成突触和健壮的功能活性）。
在网络层面表征hiPSC衍生神经元的电生理特性是hiPSC技术面前的一个重要的先决条件可以为人类疾病的研究中被利用。出于这个原因，许多研究小组最近开始探讨采用微电极阵列（MEA）的设备（多声道系统，Reutlingen，德国）13-16在网络级干细胞衍生的神经元。一个MEA的电极嵌在其上的神经元细胞可以培养的基板。的MEA可以用来探索神经网络和它们的活性的体外发育的电生理特性。目前，多边环境协定仅用于与需要几个月的时间来产生成熟的网络协议的分化组合。因此，具有快速分化方案相结合的多边环境协定应有助于神经系统疾病的大规模研究中使用这种技术。
这里，我们提出的Zhang 等人的修改。 （2013年）12协议，使其适用于多边环境协定中使用。特别是，而不是依赖于急性慢病毒转导，我们转而创建hiPSC线诱导分化前稳定表达rtTA / Ngn2。我们这样做主要是为了具有在神经元细胞密度重现的控制中，由于神经元细胞密度为神经网络形成的关键，并且为神经元和MEA 17,18的电极之间的良好接触。 Althoug小时张某等人。协议是非常有效的相对于转导人iPS细胞的转化，这是相对于神经元从人iPS细胞的数目的最终产率镀最初（见图2E在Zhang 等人 ）12固有的变量。凭借稳定的线路，我们消除了许多问题引起的变异，如慢病毒毒性和感染效率。然后，我们优化的可靠地生产多边环境协定hiPSC派生的神经元网络的参数，获取网络的成熟（ 如 ，涉及到广大渠道同步事件）的第三周。这种快速和可靠的协议应该使来自不同（ 即患者特异性）hiPSC线以及用于药理学研究提供健壮一致性来源的神经元之间的直接比较。
Protocol
对动物的所有实验均按照动物护理委员会，Radboud大学医学中心，荷兰，（：77073 RU-DEC-2011-021，协议号）的批准动物护理和使用指南进行。
1.胶质细胞分离和培养
注意：这里介绍的协议是基于麦卡锡的工作和德Vellis 19，以及用于小鼠星形胶质细胞非常相似的详细方案是可用的20。以从胚胎（E18）大鼠脑皮质星形细胞原代培养物，一个怀孕大鼠需要被处死，将胚需要从子宫收获，和大脑需要从胚胎中分离。为了填补一个T75烧瓶，从2胚胎的大脑皮质需要相结合。作为替代方案，可商购的纯化和冷冻星形细胞就可以买到。
- 准备T75培养瓶中
- 稀聚-D-赖氨酸（PDL）中无菌超纯水至10微克/毫升的最终浓度。加入5毫升的稀释PDL到T75培养瓶中。沙沙周围轻轻打湿整个生长表面。放置烧瓶在加湿37℃培养箱中培养3小时。
- 从烧瓶中吸出的PDL。冲洗用5ml无菌水将烧瓶3次以除去未结合的PDL。完全吸出水分。离开烧瓶干燥在层流罩或立即使用。
- 皮质的解剖
- 制备50毫升夹层介质：用2％（V / V）的B-27补充Lebovitz的L-15培养基。置于冰上。
- 在麻醉的诱导室深深异氟烷大鼠（小有机玻璃箱），直至呼吸停止（约5 - 8分钟）。从感应腔除去大鼠，并立即通过颈脱位处死。
- 喷雾的大鼠的腹部用70％乙醇和擦去多余的。揭露和经由剖腹产secti大坝切除子宫使用剪刀21。
- 剪切从他们的羊膜囊单个胚胎用剪刀，转移到无菌培养皿充满冷夹层中，并保持在冰上。
- 再次转移胚胎到一个新的，无菌6cm培养皿中充满冷夹层中。提取立体显微镜下从胚胎大脑。揭露大脑，使用镊子轻轻剥离皮肤和颅骨。轻轻舀出整个大脑，并转移到35毫米的培养皿鲜，冷夹层介质。
注意：从胚胎解剖全脑可以存储在冰上许多小时夹层介质而不丧失细胞活力。 - 通过与细尖弹簧剪刀或手术刀切割中线分隔每个大脑的两个半球。小心地剥去直细尖镊子脑膜。
注：这是彻底清除脑膜非常重要的。钍是星形胶质细胞培养成纤维细胞防止污染。成纤维细胞快速分裂的细胞，并最终将取代其他细胞。 - 取出脑/纹状体和弹簧剪刀或手术刀嗅球。另外，还要确保删除海马（C形结构，是perimedian和尾部相对于皮质）与弹簧剪刀或手术刀。收集在盛有5毫升夹层介质15毫升离心管皮质半球。置于冰上。
- 皮质的解离
- 制备2毫升的Ca 2+ / Mg 2+离子 -free Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中，用0.25％胰蛋白酶（解离培养基）。制备50mL的高葡萄糖Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）15％（体积/体积）胎牛血清（FBS）和1％（体积/体积）青霉素/链霉素（培养基）和过滤消毒。
- 让组织沉降到离心管的底部。精心为海盗尽可能多的夹层介质尽可能从组织上方。洗用5mL的Ca组织2+ / Mg 2+离子 -free的HBSS（无胰蛋白酶），并允许该组织在该管的底部沉降。
- 小心吸的HBSS。加入2毫升的解离中，轻轻一抖管混合周围组织中的酶。孵育在37℃水浴中5-10分钟。弗里克管几次孵化期间搅动组织。
- 立即磨碎使用1000微升枪头组织。设置移液器体积至约800微升。吸件和有力地喷出到管的一侧，直接在流体管线的上方。但是，尽量减少泡沫或泡沫。重复，直到组织被充分分解，约15 - 20倍。加入8毫升培养基以灭活胰蛋白酶。轻轻颠倒试管几次混匀。
- 通过放置在50μm的顶端70微米的细胞滤网通过细胞悬浮液大号离心管中。冲洗15毫升管用培养基，并通过细胞过滤网过滤介质收集在50毫升管与细胞悬浮液的介质。冲洗细胞过滤用培养基几次。冲洗后，最后的体积应为约20 - 25毫升。
- 沉淀细胞，在200×g离心10分钟。小心吸尽可能多的介质，而不触及细胞沉淀。使用1000微升吸管悬浮在1毫升培养基中的细胞。添加11毫升预热的培养基，并用10毫升吸管轻轻混匀（防止气泡）。
- 用5ml培养基冲洗PDL涂覆的T75烧瓶一次。吸出培养基，细胞悬液转移到烧瓶中。所有单元都处于悬浮液铺板，我们发现它通常不必要算来，由于星形胶质细胞不能从悬浮液中的其它细胞区别开来。将烧瓶置于加湿37℃培养箱5％的CO 2 F的气氛或两天。
- 扩张与星形胶质细胞的维护
- 替换为初始电镀后首次2天整个介质。更换整个介质之后每3天。加入到细胞之前，请务必prewarm至37℃的新鲜培养基。
注：星形胶质细胞需要7 - 10天达到约90％汇合（星形胶质细胞表现为密密麻麻镶嵌单层，与小胶质细胞和少突胶质躺在上面和混合）。 - 当星形胶质细胞达到约90％汇合，摇瓶去除污染的神经胶质细胞：
- 从孵化器中取出烧瓶，并拧紧瓶盖（酚醛）或覆盖端口（过滤）。以去除胶质，摇动烧瓶在轨道平台以180rpm 1小时。吸出网上平台。与预热5毫升培养基，吸冲洗一次，用12毫升培养基替换。
- 去除在少突胶质细胞，将烧瓶返回轨道平台和以250rpm摇动，37℃下至少7小时，但优选O / N。
- 吸出网上平台。与预热5毫升培养基，吸冲洗一次，用12毫升培养基替换。烧瓶返回到培养箱中。
- 当100％汇合时，以1:1的比率分割使用标准程序的星形细胞：3至1：2与0.05％胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）。在100％汇合一个T75烧瓶通常产生约4.0×10 6个细胞在总。根据这一时间表，文化通常可以每周一次分裂。
注意：当星形细胞达到汇合，它们可以被收集并作为在协议步骤3.4以下描述用于hiPSC分化。的星形胶质细胞可以至少一次无活力的显着损失进行分割。它们可保持在培养2个月。从以往的经验，初级胚胎18天大鼠星形胶质细胞PROGRessively成为终末分化和/或反复分裂后，丧失活力。尽管有可能冻结，以便将来使用星形胶质细胞，我们优选在需要时向星形胶质细胞从新鲜胚胎大脑隔离。
- 替换为初始电镀后首次2天整个介质。更换整个介质之后每3天。加入到细胞之前，请务必prewarm至37℃的新鲜培养基。
2.代rtTA的/ Ngn2阳性iPS细胞
注：与重编程因子cMYC的，SOX2，OCT4和KLF4人类成纤维细胞的慢病毒转导在内部生成用于我们实验的iPS细胞。
注：对于rtTA / Ngn2阳性人iPS细胞的产生，慢病毒载体用于将转基因稳定地整合到人iPS细胞的基因组中。用于生产慢病毒的协议已被先前22发布。在所提供的用于产生的rtTA和Ngn2慢病毒颗粒中的慢病毒包装载体的细节
- 板iPS细胞（1天）
注意：在此协议中提到的卷假定人iPS细胞在6孔板中培养，并且一个孔的收获细胞。另外，假设将细胞在12孔板的12孔中随后电镀。- 制备10毫升冷的DMEM / F12，用1％（体积/体积）基底膜基质（BMM），得到稀BMM。加入800μL稀释BMM每孔12孔板中。孵育至少1小时，在湿润的37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的气氛中。使用前，将培养板在RT 1小时。
- 用1％（体积/体积）青霉素/链霉素，9毫升的DMEM / F12和1mL细胞剥离溶液（CDS）至室温温暖15毫升挥发8（E8）中。补充与Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂E8网上平台。
- 吸出iPS细胞的用过的培养基的ð添加1毫升CDS的iPS细胞。孵育3 -在加湿37℃培养箱5分钟，用5％ 的 CO 2的气氛中。检查显微镜下是否所述细胞彼此分离。
- 加入2毫升的DMEM / F12中的井，轻轻暂停与1000微升吸管将细胞并将细胞转移到15毫升管中。加7毫升的DMEM / F12向细胞悬浮液中。旋转细胞在200×g离心5分钟。
- 吸出上清液，并添加制备E8介质2毫升。获得其中的人iPS细胞是通过将针对15毫升管侧的1000微升移液管的尖端，并轻轻重悬细胞解离（不形成细胞团块）的细胞悬浮液。检查显微镜细胞是否解离下。
- 确定使用血球室细胞（细胞/ mL）的数量。
注意：在80 A 6孔板- 90％汇合通常会产生3.0 - 4.0×10 6细胞总数。 - 吸气从12孔板的孔中的稀释BMM。稀释所述细胞，以获得3.0×10 4个细胞/ mL的细胞悬浮液。板1毫升每12孔板的细胞悬浮液。放置12孔板O / N在加湿37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的气氛中。
- 转导的iPS细胞与rtTA和Ngn2的慢病毒（2天）
- 温暖12毫升E8介质以1％（体积/体积）青霉素/链霉素至室温。补充与ROCK抑制剂和聚凝胺的E8介质至8微克/毫升到E8介质的最终浓度。
- 解冻慢病毒暂停等分。至8微克/毫升的终浓度添加聚凝胺至慢病毒悬浮液。吸出废培养基并添加制备E8介质到每个1毫升良好。
- 执行与不同量的rtTA的转导-和Ngn2 -lentivirus悬浮液。例如，transdu加入100μL都rtTA -lentivirus和Ngn2 -lentivirus悬挂到12孔板的一个很好的CE人iPS细胞。对于其他的井，用200μL，300μL，400μL和500μL慢病毒悬液，而不是100微升。 12孔板的两口井的人iPS细胞不应该被转导;他们将选择期间作为对照。
注：转导都是一式两份优选进行，以使转染效率可以更准确地选择开始后进行估计（见协议步骤2.2.4）。的所需有效地转导大部分人iPS细胞的慢病毒悬浮液的量取决于慢病毒悬浮液和所使用的hiPSC线的效价。在这项研究中，我们通常使用100 - 500μL慢病毒悬液转导的iPS细胞。 - 放置12孔板在加湿37℃培养箱5％的CO的气氛中2 6小时。 6小时的温育期结束之前，用1％（体积/体积）青霉素/链霉素和12温暖12毫升E8介质毫升Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）至室温。补充与ROCK抑制剂E8网上平台。
- 吸废E8网上平台。用1毫升DPBS洗涤每个孔。添加1毫升制备E8介质的每个孔中。放置12孔板O / N在加湿37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的气氛中。
- 刷新E8培养基（3天）
- 温暖12毫升E8介质以1％（体积/体积）青霉素/链霉素至室温。吸从12孔平板的孔中的用过的培养基和添加准备好的E8介质到每个1毫升良好。放置12孔板O / N在加湿37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的气氛中。
- 嘌呤霉素和G418（ - 8天4）执行选择
注：根据臀部的细胞分裂速度在选择期间，在该点的培养需要分割80％汇合 - SC线和慢病毒转导的效率，细胞可达到70。因为分裂的定时不能事先预测，它不会被在协议中提到。然而，代替清爽补充有嘌呤霉素和G418的提及浓度E8介质，可以分割hiPSC培养作为正常hiPSC培养物（含镀层的细胞上玻连蛋白包被的板）。唯一的例外是，E8媒体应辅以抗生素的浓度提到继续选择。- 温暖12毫升E8介质以1％（体积/体积）青霉素/链霉素至室温。嘌呤添加和G418的选择;不同量的抗生素在选择周期（ 表1）被添加。
- 通过估计G418-和嘌呤霉素的百分比估计转导的效率耐药细胞。估算抗性细胞的百分比，估计死细胞的不同条件下（用不同量的慢病毒悬浮液的转导的培养物）的比例（不抵抗细胞）和用于nontransduced细胞（即作为选择控制的细胞）。计算抗性细胞的百分数为[100％ - （死细胞的百分比）。
注意：如果使用不同量的慢病毒悬浮液的转导中重复进行，转导效率，可以更精确地估计。与非转导的细胞的条件作为选择控制;用于与不同量的慢病毒悬浮液的转导的培养物的死细胞的百分比应该更低。耐药细胞百分比估计是用来选择有可能为阳性两种转基因的iPS细胞。在一般情况下，我们选择从转状态的人iPS细胞均> 90％的细胞的小号生存5天选择周期。 - 吸出人iPS细胞的用过的培养基和添加准备好的E8介质向孔1毫升。放置12孔板O / N在加湿37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的气氛中。
| G418的最终浓度 | 嘌呤的最终浓度 | |
| 第4天 | 250微克/毫升 | 2微克/毫升 |
| 第5天 | 250微克/毫升 | 2微克/毫升 |
| 第6天 | 250微克/毫升 | 1微克/毫升 |
| 7天 | 250微克/毫升 | 1微克/毫升 |
| 8日 | 250微克/毫升 | 1微克/毫升 |
表1：选择期间抗生素的浓度。
- 停止选择并开始定期培养（9天和更高版本）
- 后5天选择期间，培养的rtTA / Ngn2阳性人iPS细胞作为正常人iPS细胞，不同之处在于单元的E8培养基中添加G418至50微克/ mL和嘌呤至终浓度的终浓度0.5微克/毫升。
注：细胞现在可以（根据用于细胞的冷冻保存的标准协议）被冻结以用作备份。这是该分化方案的可重复性的一个重要步骤，因为它允许许多未来分化实验中使用的同一批rtTA / Ngn2阳性人iPS细胞的。
- 后5天选择期间，培养的rtTA / Ngn2阳性人iPS细胞作为正常人iPS细胞，不同之处在于单元的E8培养基中添加G418至50微克/ mL和嘌呤至终浓度的终浓度0.5微克/毫升。
rtTA / Ngn2阳性iPS细胞神经元的6孔3.分化多边环境协定和盖玻片
注意：在这个协议中，提供了用于在两个不同的基板， 即 6孔的MEA和盖玻片中（每孔9记录和1参考嵌入式微电极的6个独立的孔组成的设备）微分rtTA / Ngn2阳性人iPS细胞的细节一个24孔板的孔中。的协议，但是，可以很容易地适应更大尺寸的基板（ 例如 ，对于12或6孔板的孔中），通过根据表面面积扩大所提到的值。
- 准备多边环境协定或盖玻片（0天和1天）
- 分化的开始的前一天，根据制造商的建议，消毒的MEA。
- 稀释粘附蛋白聚L-鸟氨酸（PLO）在无菌超纯水至最终浓度为50微克/毫升。涂层通过将100微升的6孔的MEA的有效电极面积稀释PLO的每个孔中掉落。放置盖玻片在使用无菌镊子的24孔板的孔中。添加稀释巴解组织800微升每孔。从推下来的1000微升枪头，防止漂浮的盖玻片。
- 孵育6孔的MEA和24孔平板的O / N的加湿37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的气氛中。第二天，吸出稀释PLO。灭菌超纯水洗净的6孔的MEA的玻璃表面和盖玻片两次。
- 稀释在冷的DMEM / F12粘连至20微克/毫升的终浓度（对于6孔MEA）和10微克/毫升（对于玻璃盖玻片）。立即涂层放置在每一个100微升降井的6孔的MEA的有效电极面积。同样地，在24孔板的各孔中添加400微升稀释的层粘连蛋白涂布的盖玻片。从推下来的1000微升枪头，防止漂浮的盖玻片。
- 用至少2小时的5％CO 2的气氛中孵育6孔的MEA和24孔板在加湿37℃培养箱中。
- 板iPS细胞（1天）
注：如果在步骤3.2.1中提到的卷- 3.2.4假定rtTA / Ngn2阳性人iPS细胞在6孔板中培养，并且一个孔的收获细胞。所需要的电镀细胞上的6孔的MEA和/或盖玻片的卷取决于6-孔的MEA和/或已在实验中使用的盖玻片的数目的数目;在步骤3.2.6中指定的号码 - 3.2.8允许扩展到不同的实验大小。- 温暖的DMEM / F12，CDS，用1％（体积/体积）青霉素/链霉素到R / T E8介质。添加多西环素至4微克/毫升的最终浓度和ROCK抑制剂到E8介质。
- 吸出rtTA / Ngn2阳性iPS细胞的废培养基并添加1米大号CDS的iPS细胞。孵育3 -在加湿37℃培养箱5分钟，用5％ 的 CO 2的气氛中。检查显微镜下是否所述细胞彼此分离。
- 加入2毫升的DMEM / F12中的井，轻轻暂停与1000微升吸管将细胞并将细胞转移到15毫升管中。加7毫升的DMEM / F12向细胞悬浮液中。旋转细胞在200×g离心5分钟。
- 吸出上清液，并添加制备E8介质2毫升。通过将针对15毫升管侧的1000微升移液管的尖端，并轻轻重悬细胞解离的人iPS细胞。检查显微镜细胞是否解离下。
- 确定使用血球室细胞（细胞/ mL）的数量。
注：在80的6孔板- 90％汇合通常会产生3.0 - 4.0×10 6个细胞在总。 - 吸出稀释层粘连蛋白。对于6孔的MEA，稀释所述细胞，以获得CELL悬浮液7.5×10 5个细胞/毫升。通过在6孔的MEA的各孔中加入100微升细胞悬浮液上的活性电极面积的下降板上的细胞。为盖玻片，稀释细胞，以获得4.0×10 4个细胞/ mL的细胞悬浮液。通过将细胞悬浮液至24孔板的孔中的500μL的板上的细胞。
注：上的MEA的最终细胞密度是比在盖玻片（ 图1A和B）更高。我们发现，被要求对网络活动的正确记录这个高密度。在该协议中，提供的数字，原来是最适合于测定。 - 放置6孔的MEA和24孔板在加湿37℃培养箱2小时（MEAs）中或O / N（24孔板）的5％的CO 2的氛围中。
- 2小时后，小心地添加制备E8介质500微升到6孔的MEA的每个孔中。放置-6-我们LL的MEA的O / N的加湿37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的气氛中。
- 改变介质（第2天）
- 第二天，制备的DMEM / F12，用1％（V / V）N-2补充剂，1％（体积/体积）的非必需氨基酸和1％（体积/体积）青霉素/链霉素。添加人重组神经营养因子-3（NT-3）至10毫微克/毫升，人重组脑源性神经营养因子（BDNF）至10毫微克/毫升的终浓度的终浓度，并强力霉素4微克的终浓度/毫升。温热培养基至37℃。
- 加层粘连到0.2微克/毫升的在培养基中的最终浓度。过滤形成的介质。吸从6孔的MEA的孔中的用过的培养基和24孔板并用所制备的培养基替换。孵育6孔的MEA和24孔平板的O / N的加湿37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的气氛中。
- 加入星形胶质细胞（3天）
注：如果在此协议中提到的卷假设大鼠星形胶质细胞在T75培养瓶中培养。至关重要的是，被添加到培养的大鼠星形胶质细胞的质量是好的。我们使用两个标准来检查大鼠星形胶质细胞的质量是好的。首先，大鼠星形胶质细胞的文化应该能够从老鼠胚胎的大脑中分离后十日内将增长汇合。第二，分裂鼠星形胶质细胞培养后，将大鼠星形胶质细胞应能形成一个汇合，棋盘格状单层（ 图1C）。如果大鼠星形胶质细胞的文化不符合这两个标准，我们建议不要使用这种文化的分化实验。- 温暖的0.05％胰蛋白酶EDTA到RT。 （体积/体积）青霉素/链霉素暖DPBS和DMEM / F12，用1％至37℃。
- 吸出大鼠星形胶质细胞文化的用过的培养基。加入5毫升DPBS冲洗培养和周围轻轻沙沙它。
- Aspir吃了DPBS加入5毫升0.05％胰蛋白酶EDTA。周围轻轻沙沙的胰蛋白酶EDTA。孵育在加湿37℃培养箱与5的5％CO 2的气氛- 10分钟。
- 检查显微镜细胞是否被分离之下。通过敲击烧瓶几次分离的最后一个单元格。
- 加入5毫升的DMEM / F12的烧瓶中。轻轻磨碎，用10毫升吸管将烧瓶内部的细胞。收集在15毫升管中的细胞悬浮液。旋管中，在200×g离心8分钟。
- 吸出上清液并悬浮细胞在1mL的DMEM / F12的。确定使用血球室细胞（细胞/ mL）的数量。
- 每增加6孔多边环境协定以及7.5×10 4星形胶质细胞。添加每24孔板的2.0×10 4个星形胶质细胞。孵化的MEA和24孔板O / N在加湿37℃培养箱，用5％ 的 CO 2的气氛中。
- 改变介质（第4天）
- 过滤器至37℃，介质和温暖。吸从6孔的MEA的孔中的用过的培养基和24孔板并用所制备的培养基替换。保持在湿润的37℃培养箱中在6孔的MEA和24孔板，用5％ 的 CO 2的气氛中。
注：从第6天开始，刷新一半每两天介质。从开始第10天，该培养基中添加胎牛血清支持星形细胞生存能力。
- 制备的Neurobasal介质用2％（V / V）的B-27补充，1％（V / V）L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和1％（体积/体积）青霉素/链霉素。添加的NT-3至10毫微克/毫升，BDNF的终浓度至10毫微克/毫升，和多西环素的终浓度为4微克/毫升的最终浓度。第10天起，还用2.5％（体积/体积）FBS补充培养基。过滤器至37℃，产生的中和温暖。
- 从6孔的MEA的孔中，并用1000微升吸管24孔板除去一半的用过的培养基中，用所制备的培养基替换。保持在湿润的37℃培养箱中在6孔的MEA和24孔板，用5％ 的 CO 2的气氛中。
4.建立hiPSC衍生神经元的神经电生理简介
注：两到三周后，中分化元币种，所述hiPSC衍生的神经元，可用于不同的下游分析。在本节中，给出了一些下游分析的实例可以执行以建立hiPSC衍生的神经元的神经生理学轮廓。
- 使用特点的多边环境协定的神经网络活动
- 记录20分钟的多边环境协定培养hiPSC派生的神经元的电活动。在记录时，保持在37℃的温度，并防止介质的蒸发和pH值的变化由充气加湿气体（5％CO 2，20％O 2，75％N 2）的一个常数，缓慢流动到MEA 。
- 1200X放大（MEA 1060，MCS）后，在使用的MCS数据采集卡在10kHz采样该信号。分析使用自定义软件包23中的数据（峰值和突发检测）。
- 表征单细胞电生理活动
- 转移含有hiPSC派生的神经元文化为淹没固定级录音室盖玻片在直立显微镜。记录20分钟的自发动作电位诱发突触后电流（sEPSC）24。通过检测程序神经科学突触事件。
- 固定和染色hiPSC衍生神经元MAP2，突触-1/2和PSD-95 22，24，25。量化使用图像分析软件突触-1/2和PSD-95泪点的数目。
Representative Results
在这里，我们已经成功地修改了其中iPS细胞是通过过表达转录因子神经元素-2 12直接分化成皮层神经元的协议，我们已经适应它的使用多边环境协定。这种方法是快速和有效的使我们能够分化诱导后在第三周获得官能神经元和网络活动已经。
在该分化方案的过程中，细胞形态开始类似于神经元：形成小的流程和神经元开始彼此连接（ 图1A）。我们建立了从健康控制hiPSC源性神经元的神经生理学配置文件，通过在开发过程中测量它们的神经元形态和突触的属性。 hiPSC衍生神经元开始后不同天染色MAP2和突触-1/2分化（ 图2A）的。衍生的神经元分化的诱导3周后显示出成熟神经元形态已经。基于突触-1/2免疫组织化学染色突触-1/2泪点（为突触的数量的度量）的数量进行定量。突触-1/2泪点的数量随时间而增加，这表明神经元的连接的电平也增加（ 图2B）。分化诱导23天后突触-1/2泪点的数目是在两个独立的IPS线（ 图2C）类似。在23 DIV最synapsin1 / 2泪点分别并列PSD-95泪点，其表示为功能性突触（ 图2D）。
由Zhang 等人所描述的结果一致，我们产生了人口兴奋上层皮层神经元的，由特定的亚型泛神经元和皮质米确认 arkers如BRN2和SATB2（层II / III）。我们没有观察到阳性的深层神经元CTIP2（第五层）或FOXP2（第六层）（ 图2E和F）的神经元
表征hiPSC衍生神经元的电生理学活性，我们使用全细胞电流和电压钳记录， 即内在特性和兴奋性输入到这些神经元发育过程中进行测定。神经元能够分化和扣球细胞的百分比的随时间（ 图2G和H）增加后，以产生动作电位已经一周。此外，神经元一周接收已经兴奋性突触输入分化诱导后：兴奋性突触输入的频率和振幅在开发过程中增加（ 图2I - K）。
NT“FO：保together.within页=”1“>为了更好地理解单细胞的活性结合，形成网络级的功能，来研究神经元的演唱会是如何工作是必不可少的多边环境协定体外神经元网络培养。构成了一个宝贵的实验模型，为研究神经元的动态。我们的分化诱导后记录从健康控制hiPSC线培养来源的神经元的电网络活动的20分钟的6孔多边环境协定（ 图2M）。几周之后，神经元从健康控制iPS细胞衍生形成功能活跃神经元网络，显示自发事件（0.62±0.05穗/秒; 图2N）。（ 即后16天分化的开始），在这个发展阶段涉及的所有通道没有同步事件。的被检测的MEA（ 图20）的网络活动的水平的发展过程中增加了：在t后第四周他诱导分化的神经元网络显示自发性活动高电平;在该装置的所有孔中（2.5±0.1穗/秒图2N）。该网络还展出了同步网络暴（4.1±0.1爆裂/分钟， 图20），持续时间长（2 100±500毫秒）。
图1：hiPSC 分化为神经元。 iPS细胞分化A.三个时间点变成盖玻片上的神经元。 iPS细胞的多边环境协议B.电镀。 C.星形胶质细胞在T75烧瓶中100％汇合（注意该细胞形成一个棋盘格状的单层）。比例尺：150微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. hiPSC派生的神经元表征。 答 hiPSC衍生神经元分化开始后染色MAP2（绿色）和在不同的日子突触-1/2（红色）。比例尺：10微米。 B.在两个独立实验突触泪点的量化。在每个实验中至少10个细胞进行分析。 C.在DIV23在来自两个独立的IPS线来源的神经元突触泪点的量化。 D. hiPSC衍生神经元染色的PSD-95（绿色）和分化开始后突触-1/2（红色）23天。突触泪点并列到PSD-95泪点。 E. hiPSC衍生神经元染色MAP2（绿色）和BRN2（红色）或SATB2（红色）分化开始后23 D。 F. MAP2阳性细胞的百分比为阳性表示标记。 G.代表当前钳记录表示动作电位可以早分化开始后第7天产生。在分化诱导后不同日期，显示一个或多个动作电位细胞的百分比H.。 一，分化后不同天hiPSC派生的神经元兴奋性接受性突触后电流（EPSCS）的代表痕迹。在开发过程中兴奋性突触后电流的频率杂志 。在开发过程中兴奋性突触后电流的幅值K.。 EPSC录音L.代表迹线无（对照），并与CNQX（CNQX）。从一个hiPSC系衍生分枝神经元分别在6孔的MEA培养和网络活动示出了用于hiPSC衍生神经元网络16和分化诱导后23 D。从记录的活动（记录的20分钟的5分钟中示出），每个孔（10千赫的采样率）表示用不同的颜色。 N.射击速度16和分化诱导后23 D。 O.破裂率16和分化诱导后23 D。 请点击此处查看该图的放大版本。
给出的结果，所得到的hiPSC衍生的神经元的质量可以通过使细胞的神经生理信息进行评估。即，分化，形态，突触-1/2的表达和神经元的电生理学的开始可以评估后三至四个星期。在该时间点，所述hiPSC衍生的神经元预计将显示一个神经元样形态，是MAP2，突触/ PSD-95阳性执行时免疫细胞化学，并且exhibi吨自发电生理活动（无论是在单细胞和网络电平）。
Discussion
在这里，我们已经实现了由张等人发表了高效的hiPSC分化协议。 （2013年）12用于测量多边环境协定hiPSC衍生神经元网络的网络活动。我们通过创建诱导神经元分化之前rtTA / Ngn2阳性hiPSC线调整原来的协议。此附加的步骤使我们能够控制在MEA的神经元细胞密度。控制了神经元密度是一个重要的先决条件适应协议的MEA和确保一致性。来测量使用的MEA的神经元网络的活性，神经元需要以形成直接在MEA电极17,18的顶端密集网络。这必然需要在神经元的铺板密度严密控制。该rtTA / Ngn2阳性hiPSC线实现了神经元密度，因为这种战术不依赖于人iPS细胞分化前急性慢病毒转导的控制;因此rtTA / Ngn2阳性hiPSC线几乎消除在最终产率的任何变化，由于，例如，慢病毒毒性和可变感染效率。
的实验步骤的另一关键步骤是大鼠星形胶质细胞被共培养与分化人iPS细胞的数目。星形胶质细胞积极推动通过控制突触的形成，维护和消除，所有这些都是神经元功能的重要过程开发的神经回路的细化。本文提出的协议是高度星形胶质细胞依赖性：充分成熟，形成功能性突触，神经元需要从星形胶质细胞的支持。我们经历星形胶质细胞的数量应大致等于hiPSC衍生神经元的数目，以支持神经元的成熟和表现出自发性活动的神经元网络的形成。由于我们的星形胶质细胞的协议收益率原代细胞的小路具有有限寿命Tures的，大鼠星形胶质细胞的分离，必须定期进行。
我们由张等人公布了协议的适配。 （2013年）12与MEA技术的使用可能会显著提高我们的学习hiPSC衍生的网络的网络活动的能力。此前，用于研究hiPSC派生的神经元网络与多边环境协议依靠耗时分化过程13-16。从张某等人的协议。 （2013）提供了一种快速的替代，并且提供了修改删除变异性的来源，这使得它现在更可行使用hiPSC衍生的神经元结合的MEA的技术，尤其是在高通量或药理学研究。另外，由于由Zhang 等人公布的方法。 （2013年）12得到上层皮层神经元的同质人口，我们的改编协议成为可能重点研究进入网络这种特殊神经元的子集ctivity。
尽管如此，这种方法也有一些限制。首先，将培养的均一性也可被认为是一个缺点，因为培养的可能性较小体内网络中，不同类的神经元（ 即抑制性和兴奋性神经元）构成的非均相网络类似于。为了进一步提高使用具有MEA技术hiPSC衍生的神经元，这将是重要的，以开发其他的神经元细胞群快速（基于转基因-）分化协议。如果协议变得可用， 在体外网络将更加紧密地模拟体内网络。第二，目前大鼠星形胶质细胞必须被添加到生长的支持hiPSC衍生的神经元，因此，引起的神经元网络不是人类神经网络狭义。可靠的协议，在未来的溶胶人iPS细胞分化成星形胶质细胞可能已经这个问题26。第三，二维神经元网络，如这里描述的，可用于研究复杂的三维体内神经元网络有限模型。幸运的是，描述的大鼠原代神经元的三维培养物中结合MEA技术协议已经可用27,28。前瞻性，用于获得hiPSC衍生神经元和星形胶质细胞的三维培养技术和MEA技术迅速分化协议的组合应提供新颖的洞察的生物学机制底层神经障碍。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lebovitz's L-15 medium | Gibco | 11415-064 | |
| B-27 supplement | Gibco | 0080085SA | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Ca2+/Mg2+-free HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| High-glucose DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| psPAX2 lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12259 | |
| Basement membrane matrix | Gibco | A1413201 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| E8 medium | Gibco | A1517001 | |
| ROCK inhibitor | Gibco | A2644501 | Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-5G | |
| G418 | Sigma-Aldrich | G8168-10ML | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| Vitronectin | Gibco | A14700 | |
| 6-well MEAs | Multi Channel Systems | 60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr | |
| Glass coverslips | VWR | 631-0899 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655-10MG | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891-5G | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| NT-3, human recombinant | Promokine | C66425 | |
| BDNF, human recombinant | Promokine | C66212 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| L-alanyl-L-glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768-100MG | |
| Straight fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251 | |
| Fine-tipped spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. Studying human disease using human neurons. Brain Res. , (2016).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Wu, H., et al. Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture. J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).
- Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Sci Rep. 6, 26181 (2016).
- Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Front Neurosci. 10, (2016).
- Heikkila, T. J., et al. Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro. Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).
- Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays. Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).
- Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces. J Neural Eng. 9 (2), (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079 (2013).
- Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J Vis Exp. (63), e3965 (2012).
- Ba, W., et al. ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function. Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).
- Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer. Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).
- Ba, W., et al. TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function. Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).
- Benevento, M., et al. Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling. Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci Rep. 4, 5489 (2014).
- Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model. J Vis Exp. (104), e53080 (2015).
