Summary
Vi ændre og gennemføre en tidligere offentliggjort protokol beskriver hurtig, reproducerbar og effektiv differentiering af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) i excitatoriske kortikale neuroner 12. Specifikt vores modifikation giver mulighed for kontrol af neuronal celletæthed og brug på mikroelektrode-arrays til at måle elektrofysiologiske egenskaber på netværksniveau.
Abstract
Neuroner fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) give en lovende nyt værktøj til at studere neurologiske lidelser. I det seneste årti er mange protokoller til differentiering hiPSCs til neuroner blevet udviklet. Men disse protokoller ofte er langsom med høj variabilitet, lav reproducerbarhed og lav effektivitet. Desuden opnået med disse protokoller neuroner er ofte umodne og mangler tilstrækkelig funktionel aktivitet både på de encellede og netniveau medmindre neuroner dyrkes i flere måneder. Delvist på grund af disse begrænsninger, de funktionelle egenskaber af hiPSC-afledte neuronale netværk er stadig ikke godt karakteriseret. Her, vi tilpasse et nyligt offentliggjort protokol, der beskriver produktion af humane neuroner fra hiPSCs ved tvungen ekspression af transkriptionsfaktoren neurogenin-2 12. Denne protokol er hurtig (giver modne neuroner indenfor 3 uger) og effektiv, med næsten 100% konverteringseffektivitet TRANSDed celler (> 95% af DAPI-positive celler er MAP2 positiv). Endvidere protokollen giver en homogen population af excitatoriske neuroner, der ville tillade undersøgelsen af celletype-specifikke bidrag til neurologiske lidelser. Vi ændrede den oprindelige protokol ved at generere stabilt transducerede hiPSC celler, hvilket giver os eksplicit kontrol over det samlede antal neuroner. Disse celler anvendes derefter til at generere hiPSC-afledte neuronale netværk på mikroelektrode-arrays. På denne måde kan den spontane elektrofysiologisk aktivitet af hiPSC-afledte neuronale netværk måles og karakteriseret, og samtidig bevare interexperimental konsistens med hensyn til celledensitet. Den præsenterede protokol er bredt anvendelig, især for mekanistiske og farmakologiske undersøgelser på humane neurale netværk.
Introduction
Udviklingen af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) differentiering protokoller til at generere menneskelige neuroner in vitro har givet et kraftfuldt nyt værktøj til at studere neurologiske lidelser. Indtil for nylig blev undersøgelsen af disse lidelser alvorligt hæmmet af manglen på modelsystemer med humane neuroner. Selvom gnavere kan bruges til at studere neurologiske lidelser, kan resultaterne af sådanne undersøgelser ikke oversættes let til mennesker 1. I betragtning af disse begrænsninger hiPSC-afledte neuroner er et lovende alternativ model, der kan bruges til at belyse molekylære mekanismer underliggende neurologiske lidelser og til in vitro drug screening.
I det seneste årti, at adskillige protokoller konvertere hiPSCs til neuroner er blevet udviklet 2-8. Imidlertid er disse protokoller stadig begrænset på mange måder. Først, protokollerne er ofte tidskrævende: generere neuroner med tilstrækkelig modning (dvs. synapse dannelse) og funktionel aktivitet kræver måneders dyrkning procedurer, hvilket gør store studier vanskelige 9. Desuden hiPSC-til-neuron virkningsgraden er lav. Protokoller udbytte ofte en heterogen population af neuroner, og dermed tillader ikke at undersøge specifikke undergrupper af neuronale celler. Desuden protokollerne ikke er reproducerbare, hvilket giver forskellige resultater for forskellige IPSC linjer 10,11. Endelig modning scenen og funktionelle egenskaber af de resulterende neuroner er også variable 10.
For at løse disse problemer, Zhang et al. (2013) 12 udviklet en protokol, der hurtigt og reproducerbart genererer menneskelige neuroner fra hiPSCs ved overekspression transskription faktor neurogenin-2. Som rapporteret af forfatterne, differentiering sker relativt hurtigt (kun 2 - 3 i uger efter induktion af ekspression af neurogenin-2), protokollen er reproducerbar (neuronale egenskaber er uafhængige af de starting hiPSC linje), og den hiPSC-til-neuron konvertering er meget effektiv (næsten 100%). Populationen af neuroner genereret med deres protokol er homogen (ligner øvre lag corticale neuroner), hvilket tillader undersøgelse af celletype-specifikke bidrag til neuronale lidelser. Desuden deres hiPSC-afledte neuroner udviste modne egenskaber (f.eks, at evnen danne synapser og robust funktionel aktivitet) efter kun 20 d.
Karakterisere de elektrofysiologiske egenskaber af hiPSC-afledte neuroner på netværksniveau er en vigtig forudsætning for hiPSC teknologi kan udnyttes til studiet af sygdomme hos mennesker. Af denne grund har mange forskergrupper nylig begyndt at undersøge stamcelle-afledte neuroner på netværksplan bruger mikro-elektrode array (MEA) enheder (Multikanal Systems, Reutlingen, Tyskland) 13-16. Elektroderne på MEA er indlejret i et substrat, hvorpå neuronale celler kan dyrkes.MEA kan anvendes til at udforske de elektrofysiologiske egenskaber af neuronale netværk og in vitro udviklingen af deres aktivitet. I øjeblikket er MMA kun anvendes i kombination med differentieringsfaktorer protokoller, der tager flere måneder for at give modne net. Derfor kombinerer MMA med en hurtig differentiering protokol bør lette anvendelsen af denne teknologi i store studier af neurologiske lidelser.
Her præsenteres en modifikation af Zhang et al. (2013) 12 protokol og tilpasse den til brug på multilaterale miljøaftaler. Især snarere end at lægge en akut lentiviral transduktion, vi i stedet skabte hiPSC linjer stabilt udtrykker rtTA / Ngn2 før fremkalde differentiering. Vi gjorde dette primært at have reproducerbare kontrol over den neuronale celletæthed, idet den neuronale celletæthed er kritisk for neuronal netværksdannelse, og med god kontakt mellem neuroner og elektroderne på MEA 17,18. although Zhang et al. protokollen er meget effektiv med hensyn til omdannelse af transducerede hiPSCs, er det ifølge sagens natur variabel med hensyn til den endelige udbytte af neuroner fra antallet af hiPSCs forgyldt oprindeligt (se figur 2E i Zhang et al.) 12. Med en stabil linje, fjerne vi mange spørgsmål forårsager variabilitet, såsom lentiviral toksicitet og infektion effektivitet. Vi derefter optimeret de parametre, der pålideligt producerer hiPSC-afledte neuronale netværk på multilaterale miljøaftaler, opnåelse netværk modning (fx synkrone begivenheder, der involverer et flertal af kanaler) ved den tredje uge. Denne hurtige og pålidelige protokol skulle gøre det muligt direkte sammenligninger mellem neuroner afledt af forskellige (dvs. patient-specifikke) hiPSC linjer samt give robust konsistens for farmakologiske undersøgelser.
Protocol
Alle eksperimenter på dyr blev udført i overensstemmelse med de godkendte dyr pleje og brug retningslinjerne fra Animal Care udvalget, Radboud University Medical Center, Holland, (RU Dec 2011-021, protokol nummer: 77073).
1. Glia Cell Isolation og Kultur
BEMÆRK: Protokollen præsenteres her, er baseret på arbejdet i McCarthy og de Vellis 19, og en meget lignende detaljeret protokol for mus astrocytter er tilgængelig 20. For at generere primære kulturer af kortikale astrocytter fra embryonale (E18) rotte hjerner, skal ofret en gravid rotte, behøver de embryoner, der skal høstes fra livmoderen, og hjerne har brug for at være isoleret fra embryoner. For at fylde en T75 kolbe, de cortex fra 2 embryonale hjerner skal kombineres. Som et alternativ, kan kommercielt tilgængelige oprensede og frosne astrocytter købes.
- Forbered T75 kultur kolbe
- Fortynd Poly-D-Lysin (PDL) isterilt, ultrarent vand til en slutkoncentration på 10 ug / ml. Der tilsættes 5 ml fortyndet PDL til T75 kultur kolben. Swish rundt forsigtigt for at væde hele vækst overfladen. Kolben anbringes i en befugtet 37 ° C inkubator i 3 timer.
- Sug PDL fra kolben. Kolben skylles 3 gange med 5 ml sterilt vand for at fjerne ubundet PDL. Aspirer vandet fuldstændigt. Kolben at tørre i en laminar flow hætte eller anvendt øjeblikkeligt.
- Dissektion af cortex
- Forbered 50 ml dissektion medium: Lebovitz L-15-medium med 2% (v / v) B-27 supplement. Hold på is.
- Bedøver rotten dybt med isofluran i en induktion kammer (små plexiglas boks) indtil respiration ophører (~ 5-8 min). Fjern rotte fra induktion kammeret og straks aflivet ved cervikal dislokation.
- Spray maven af rotten med 70% EtOH og tørre det overskydende. Afsløre og fjerne livmoderen fra dæmningen via kejsersnit sectiom brug en saks 21.
- Skær individuelle embryoner fra deres fostervand sække med en saks, overførsel til en steril petriskål fyldt med koldt dissektion medium, og holde på is.
- Overfør embryoner igen til en ny, steril 6 cm petriskål fyldt med koldt dissektion medium. Uddrag hjerner fra embryonerne under et stereomikroskop. At udsætte hjernen, blidt skræl væk huden og kraniet med en pincet. Forsigtigt øse ud hele hjernen og overførsel til en 35 mm petriskål med frisk, koldt dissektion medium.
BEMÆRK: Hele hjerner dissekeret fra embryoner kan opbevares i dissektionsmedium på is i mange timer uden at miste cellulær levedygtighed. - Adskil de to halvdele af hver hjerne ved at skære gennem midterlinjen med spids fjeder saks eller en skalpel. Forsigtigt strip off meninges med lige fin spids pincet.
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at fjerne meninges fuldstændigt. ther forhindrer fibroblast kontaminering af astrocyt kultur. Fibroblaster hurtigt delende celler og til sidst vil forskyde de andre celler. - Fjern midthjernen / striatum og lugtekolben med fjeder saks eller en skalpel. Sørg også for at fjerne hippocampus (C-formet struktur, der er perimedian og kaudalt i forhold til cortex) med fjeder saks eller en skalpel. Indsamle de kortikale halvkugler i et 15 ml centrifugerør fyldt med 5 ml dissektion medium. Hold på is.
- Dissociation af cortex
- Forbered 2 ml Ca2 + / Mg2 + -fri Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med 0,25% trypsin (dissociation medium). Forbered 50 ml høj glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 15% (v / v) kalvefosterserum (FBS) og 1% (v / v) penicillin / streptomycin (dyrkningsmedium) og Filtersteriliser.
- Lad vævet sedimentere til bunden af centrifugerøret. omhyggeligt sompirat så meget af dissektion medium som muligt fra oven vævet. Vask vævet med 5 ml Ca2 + / Mg2 + -fri HBSS (uden trypsin) og tillade vævet at afvikle på bunden af røret.
- aspireres forsigtigt HBSS. Tilsæt 2 ml dissociation medium og bladre røret forsigtigt for at blande enzymet omkring vævet. Inkuber i et 37 ° C vandbad i 5-10 min. Svippe røret et par gange under inkubation for at agitere vævet.
- Umiddelbart tritureres vævet ved anvendelse af en 1.000 pi pipettespids. Indstil pipette volumen til omkring 800 uL. Aspirere stykkerne og kortet springe på siden af røret, direkte over fluidledningen. Men prøv at minimere bobler eller skum. Gentag, indtil vævet er tilstrækkeligt dissocieres, omkring 15 - 20x. Tilsæt 8 ml dyrkningsmedium til inaktivering af trypsin. Bland forsigtigt ved at vende røret flere gange.
- Pass cellesuspensionen gennem en 70 um cellefilter placeret på toppen af en 50 mL centrifugerør. Skyl 15 ml rør med dyrkningsmedium og foretage medium gennem cellesigte at indsamle mediet i 50 ml rør med cellesuspensionen. Skyl cellesigte et par gange med dyrkningsmedium. Efter skylning bør det endelige volumen være i 20 - 25 ml.
- Pelletere cellerne ved 200 xg i 10 min. aspirere omhyggeligt så meget medium som muligt, uden at røre cellepelleten. Resuspender cellerne i 1 ml dyrkningsmedium under anvendelse af en pi pipette 1000. Tilføj 11 ml forvarmet dyrkningsmedium og blandes forsigtigt (for at undgå bobler) ved anvendelse af en 10 ml pipette.
- PDL-overtrukne T75 kolbe skylles en gang med 5 ml dyrkningsmedium. Aspirer medium og overføre cellesuspensionen til kolben. Alle celler i suspensionen udplades, og vi finder det i almindelighed unødvendigt at tælle dem, da astrocytter ikke kan skelnes fra andre celler i suspensionen. Kolben anbringes i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 feller to dage.
- Udvidelse og vedligeholdelse af astrocytter
- Udskifte hele medium for den første gang 2 d efter indledende udpladning. Udskift hele medium bagefter hver 3 d. Altid Forvarm frisk medium til 37 ° C før tilsætning til cellerne.
BEMÆRK: astrocytter kræver 7-10 d for at nå ca. 90% sammenflydning (astrocytterne fremstå som en tæt pakket tessellated monolag, med mikroglia og oligodendrocytter liggende på toppen og blandes). - Når astrocytter nå ca. 90% sammenflydning, ryst flasken for at fjerne forurenende gliaceller:
- Kolben fjernes fra inkubatoren og stram hætte (phenol) eller dække porten (filtreret). At fjerne mikroglia, rystes kolben på en orbital platform ved 180 rpm i 1 time. Sug mediet. Skyl gang med 5 ml forvarmet dyrkningsmedium, aspireres og erstatte med 12 ml dyrkningsmedium.
- At fjerneoligodendrocytterne, kolben 37 ° C tilbage til orbital platform og rystes ved 250 rpm, i mindst 7 timer, men fortrinsvis O / N.
- Sug mediet. Skyl gang med 5 ml forvarmet dyrkningsmedium, aspireres og erstatte med 12 ml dyrkningsmedium. kolben Retur til inkubatoren.
- Når 100% konfluente, opdele astrocytter anvendelse af standardprocedurer i et forhold på 1: 3 til 1: 2 med 0,05% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). En T75-kolbe ved 100% sammenflydning vil typisk give omkring 4,0 x 10 6 celler i alt. I henhold til denne tidsplan, kan kulturerne typisk opdeles gang om ugen.
BEMÆRK: Når astrocytter flyder sammen, kan de høstes og anvendes til hiPSC differentiering som beskrevet nedenfor i protokol trin 3.4. De astrocytter kan opdeles mindst en gang uden en mærkbar tab af levedygtighed. De kan opretholdes i op til 2 måneder i kultur. Af erfaring, primær embryonale dag 18 rotte astrocytter progressively bliver terminalt differentieret og / eller miste levedygtigheden efter gentagen opdelingen. Selv om det er muligt at indefryse astrocytter til fremtidig brug, foretrækker vi at isolere astrocytter fra friske embryonale hjerner, når det kræves.
- Udskifte hele medium for den første gang 2 d efter indledende udpladning. Udskift hele medium bagefter hver 3 d. Altid Forvarm frisk medium til 37 ° C før tilsætning til cellerne.
2. generation af rtTA / Ngn2 -positiv hiPSCs
BEMÆRK: De hiPSCs anvendt til vores eksperimenter blev genereret in-house af lentiviral transduktion af humane fibroblaster med omprogrammering faktorer cMYC, SOX2, OCT4 og KLF4.
BEMÆRK: Til fremstilling af rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs, er lentivirale vektorer anvendes til stabilt at integrere transgenerne i genomet af hiPSCs. Protokollen for produktionen af lentivirus er tidligere 22 blevet offentliggjort. Detaljerne i de lentivirale pakkevektorer, der anvendes til at producere de rtTA og Ngn2 lentivirus partikler er tilvejebragt i den
- Plate de hiPSCs (dag 1)
BEMÆRK: Mængderne, der er nævnt i denne protokol antager, at hiPSCs dyrkes i et 6-brønds plade, og at cellerne i en brønd, høstes. Desuden antages det, at cellerne udplades efterfølgende i 12 brønde i en plade med 12 brønde.- Forbered 10 ml kold DMEM / F12 med 1% (v / v) basalmembranmatrix (BMM) til opnåelse fortyndet BMM. Tilføj 800 pi fortyndet BMM pr brønd af en plade med 12 brønde. Inkuber i mindst 1 time i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Før brug, inkuberes pladen i 1 time ved stuetemperatur.
- Varm 15 ml Essential 8 (E8) medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin, 9 ml DMEM / F12 og 1 ml Cellefrigørelse opløsning (CDS) til stuetemperatur. Supplere E8 medium med Rho-associeret protein kinase (ROCK) hæmmer.
- Aspirere brugte medium af hiPSCs end tilsættes 1 ml CDS til hiPSCs. Inkuber 3 - 5 min i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Check under mikroskop, om cellerne løsne fra hinanden.
- Tilsæt 2 ml DMEM / F12 i brønden, forsigtigt suspendere cellerne med en 1.000 pi pipette og overføres cellerne til et 15 ml rør. Tilsættes 7 ml DMEM / F12 til cellesuspensionen. Spin cellerne ved 200 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og tilsæt 2 ml af den fremstillet E8 medium. Opnå en cellesuspension, i hvilken hiPSCs dissocieres (ikke danner celleklumper) ved at sætte spidsen af en 1.000 pi pipette mod siden af 15 ml rør og resuspendering af cellerne forsigtigt. Check under mikroskopet om cellerne dissocieres.
- Bestemme antallet af celler (celler / ml) under anvendelse af et hæmocytometer kammer.
BEMÆRK: En 6 brøndsplade godt ved 80 - 90% sammenflydning vil typisk give 3,0 - 4,0 x 10 6 celler i alt. - Aspirerden fortyndede BMM fra brøndene i pladen 12 godt. Fortynd cellerne for at opnå en cellesuspension på 3,0 x 10 4 celler / ml. Plade 1 ml af cellesuspensionen pr brønd i pladen med 12 brønde. Placer 12 brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2.
- Transducere IPS celler med rtTA og Ngn2 lentivirus (dag 2)
- Varm 12 ml E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til stuetemperatur. Supplere E8 medium med ROCK inhibitor og polybren til en slutkoncentration på 8 ug / ml til E8 medium.
- Optø de portioner med lentivirus suspension. Tilføj polybren til en slutkoncentration på 8 ug / ml til lentivirus suspension. Aspirer det brugte medium og tilsæt 1 ml af den forberedt E8 medium til hver brønd.
- Udfør transduktion med forskellige mængder af den rtTA - og Ngn2 -lentivirus suspensioner. F.eks transduce hiPSCs ved tilsætning af 100 pi af både rtTA -lentivirus og Ngn2 -lentivirus suspension til en brønd i pladen med 12 brønde. For de andre brønde, bruge 200 uL, 300 uL, 400 uL og 500 uL lentivirus suspension i stedet for 100 uL. bør ikke transduceres de hiPSCs af to brønde i 12 brønds plade; de vil tjene som kontrol under udvælgelsesprocessen.
BEMÆRK: De transduktioner er fortrinsvis udført i dobbeltbestemmelse, således at transduktionseffektiviteten kan anslås mere nøjagtigt efter starten af markeringen (se protokol trin 2.2.4). Mængden af lentivirus suspension, der kræves til effektivt at transducere de fleste af de hiPSCs afhænger titeren af lentivirus suspensionen, og hiPSC linje, der bruges. I denne undersøgelse, vi normalt bruger 100 - 500 uL af lentivirus suspension til at transducere de hiPSCs. - Pladen med 12 brønde i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 i 6 timer. Inden udgangen af 6 timer inkubationsperiode varm 12 ml E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin og 12 ml Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) til RT. Supplere E8 medium med ROCK-hæmmer.
- Aspirer det brugte E8 medium. Vask hver brønd med 1 ml DPBS. Tilsættes 1 ml af den klargjorte E8 medium til hver brønd. Placer 12 brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2.
- Opdater E8 medium (dag 3)
- Varm 12 ml E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til RT. Aspirer det brugte medium fra brøndene i pladen med 12 brønde, og der tilsættes 1 ml af den forberedte E8 medium til hver brønd. Placer 12 brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2.
- Udfør valget med puromycin og G418 (dag 4-8)
BEMÆRK: Afhængigt af celledeling på HipSC linje og effektiviteten af den lentivirale transduktion kan cellerne nå op på 70 - med 80% konfluens under udvælgelsesprocessen periode, på hvilket tidspunkt kulturerne skal flækkes. Fordi timingen af opsplitning ikke kan forudsiges på forhånd, vil det ikke blive nævnt i protokollen. Men i stedet for at opdatere E8 medium suppleret med de nævnte koncentrationer af puromycin og G418, kan man opdele hiPSC kultur som en normal hiPSC kultur (herunder udpladning af cellerne på vitronectin-coatede plader). Den eneste undtagelse er, at E8 medium bør suppleres med de nævnte koncentrationer af antibiotika for at fortsætte valget.- Varm 12 ml E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til stuetemperatur. Tilføj puromycin og G418 til valg; forskellige mængder af antibiotika tilsættes under udvælgelsen periode (tabel 1).
- Vurdere effektiviteten af transduktion ved at estimere andelen af G418- og puromycin-resistente celler. For at estimere andelen af resistente celler, vurdere procentdelen af døde celler (nonresistant celler) for de forskellige forhold (kulturerne transduceret med de forskellige mængder af lentivirus suspension) og for de nontransduced (de celler, der tjener som en markering kontrol). Beregn procentdelen af resistente celler som [100% - (procent af døde celler)].
BEMÆRK: Hvis transduktioner med de forskellige mængder af lentivirus suspension blev udført i to eksemplarer, kan transduktion effektivitet estimeres mere præcist. Betingelsen med de ikke-transducerede celler tjener som en markering kontrol; de procentdele af døde celler til kulturerne transduceret med de forskellige mængder af lentivirus suspension bør være lavere. Den anslåede procentdel af resistente celler bruges til at vælge de hiPSCs, der sandsynligvis positiv for begge transgener. Generelt vælger vi de hiPSCs fra transduktion tilstand var> 90% af cellens overlever udvælgelsesperioden 5 d. - Aspirer det brugte medium af hiPSCs og tilsæt 1 ml af den forberedte E8 medium til brøndene. Placer 12 brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2.
| Slutkoncentration på G418 | Slutkoncentration på puromycin | |
| Dag 4 | 250 ug / ml | 2 ug / ml |
| Dag 5 | 250 ug / ml | 2 ug / ml |
| Dag 6 | 250 ug / ml | 1 ug / ml |
| Dag 7 | 250 ug / ml | 1 ug / ml |
| Dag 8 | 250 ug / ml | 1 ug / ml |
Tabel 1: Koncentrationer af antibiotika i løbet af Selection Periode.
- Stop udvælgelse og begynde regelmæssig dyrkning (dag 9 og nyere)
- Efter 5 d udvælgelsesperioden, kultur de rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs som normal hiPSCs, med den undtagelse, at E8 medium af cellerne suppleret med G418 til en slutkoncentration på 50 ug / ml og med puromycin til en slutkoncentration på 0,5 ug / ml.
BEMÆRK: Cellerne kan nu frosset (i overensstemmelse med standardprotokoller for kryopræservering af celler) for at fungere som backup. Dette er et vigtigt skridt for reproducerbarheden af differentiering protokol, fordi det tillader anvendelse af den samme batch af rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs for mange fremtidige differentierings- eksperimenter.
- Efter 5 d udvælgelsesperioden, kultur de rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs som normal hiPSCs, med den undtagelse, at E8 medium af cellerne suppleret med G418 til en slutkoncentration på 50 ug / ml og med puromycin til en slutkoncentration på 0,5 ug / ml.
3. Differentiering af rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs til neuroner på 6 brøndeMEA og dækglas
BEMÆRK: I denne protokol, er detaljerne, der er fastsat differentiere rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs på to forskellige substrater, dvs. 6-brønds MMA (enheder bestående af 6 uafhængige brønde med 9 optagelse og 1 reference- indlejrede mikroelektroder per brønd) og dækglas i brøndene i en 24-brønds plade. Protokollerne kan imidlertid let tilpasses til større substrater (fx til brøndene i 12- eller 6-brønds plader), ved at opskalere den nævnte værdier ifølge overfladearealet.
- Forbered MEA eller dækglas (dag 0 og dag 1)
- Dagen før starten af differentieringen, sterilisere MEA'er ifølge producentens anbefaling.
- Fortynd adhæsionsproteinet Poly-L-ornithin (PLO) i sterilt ultrarent vand til en slutkoncentration 50 ug / ml. Coat den aktive elektrodeareal på 6-brønds MEA'er ved at placere en 100 pislip af den fortyndede PLO i hver brønd. Placer dækglas i brøndene i 24-brønds plade under anvendelse af sterile pincetter. Tilføj 800 pi af den fortyndede PLO i hver brønd. Undgå de dækglas fra flydende ved at skubbe dem ned med 1000 uL pipettespids.
- Inkubér 6-brønds MEA og 24-brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Den næste dag, aspireres den fortyndede PLO. Vask glas overflader af de 6-brønds MEA og dækglassene to gange med sterilt ultrarent vand.
- Fortynd laminin i koldt DMEM / F12 til en slutkoncentration på 20 ug / ml (for 6-brønds MEA) og 10 ug / ml (for dækglas). Umiddelbart belægge aktive elektrodeareal af de 6-brønds MEA'er ved at placere en 100 pi fald i hver brønd. Ligeledes tilsættes 400 pi af den fortyndede laminin i hver brønd af 24-brønds plade til at overtrække dækglas. Undgå de dækglas fra flydende ved at skubbe dem ned med 1000 uL pipettespids.
- Inkubér 6-brønds MEA og 24-brønds plade i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 i mindst 2 timer.
- Plate de hiPSCs (dag 1)
BEMÆRK: Mængderne, der er nævnt i trin 3.2.1 - 3.2.4 antager, at rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs dyrkes i en 6-brønds plade, og at cellerne i en brønd, høstes. Volumenerne, der kræves for udpladning af cellerne på 6-brønds MEA og / eller dækglassene afhænger af antallet af 6-brønds MEA og / eller antallet af dækglas, der anvendes i forsøget; tallene angivet i trin 3.2.6 - 3.2.8 tillader skalering til forskellige eksperiment-størrelser.- Varm DMEM / F12, CDS og E8 medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til R / T. Tilføj doxycyclin til en endelig koncentration på 4 pg / ml og ROCK inhibitor til E8 medium.
- Aspirer det brugte medium af rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs og der tilsættes 1 mL CDS til hiPSCs. Inkuber 3 - 5 min i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2. Check under mikroskop, om cellerne løsne fra hinanden.
- Tilsæt 2 ml DMEM / F12 i brønden, forsigtigt suspendere cellerne med en 1.000 pi pipette og overføres cellerne til et 15 ml rør. Tilsættes 7 ml DMEM / F12 til cellesuspensionen. Spin cellerne ved 200 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og tilsæt 2 ml af den fremstillet E8 medium. Dissociere hiPSCs ved at sætte spidsen af en 1.000 pi pipette mod siden af 15 ml rør og resuspendering af cellerne forsigtigt. Check under mikroskopet om cellerne dissocieres.
- Bestemme antallet af celler (celler / ml) under anvendelse af et hæmocytometer kammer.
BEMÆRK: En plade med 6 brønde godt ved 80 - 90% sammenflydning vil typisk give 3,0 - 4,0 x 10 6 celler i alt. - Aspirere fortyndede laminin. For 6-brønds multilaterale miljøaftaler, fortyndes cellerne for at opnå en cell suspension af 7,5 x 10 5 celler / ml. Plate cellerne ved at tilsætte en dråbe 100 pi af cellesuspensionen på det aktive elektrodeareal i hver brønd i 6-brønds MEA'er. For dækglassene, fortyndes cellerne til opnåelse af en cellesuspension af 4,0 x 10 4 celler / ml. Plate cellerne ved at tilsætte 500 pi af cellesuspensionen til brøndene i 24-brønds plade.
BEMÆRK: Den endelige celledensitet på MEA'er er højere end på dækglassene (figur 1A og B). Vi fandt, at denne høj celledensitet var påkrævet for korrekt registrering af netværksaktivitet. I protokollen er antallet forudsat der viste sig at være optimalt for analyserne. - Placer 6-brønds MEA og 24-brønds plade i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 i 2 timer (MEA) eller O / (24 brønds plade) N.
- Efter 2 timer tilsættes forsigtigt 500 pi af fremstillet E8 medium til hver brønd i 6-brønds MEA'er. Placer 6-vill MEA O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2.
- Skift medium (dag 2)
- Den næste dag, forberede DMEM / F12 med 1% (v / v) N-2 supplement, 1% (v / v) ikke-essentielle aminosyrer og 1% (v / v) penicillin / streptomycin. Tilføj humant rekombinant neurotrophin-3 (NT-3) til en slutkoncentration på 10 ng / ml, human rekombinant hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) til en endelig koncentration på 10 ng / ml, og doxycyclin til en endelig koncentration på 4 pg / mL. Varm mediet til 37 ° C.
- Tilføj laminin til en slutkoncentration på 0,2 ug / ml til mediet. Filtrer den resulterende medium. Aspirer det brugte medium fra brøndene i 6-brønds MEA og 24-brønds plade og erstatte det med den klargjorte medium. Inkubér 6-brønds MEA og 24-brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2.
- Tilføj rotte astrocytter (dag 3)
BEMÆRK: De mængder, der er nævnt i denne protokol, antage, at rotte astrocytter dyrkes i T75 dyrkningskolber. Det er afgørende, at de rotter astrocytter, der tilsættes til kulturerne er af god kvalitet. Vi anvender to kriterier for at kontrollere, om de rotte astrocytter er af god kvalitet. For det første bør rotte astrocyt kultur kunne vokse sammenflydende inden for ti dage efter isolation fra rotte embryonale hjerner. For det andet, efter spaltning af rotte astrocyt kultur, bør rotte astrocytter kunne danne et konfluent, tessellated monolag (figur 1C). Hvis rotten astrocyt kultur ikke opfylder disse to kriterier, anbefaler vi ikke at bruge denne kultur for differentiering eksperimenter.- Varm 0,05% trypsin-EDTA til stuetemperatur. Varm DPBS og DMEM / F12 med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til 37 ° C.
- Aspirere brugte medium af rotte astrocyt kultur. Vask kulturen ved tilsætning af 5 ml DPBS og hvislen det rundt forsigtigt.
- Aspirspiste DPBS og tilsæt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Swish trypsin-EDTA rundt forsigtigt. Inkuber i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2 i 5 - 10 min.
- Check under mikroskopet om cellerne er fritliggende. Frigør de sidste celler ved at ramme kolben et par gange.
- Der tilsættes 5 ml DMEM / F12 til kolben. Triturer cellerne forsigtigt inde i kolben med en 10 ml pipette. Opsaml cellesuspension i en 15 ml rør. Spin røret ved 200 xg i 8 min.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml DMEM / F12. Bestemme antallet af celler (celler / ml) under anvendelse af et hæmocytometer kammer.
- Tilføj 7,5 x 10 4 astrocytter pr brønd i 6-brønds MEA'er. Tilsæt 2,0 x 10 4 astrocytter per brønd af 24-brønds plade. Inkubér MEA og 24-brønds plade O / N i en fugtig 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2.
- Skift medium (dag 4)
- Filter mediet og opvarm til 37 ° C. Aspirer det brugte medium fra brøndene i 6-brønds MEA og 24-brønds plade og erstatte det med den klargjorte medium. Opretholde de 6-brønds MEA'er og 24-brønds plade i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2.
BEMÆRK: Startende fra dag 6, opdatere halvdelenaf mediet hver anden dag. Fra dag 10 og frem, er det medium suppleret med FBS at støtte astrocyt levedygtighed.
- Forbered Neurobasal medium med 2% (v / v) B-27 supplement, 1% (v / v) L-alanyl-L-glutamin og 1% (v / v) penicillin / streptomycin. Tilføj NT-3 til en slutkoncentration på 10 ng / mL, BDNF til en endelig koncentration på 10 ng / ml, og doxycyclin til en endelig koncentration på 4 pg / ml. Fra dag 10 og frem, også supplere mediet med 2,5% (vol / vol) FBS. Filtrer den resulterende medium og varme til 37 ° C.
- Fjern halvdelen af det brugte medium fra brøndene i 6-brønds MEA'er og 24-brønds plade under anvendelse af en pi pipette 1000 og erstatte det med den klargjorte medium. Opretholde de 6-brønds MEA'er og 24-brønds plade i en befugtet 37 ° C inkubator med en atmosfære af 5% CO2.
4. Etablere den neurofysiologiske Profil af hiPSC-afledte neuroner
BEMÆRK: To til tre uger efter iduktion af differentiering, kan de hiPSC-afledte neuroner anvendes til forskellige downstream analyser. I dette afsnit er eksempler på nogle downstream analyser givet som kan udføres for at etablere det neurofysiologiske profil af de hiPSC-afledte neuroner.
- Karakterisere neuronale netværk aktivitet ved anvendelse MEA'er
- Record 20 min af elektrofysiologisk aktivitet af hiPSC-afledte neuroner dyrket på MEA'er. Under optagelsen holde temperaturen ved 37 ° C, og forhindre fordampning og pH-ændringer i mediet ved at oppuste en konstant, langsom strømning af befugtede gas (5% CO2, 20% O2, 75% N2) på MEA .
- Efter 1200X forstærkning (MEA 1060, MCS), prøve signalet ved 10 kHz ved hjælp af MCS datafangst-kort. Analyser af data (spike og brast afsløring) ved hjælp af en brugerdefineret software-pakke 23.
- Karakterisere encellede elektrofysiologisk aktivitet
- Overfør dækglas indeholdende hiPSC-afledte neuronale kulturer til en neddykket fast fase optagelse kammer i en opretstående mikroskop. Record 20 min af spontan aktionspotentiale-fremkaldte postsynaptiske strømme (sEPSC) 24. Detect den synaptiske begivenhed ved hjælp neurovidenskabelig program.
- Fix og plette de hiPSC-afledte neuroner for MAP2, synapsin-1/2, og PSD-95 22, 24, 25. Kvantificer antallet af synapsin-1/2 og PSD-95 puncta bruger billedanalyse software.
Representative Results
Her har vi med succes ændret en protokol, hvor hiPSCs er differentieret direkte i corticale neuroner ved over-ekspression af transkriptionsfaktoren neurogenin-2 12 og vi har tilpasset det til brug for MEA'er. Denne fremgangsmåde er hurtig og effektiv tillader os at opnå funktionelle neuroner og netværksaktivitet allerede i den tredje uge efter induktionen af differentiering.
I løbet af differentieringen protokol, cellerne morfologisk begyndte at ligne neuroner: små processer blev dannet og neuroner begyndte at forbinde til hinanden (figur 1A). Vi har etableret et neurofysiologisk profil af neuroner, der stammer fra en sund-kontrol hiPSC linje, ved at måle deres neuronal morfologi og synaptiske egenskaber under udvikling. hiPSC-afledte neuroner blev farvet for MAP2 og synapsin-1/2 ved forskellige dage efter startenaf differentiering (figur 2A). De afledte neuroner viser modne neuronal morfologi allerede 3 uger efter induktion af differentiering. Antallet af synapsin-1/2 puncta (et mål for antallet af synapser) blev kvantificeret på grundlag af synapsin-1/2 immuncytokemi farvninger. Antallet af synapsin-1/2 puncta steget over tid, hvilket antyder, at omfanget af neuronal konnektivitet også er stigende (figur 2B). Antallet af synapsin-1/2 puncta 23 dage efter induktionen af differentiering var ens i to uafhængige IPS linier (figur 2C). Ved 23 DIV mest synapsin1 / 2 puncta blev sidestillet med PSD-95 puncta, som er vejledende for funktionelle synapser (Figur 2D).
I overensstemmelse med resultaterne beskrevet af Zhang et al., Genereret vi en population af excitatoriske øvre lag corticale neuroner, bekræftet ved pan-neuronal og subtypespecifik kortikal m arkers såsom BRN2 og SATB2 (lag II / III). Vi har ikke observere neuroner, der var positive for dyb lag neuroner CTIP2 (lag V) eller Foxp2 (lag VI) (Figur 2E og F)
For at karakterisere elektrofysiologiske aktivitet hiPSC-afledte neuroner, brugte vi hel-celle strøm og spænding clamp optagelser, dvs. iboende egenskaber og stimulerende input på disse neuroner blev målt under udvikling. Neuronerne var i stand til at generere aktionspotentialer allerede en uge efter differentiering og procentdelen af spiking celler var stigende over tid (figur 2G og H). Endvidere neuronerne modtaget excitatorisk synaptisk input allerede en uge efter induktionen af differentiering: både frekvens og amplitude af den excitatoriske synaptiske input steg i udvikling (figur 2I - K).
nt "fo: holde-together.within-side =" 1 "> For bedre at forstå, hvordan encellede aktivitet kombinerer til at danne netværk-niveau funktioner, er det vigtigt at undersøge, hvordan neuroner arbejder i koncert In vitro neuronale netværk dyrket på multilaterale miljøaftaler. udgør en værdifuld eksperimentel model til undersøgelse af neuronale dynamik. Vi indspillede 20 min på elektrofysiologisk netværksaktivitet af neuroner afledt fra en sund kontrol hiPSC line dyrket på 6-brønds MEA'er (figur 2M). få uger efter induktion af differentiering, neuronerne stammer fra sunde-kontrol hiPSCs dannet funktionelt aktive neurale netværk, viser spontane begivenheder (0,62 ± 0,05 spike / s; Figur 2 N). på dette udviklingstrin (dvs. 16 d efter starten på den differentiering) ikke synkrone hændelser, der involverer alle de kanaler . af påvises multilaterale miljøaftaler (Figur 2O) niveauet for netværksaktivitet steget under udviklingen: i løbet af fjerde uge efter t han induktion af differentiering, viste de neuronale netværk højt spontan aktivitet (2,5 ± 0,1 spike / s; Figur 2 N) i alle brøndene i indretningen. De netværk også udstillet synkrone netværk stød (4,1 ± 0,1 burst / min, figur 2O) med lang varighed (2.100 ± 500 ms).
Figur 1: hiPSC Differentiering til neuroner. A. Tre tidspunkter af hiPSCs differentiering i neuroner på dækglas. B. Plating af hiPSCs om multilaterale miljøaftaler. C. Astrocytter ved 100% konfluens i T75-kolbe (bemærk, at cellerne danner en tessellated monolag). Scale barer: 150 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. hiPSC-afledte Neuroner Characterization. A. hiPSC-afledte neuroner blev farvet for MAP2 (grøn) og synapsin-1/2 (rød) ved forskellige dage efter starten af differentiering. Målestokken: 10 um. B. Kvantificering af synapsin puncta i to uafhængige forsøg. I hvert forsøg blev analyseret mindst 10 celler. C. Kvantificering af synapsin puncta ved DIV23 i neuroner afledt fra to uafhængige IPS linjer. D. hiPSC-afledte neuroner blev farvet for PSD-95 (grøn) og synapsin-1/2 (rød) 23 dage efter starten af differentiering. Synapsin puncta sammenstilles til PSD-95 puncta. E. hiPSC-afledte neuroner blev farvet for MAP2 (grøn) og BRN2 (rød) eller SATB2 (rød) 23 d efter starten af differentiering. F. Procentdel af MAP2 positive celler, somvar positive for angivne markører. G. Repræsentative nuværende klemmeoptagelser der viser, at aktionspotentialer kan frembringes så tidligt som 7 d efter starten af differentiering. H. Procent af celler på forskellige dage efter induktion af differentiering, der viser en eller flere aktionspotentialer. I. Repræsentative spor af excitatoriske postsynaptiske strømme (EPSCs) modtaget af hiPSC-afledte neuroner på forskellige dage efter differentiering. J. Hyppigheden af excitatoriske postsynaptiske strømme under udviklingen. K. Amplitude af excitatoriske postsynaptiske strømme under udviklingen. L. repræsentant spor af EPSC optagelser uden (kontrol) og med CNQX (CNQX). M. Neuroner afledt af én hiPSC linje blev dyrket på en 6-brønds MEA og netværksaktivitet er vist for hiPSC-afledte neuronale netværk 16 og 23 d efter induktionen af differentiering. Aktiviteten registreret frahver brønd (samplingfrekvens på 10 kHz) er indikeret med en anden farve (5 min i 20 min for optagelsen vises). N. Firing sats 16 og 23 d efter induktion af differentiering. O. Bursting sats 16 og 23 d efter induktion af differentiering. Klik her for at se en større version af dette tal.
I betragtning af de resultater, kan kvaliteten af de resulterende hiPSC-afledte neuroner vurderes ved at lave en neurofysiologisk profil af cellerne. Det vil sige, tre til fire uger efter begyndelsen af differentieringen, morfologien, synapsin-1/2-ekspression og elektrofysiologi af neuronerne kan vurderes. På det tidspunkt, forventes hiPSC-afledte neuroner til at vise en neuronal-lignende morfologi, at være MAP2, synapsin / PSD-95 positive ved udførelse immuncytokemi, og at udstillingert spontan elektrofysiologisk aktivitet (både ved enkelt-celle og nettet).
Discussion
Her har vi implementeret en effektiv hiPSC-differentiering protokol publiceret af Zhang et al. (2013) 12 til måling af netværksaktivitet hiPSC-afledte neuronale netværk på multilaterale miljøaftaler. Vi tilpassede den oprindelige protokol ved at oprette en rtTA / Ngn2 -positiv hiPSC linje før fremkalde neuronal differentiering. Dette yderligere trin giver os mulighed for at styre den neuronale celledensitet på MEA. Kontrol over neuronal tæthed var en vigtig forudsætning for at tilpasse protokollen til MEA og for at sikre konsistens. For at måle aktiviteten af neuronale netværk ved hjælp MEA'er, neuronerne nødt til at danne tætte net direkte oven på MEA elektroder 17,18. Dette kræver nødvendigvis stram kontrol med klædningen tæthed af neuronerne. Den rtTA / Ngn2 -positiv hiPSC linje giver mulighed for styring af neuron tæthed, fordi denne taktik ikke er afhængig af akutte lentivirale transduktioner af hiPSCs før differentiering;den rtTA / Ngn2 -positiv hiPSC line derfor næsten eliminerer enhver variation i det endelige udbytte på grund af for eksempel lentivirale toksicitet og variabel infektion effektivitet.
Et andet kritisk trin af den eksperimentelle fremgangsmåde er antallet af rotte astrocytter, der er dyrket sammen med de differentierende hiPSCs. Astrocytter bidrager aktivt til forfinelse for at udvikle neurale kredsløb ved at kontrollere synapse dannelse, vedligeholdelse og fjernelse, som alle er vigtige processer for neuronal funktion. Protokollen i dette papir er meget astrocyt-afhængig: til fuldt modne og danne funktionelle synapser, neuronerne kræver støtte fra astrocytter. Vi oplevede, at antallet af astrocytter være af omtrent lig med antallet af hiPSC-afledte neuroner til at understøtte modningen af neuronerne og dannelsen af neuronale netværk, der udviser spontan aktivitet. Da vores astrocyt protokol udbytter primær celle culrer med en begrænset levetid, isolering af rotte astrocytter skal udføres regelmæssigt.
Vores tilpasning af protokollen publiceret af Zhang et al. (2013) 12 til brug med MEA teknologi vil sandsynligvis i væsentlig grad forbedre vores evne til at studere netværket aktivitet hiPSC-afledte netværk. Tidligere protokoller, der anvendes til at studere hiPSC-afledte neuronale netværk med multilaterale miljøaftaler påberåbt tidskrævende differentiering procedurer 13-16. Protokollen fra Zhang et al. (2013) giver en hurtig alternativ, og vores ændring fjerner en kilde til variation, hvilket gør det nu mere realistisk at bruge hiPSC-afledte neuroner i kombination med MEA-teknologi, især i high-throughput eller farmakologiske undersøgelser. Hertil kommer, fordi metoden offentliggjort af Zhang et al. (2013) 12 giver en homogen population af øverste lag kortikale neuroner, vores tilpasset protokol muliggør fokuserede undersøgelser af netværket enctivity af denne særlige neuronal delmængde.
Ikke desto mindre har denne fremgangsmåde også flere begrænsninger. For det første kan homogeniteten af kulturerne også betragtes som en ulempe, fordi kulturerne er mindre tilbøjelige til at ligne in vivo net, hvor forskellige klasser af neuroner (dvs. inhibitoriske og excitatoriske neuroner) udgør en heterogen netværk. For yderligere at øge anvendelsen af hiPSC-afledte neuroner med MEA teknologi, vil det være vigtigt at udvikle hurtige (transgene-baseret) differentieringsfaktorer protokoller for andre neuronale cellepopulationer. Hvis protokoller bliver tilgængelige, vil in vitro-net efterligne in vivo netværk nærmere. For det andet, på nuværende rotte astrocytter skal lægges til de hiPSC-afledte neuroner til støtte vækst, og derfor den resulterende neuronal netværk ikke er et menneske neuronal netværk i snæver forstand. Pålidelige protokoller til at differentiere hiPSCs i astrocytter kan i fremtiden solve dette problem 26. Tredje, todimensionale neuronale netværk, som beskrevet her, er et begrænset model til undersøgelse af komplekse tredimensionelle in vivo neuronale netværk. Heldigvis protokoller der beskriver tredimensionelle kulturer af rotte primære neuroner i kombination med MEA teknologi er allerede tilgængelige 27,28. Fremadrettet bør kombinationen af hurtige differentiering protokoller for at opnå hiPSC-afledte neuroner og astrocytter med tredimensionelle kultur teknikker og MEA-teknologi giver nye indblik i de biologiske mekanismer underliggende neurologiske lidelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lebovitz's L-15 medium | Gibco | 11415-064 | |
| B-27 supplement | Gibco | 0080085SA | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Ca2+/Mg2+-free HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| High-glucose DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| psPAX2 lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12259 | |
| Basement membrane matrix | Gibco | A1413201 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| E8 medium | Gibco | A1517001 | |
| ROCK inhibitor | Gibco | A2644501 | Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-5G | |
| G418 | Sigma-Aldrich | G8168-10ML | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| Vitronectin | Gibco | A14700 | |
| 6-well MEAs | Multi Channel Systems | 60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr | |
| Glass coverslips | VWR | 631-0899 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655-10MG | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891-5G | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| NT-3, human recombinant | Promokine | C66425 | |
| BDNF, human recombinant | Promokine | C66212 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| L-alanyl-L-glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768-100MG | |
| Straight fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251 | |
| Fine-tipped spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. Studying human disease using human neurons. Brain Res. , (2016).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Wu, H., et al. Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture. J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).
- Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Sci Rep. 6, 26181 (2016).
- Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Front Neurosci. 10, (2016).
- Heikkila, T. J., et al. Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro. Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).
- Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays. Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).
- Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces. J Neural Eng. 9 (2), (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079 (2013).
- Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J Vis Exp. (63), e3965 (2012).
- Ba, W., et al. ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function. Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).
- Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer. Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).
- Ba, W., et al. TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function. Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).
- Benevento, M., et al. Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling. Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci Rep. 4, 5489 (2014).
- Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model. J Vis Exp. (104), e53080 (2015).
