Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

मापने नेटवर्क गतिविधि माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों पर के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का तेजी से neuronal भेदभाव

Published: January 8, 2017 doi: 10.3791/54900
Automatic Translation
*1,2, *3, 2,3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3,4, 1,2,3
1Department of Cognitive Neurosciences, Radboudumc, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University, 3Department of Human Genetics, Radboudumc, 4Department of Molecular Developmental Biology, Radboud University
* These authors contributed equally

Summary

हम संशोधित करने और एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल उत्तेजक cortical न्यूरॉन्स 12 में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) की, तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, कुशल और भेदभाव का वर्णन लागू करने। विशेष रूप से, हमारे संशोधन सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणियों पर neuronal सेल घनत्व और उपयोग का नियंत्रण नेटवर्क के स्तर पर electrophysiological गुणों को मापने के लिए अनुमति देता है।

Abstract

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स (hiPSCs) मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन के लिए एक होनहार नए उपकरण प्रदान करते हैं। पिछले दशक में, न्यूरॉन्स में hiPSCs फर्क के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। हालांकि, इन प्रोटोकॉल अक्सर उच्च परिवर्तनशीलता, कम reproducibility, और कम क्षमता के साथ धीमी गति से कर रहे हैं। इसके अलावा, इन प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त न्यूरॉन्स अक्सर अपरिपक्व हैं और दोनों एकल कोशिका और नेटवर्क के स्तर पर पर्याप्त कार्यात्मक गतिविधि जब तक न्यूरॉन्स कई महीनों के लिए सुसंस्कृत हैं की कमी है। आंशिक रूप से इन सीमाओं के कारण, hiPSC व्युत्पन्न neuronal नेटवर्क के कार्यात्मक संपत्तियों अभी भी अच्छी तरह से नहीं की विशेषता है। यहाँ, हम एक हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल है कि प्रतिलेखन कारक neurogenin-2 12 के लिए मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा hiPSCs से मानव न्यूरॉन्स के उत्पादन का वर्णन लिए अनुकूल है। इस प्रोटोकॉल तेजी से और कुशल (3 सप्ताह के भीतर परिपक्व न्यूरॉन्स उपज) है, transduc के लगभग 100% रूपांतरण दक्षता के साथएड कोशिकाओं (> DAPI पॉजिटिव कोशिकाओं के 95% कर रहे हैं MAP2 सकारात्मक)। इसके अलावा, प्रोटोकॉल उत्तेजक न्यूरॉन्स कि मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए सेल प्रकार विशिष्ट योगदान के जांच की अनुमति होगी के एक सजातीय आबादी पैदावार। हम स्थिरतापूर्वक transduced hiPSC कोशिकाओं को पैदा करने, हमें न्यूरॉन्स की कुल संख्या से अधिक स्पष्ट नियंत्रण देकर मूल प्रोटोकॉल संशोधित। इन कोशिकाओं को फिर सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणियों पर hiPSC व्युत्पन्न neuronal नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस तरह, hiPSC व्युत्पन्न neuronal नेटवर्क की सहज electrophysiological गतिविधि मापा और विशेषता है, जबकि सेल घनत्व के मामले में interexperimental स्थिरता बनाए रखने जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल विशेष रूप से मानव neuronal नेटवर्क पर यंत्रवत और औषधीय अध्ययन के लिए, मोटे तौर पर लागू है।

Introduction

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) भेदभाव प्रोटोकॉल के विकास मानव न्यूरॉन्स इन विट्रो में मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन के लिए एक नया शक्तिशाली उपकरण प्रदान की गई है उत्पन्न करने के लिए। अभी हाल तक, इन बीमारियों के अध्ययन के गंभीर रूप से मॉडल प्रणाली मानव न्यूरॉन्स का उपयोग कर की कमी आड़े आती गया था। मूषक मस्तिष्क संबंधी बीमारियों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के अध्ययन के परिणाम मनुष्यों 1 के लिए आसानी से अनुवाद नहीं किया जा सकता है। इन सीमाओं को देखते हुए, hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स एक होनहार वैकल्पिक मॉडल है कि और इन विट्रो दवा स्क्रीनिंग के लिए आणविक तंत्र अंतर्निहित मस्तिष्क संबंधी बीमारियों को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

पिछले दशक में, कई प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स में hiPSCs विकसित किया गया है 2-8 परिवर्तित करने के लिए। हालांकि, इन प्रोटोकॉल अभी भी कई मायनों में सीमित कर रहे हैं। सबसे पहले, प्रोटोकॉल अक्सर समय लेने वाली हैं: पर्याप्त परिपक्वता के साथ न्यूरॉन्स पैदा करने (यानी synapएसई गठन) और कार्यात्मक गतिविधि संवर्धन प्रक्रिया है, जो मुश्किल 9 बड़े पैमाने पर अध्ययन renders के महीनों की आवश्यकता है। इसके अलावा, hiPSC करने वाली न्यूरॉन रूपांतरण दक्षता कम है। प्रोटोकॉल अक्सर न्यूरॉन्स की एक विषम जनसंख्या उपज, और इस तरह neuronal कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट के अध्ययन की अनुमति नहीं है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल नहीं प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, विभिन्न IPSC लाइनों 10,11 के लिए अलग-अलग परिणाम उपज हैं। अन्त में, परिपक्वता चरण में है और जिसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स की कार्यात्मक गुण भी चर रहे हैं 10।

इन समस्याओं, झांग एट अल संबोधित करने के लिए। (2013) 12 एक प्रोटोकॉल है कि तेजी से और reproducibly neurogenin -2 प्रतिलेखन कारक overexpressing द्वारा hiPSCs से मानव न्यूरॉन्स उत्पन्न करता है विकसित की है। लेखकों द्वारा की सूचना दी, भेदभाव अपेक्षाकृत जल्दी होता है (केवल 2 - 3 सप्ताह neurogenin -2 की अभिव्यक्ति उत्प्रेरण के बाद), प्रोटोकॉल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (न्यूरोनल गुण एस से सम्बंधितhiPSC लाइन) tarting, और hiPSC करने वाली न्यूरॉन रूपांतरण अत्यधिक कुशल है (लगभग 100%)। उनके प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न न्यूरॉन्स की आबादी सजातीय (जैसी ऊपरी परत cortical न्यूरॉन्स) है, न्यूरोनल विकारों के लिए सेल प्रकार विशिष्ट योगदान के लिए जांच की इजाजत दी। इसके अलावा, उनके hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के बाद केवल 20 डी परिपक्व गुण (जैसे, क्षमता synapses और मजबूत कार्यात्मक गतिविधि के रूप में) का प्रदर्शन किया।

नेटवर्क के स्तर पर hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की electrophysiological गुण निस्र्पक hiPSC प्रौद्योगिकी से पहले एक महत्वपूर्ण शर्त मानव रोगों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस कारण से, कई अनुसंधान समूहों ने हाल ही में माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणी (विदेश मंत्रालय) उपकरणों (मल्टीचैनल सिस्टम्स, Reutlingen, जर्मनी) 13-16 का उपयोग कर नेटवर्क के स्तर पर स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की जांच करने के लिए शुरू कर दिया है। विदेश मंत्रालय के इलेक्ट्रोड एक सब्सट्रेट जिस पर neuronal कोशिकाओं संवर्धित किया जा सकता में एम्बेडेड रहे हैं।Meas neuronal नेटवर्क और उनकी गतिविधियों की इन विट्रो विकास के electrophysiological गुणों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वर्तमान में, Meas केवल भेदभाव प्रोटोकॉल है कि कई महीने लग परिपक्व नेटवर्क उपज के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है। इसलिए, एक तेजी से भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ MEAS संयोजन मस्तिष्क संबंधी बीमारियों का बड़े पैमाने पर अध्ययन में इस तकनीक के उपयोग की सुविधा चाहिए।

यहाँ, हम झांग एट अल के एक संशोधन प्रस्तुत करते हैं। (2013) 12 प्रोटोकॉल और Meas पर उपयोग के लिए अनुकूलित। विशेष रूप से, बल्कि एक तीव्र lentiviral पारगमन पर भरोसा से, हम बजाय स्थिरतापूर्वक भेदभाव उत्प्रेरण से पहले rtTA / Ngn2 व्यक्त hiPSC लाइनों बनाया। हम मुख्य रूप से यह किया है, न्यूरोनल सेल घनत्व अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नियंत्रण करने के बाद neuronal सेल घनत्व न्यूरोनल नेटवर्क के गठन के लिए महत्वपूर्ण है, और न्यूरॉन्स और विदेश मंत्रालय 17,18 के इलेक्ट्रोड के बीच अच्छे संपर्क के लिए। Althougज झांग एट अल। प्रोटोकॉल transduced hiPSCs के रूपांतरण के लिए सम्मान के साथ बहुत ही कुशल है, यह hiPSCs की संख्या से न्यूरॉन्स की अंतिम उपज के लिए सम्मान के शुरू में चढ़ाया 12 (झांग एट अल। में चित्रा 2 ई देखें) के साथ स्वाभाविक चर रहा है। एक स्थिर लाइन के साथ, हम इस तरह के lentiviral विषाक्तता और संक्रमण दक्षता के रूप में परिवर्तनशीलता के कारण कई मुद्दों को समाप्त। हम तो पैरामीटर है कि मज़बूती से Meas पर hiPSC व्युत्पन्न neuronal नेटवर्क का उत्पादन अनुकूलित किया है, नेटवर्क परिपक्वता प्राप्त करने के लिए (जैसे, चैनलों के बहुमत से जुड़े तुल्यकालिक घटनाओं) तीसरे सप्ताह से। यह तेजी से और विश्वसनीय प्रोटोकॉल अलग (यानी रोगी विशेष) hiPSC लाइनों के साथ-साथ औषधीय अध्ययन के लिए मजबूत स्थिरता प्रदान से निकाली गई न्यूरॉन्स के बीच प्रत्यक्ष तुलना सक्षम होना चाहिए।

Protocol

सभी जानवरों पर प्रयोगों पशु की देखभाल समिति, Radboud विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर, नीदरलैंड, (: 77073 RU Dec, 2011-021, प्रोटोकॉल संख्या) की मंजूरी दे दी जानवरों की देखभाल और उपयोग के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. Glia सेल अलगाव और संस्कृति

नोट: यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल Vellis 19 मैकार्थी के काम पर और डी आधारित है, और माउस astrocytes के लिए एक बहुत ही इसी विस्तृत प्रोटोकॉल उपलब्ध 20 है। भ्रूण (E18) चूहे के दिमाग से cortical astrocytes के प्राथमिक संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए, एक गर्भवती चूहे का बलिदान करने की जरूरत है, भ्रूण गर्भाशय से काटा जा करने की जरूरत है, और दिमाग भ्रूण से अलग किए जाने की जरूरत है। एक T75 फ्लास्क भरने के लिए, 2 भ्रूण दिमाग से cortices संयुक्त होने की जरूरत है। एक विकल्प के रूप में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुद्ध और जमे हुए astrocytes खरीदा जा सकता है।

  1. T75 संस्कृति फ्लास्क तैयार
    1. पतला पाली-डी lysine (पीडीएल) मेंबाँझ, ultrapure 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पानी। पतला पीडीएल के 5 एमएल T75 संस्कृति फ्लास्क में जोड़े। बेंत की मार धीरे आसपास के पूरे विकास सतह गीला करने के लिए। 3 घंटे के लिए एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें।
    2. कुप्पी से पीडीएल aspirate। 5 एमएल बाँझ पानी के साथ कुप्पी 3x कुल्ला अपार पीडीएल हटा दें। पानी पूरी तरह से aspirate। कुप्पी छोड़ दो एक लामिना का प्रवाह हुड या तुरंत इस्तेमाल में सुखाने के लिए।
  2. Cortices के विच्छेदन
    1. 2% (वी / वी) बी 27 के पूरक के साथ Lebovitz एल 15 मध्यम: 50 एमएल विच्छेदन के माध्यम से तैयार। बर्फ पर रखें।
    2. एक प्रेरण कक्ष में चूहे isoflurane के साथ गहराई (छोटे Plexiglas बॉक्स) anesthetize जब तक श्वसन रहता है (~ 5 - 8 मिनट)। प्रेरण कक्ष से चूहे निकालें और तुरंत ग्रीवा अव्यवस्था से euthanized।
    3. 70% EtOH के साथ चूहे के पेट स्प्रे और अतिरिक्त पोंछ। बेनकाब और सीजेरियन secti के माध्यम से बांध से गर्भाशय हटानेकैंची 21 वर्ष की एक जोड़ी के प्रयोग पर।
    4. कैंची के साथ उनके एमनियोटिक थैलियों से व्यक्तिगत भ्रूण कट, ठंड विच्छेदन के माध्यम से भरा एक बाँझ पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण, और बर्फ पर रहते हैं।
    5. एक नया, बाँझ 6 सेमी पेट्री ठंड विच्छेदन मध्यम से भरा डिश के लिए फिर से भ्रूण स्थानांतरण। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण से दिमाग को निकालें। मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए, धीरे संदंश का उपयोग त्वचा और खोपड़ी दूर छील। धीरे पूरे मस्तिष्क बाहर निकालना और ताजा, ठंड विच्छेदन मध्यम के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण।
      नोट: पूरे दिमाग भ्रूण से विच्छेदित सेलुलर व्यवहार्यता को खोने के बिना कई घंटे के लिए बर्फ पर विच्छेदन माध्यम में संग्रहित किया जा सकता है।
    6. ठीक इत्तला दे दी वसंत कैंची या एक छुरी के साथ midline के माध्यम से काटने से प्रत्येक मस्तिष्क के दोनों गोलार्द्धों अलग करें। ध्यान से सीधे ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ तानिका बंद पट्टी।
      नोट: यह पूरी तरह से तानिका दूर करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। गुastrocyte संस्कृति का रोकता fibroblast संक्रमण है। Fibroblasts तेजी से कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं और अंत में अन्य कोशिकाओं विस्थापित होंगे।
    7. मध्यमस्तिष्क / स्ट्रिएटम और वसंत कैंची या एक छुरी के साथ घ्राण बल्ब निकालें। इसके अलावा हिप्पोकैम्पस (सी के आकार का संरचना है कि perimedian और कोर्टेक्स के लिए सम्मान के साथ दुम है) वसंत कैंची या एक छुरी के साथ दूर करने के लिए सुनिश्चित करें। 5 एमएल विच्छेदन के माध्यम से भरा एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में cortical गोलार्द्धों लीजिए। बर्फ पर रखें।
  3. Cortices की हदबंदी
    1. तैयार 2 एमएल सीए 2/2 मिलीग्राम + मुक्त हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) 0.25% trypsin के साथ (हदबंदी मध्यम)। 50 एमएल उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 15% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% के साथ (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (संस्कृति के माध्यम से) और फिल्टर बाँझ तैयार करें।
    2. ऊतक अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए तय है। सावधानी के रूप मेंऊतक ऊपर से संभव के रूप में विच्छेदन माध्यम के रूप में ज्यादा के समुद्री डाकू। 2 + / 2 मिलीग्राम + मुक्त HBSS (trypsin के बिना) 5 एमएल सीए के साथ ऊतक धो और ऊतक ट्यूब के नीचे व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. ध्यान से HBSS aspirate। 2 एमएल हदबंदी मध्यम जोड़ें और धीरे ट्यूब झटका ऊतक के आसपास एंजाइम मिश्रण करने के लिए। 5-10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं। ऊष्मायन के दौरान ट्यूब एक बार कुछ झाड़ ऊतक आंदोलन करने के लिए।
    4. इसके तत्काल बाद ऊतक एक 1000 μL विंदुक टिप का उपयोग triturate। के बारे में 800 μL को pipetter मात्रा निर्धारित करें। टुकड़े Aspirate और सीधे तरल पदार्थ रेखा से ऊपर ट्यूब के किनारे पर जबरदस्ती बेदखल। हालांकि, बुलबुले या झाग को कम करने की कोशिश करते हैं। दोहराएँ जब तक ऊतक पर्याप्त अलग है, के बारे में 15 - 20x। 8 एमएल संस्कृति के माध्यम trypsin निष्क्रिय करने के लिए जोड़ें। धीरे ट्यूब कई बार inverting द्वारा मिश्रण।
    5. एक 70 माइक्रोन सेल एक 50 मीटर के शीर्ष पर रखा झरनी के माध्यम से सेल निलंबन दर्राएल अपकेंद्रित्र ट्यूब। संस्कृति के माध्यम से 15 एमएल ट्यूब कुल्ला और सेल निलंबन के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम इकट्ठा करने के लिए सेल झरनी के माध्यम से मध्यम फिल्टर। सेल झरनी संस्कृति के माध्यम से एक बार कुछ कुल्ला। 25 एमएल - rinsing के बाद, अंतिम मात्रा के बारे में 20 होना चाहिए।
    6. 10 मिनट के लिए 200 XG पर गोली कोशिकाओं। ध्यान से जितना संभव हो उतना मध्यम aspirate, सेल गोली को छूने के बिना। एक 1000 μL पिपेट का उपयोग 1 एमएल मध्यम संस्कृति में कोशिकाओं Resuspend। 11 एमएल prewarmed संस्कृति के माध्यम जोड़ें और (बुलबुले को रोकने के लिए) धीरे मिश्रण एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग।
    7. 5 एमएल संस्कृति के माध्यम से एक बार पीडीएल लेपित T75 फ्लास्क कुल्ला। मध्यम Aspirate और फ्लास्क सेल निलंबन हस्तांतरण। सभी कोशिकाओं निलंबन चढ़ाया जाता है में हैं, और हम यह आम तौर पर अनावश्यक, उन्हें गिनती करने के बाद से astrocytes निलंबन में अन्य कोशिकाओं से भेदभाव नहीं किया जा सकता हैं। के 5% सीओ 2 च माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कुप्पी की जगहया दो दिनों के लिए।
  4. विस्तार और astrocytes के रखरखाव
    1. के लिए प्रारंभिक चढ़ाना के बाद पहली बार 2 डी पूरे मध्यम बदलें। पूरे मध्यम बदलें बाद में हर 3 डी। हमेशा की कोशिकाओं को जोड़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक ताजा माध्यम prewarm।
      नोट: astrocytes की आवश्यकता 7 - लगभग 90% confluency (astrocytes microglia और oligodendrocytes शीर्ष पर झूठ बोल रही है और intermixed के साथ, एक घनी पैक tessellated monolayer के रूप में दिखाई देते हैं) तक पहुंचने के लिए 10 घ।
    2. astrocytes लगभग 90% confluency तक पहुँचते हैं, दूषित glial कोशिकाओं को हटाने के लिए कुप्पी हिला:
      1. इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और टोपी (phenolic) कसने या बंदरगाह कवर (फ़िल्टर्ड)। microglia निकालने के लिए, 1 घंटे के लिए 180 rpm पर एक कक्षीय मंच पर कुप्पी हिला। मध्यम aspirate। 5 एमएल पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से, महाप्राण के साथ एक बार कुल्ला और 12 एमएल संस्कृति के माध्यम के साथ बदलें।
      2. दूर करना।oligodendrocytes, फ्लास्क कक्षीय मंच करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस 7 घंटा की एक न्यूनतम के लिए हे / एन लौटने और 250 rpm पर हिला, लेकिन अधिमानतः।
      3. मध्यम aspirate। 5 एमएल पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से, महाप्राण के साथ एक बार कुल्ला और 12 एमएल संस्कृति के माध्यम के साथ बदलें। इनक्यूबेटर कुप्पी लौटें।
      4. 3 करने के लिए 1: 2 0.05% trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ जब 100% मिला हुआ, मानक प्रक्रियाओं का उपयोग astrocytes 1 के अनुपात में विभाजित है। 100% confluency पर एक T75 कुप्पी आम तौर पर कुल में लगभग 4.0 x 10 6 कोशिकाओं निकलेगा। इस कार्यक्रम के तहत, संस्कृतियों आम तौर पर प्रति सप्ताह में एक बार विभाजित किया जा सकता है।
        नोट: astrocytes confluency तक पहुँचते हैं, वे काटा और के रूप में प्रोटोकॉल 3.4 कदम में नीचे वर्णित hiPSC भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। astrocytes व्यवहार्यता का एक महत्त्वपूर्ण बिना किसी नुकसान के कम से कम एक बार विभाजित किया जा सकता है। वे संस्कृति में अप करने के लिए 2 महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है। अनुभव से, प्राथमिक भ्रूण दिन 18 चूहे astrocytes progressively टर्मिनली विभेदित हो जाते हैं और / या दोहराया बंटवारे के बाद व्यवहार्यता खो देते हैं। हालांकि यह भविष्य में उपयोग के लिए astrocytes फ्रीज करने के लिए संभव है, जब हम आवश्यक ताजा भ्रूण दिमाग से astrocytes को अलग-थलग करने के लिए पसंद करते हैं।

2. rtTA की पीढ़ी / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs

नोट: reprogramming के साथ कारकों cMYC, Sox2, OCT4 और KLF4 हमारे प्रयोगों के लिए इस्तेमाल hiPSCs मानव fibroblasts की lentiviral पारगमन द्वारा घर में उत्पन्न किया गया।

नोट: rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs की पीढ़ी के लिए, lentiviral वैक्टर स्थिरतापूर्वक hiPSCs के जीनोम में ट्रांसजीन एकीकृत करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Lentivirus के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल पहले से 22 प्रकाशित किया गया है। Lentiviral वैक्टर पैकेजिंग कि rtTA और Ngn2 lentivirus कणों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं के विवरण में प्रदान की जाती हैं rtTA lentivirus के लिए इस्तेमाल किया वेक्टर pLVX-EF1α- है (TET-ऑन-उन्नत) -IRES-G418 (आर); यानी इस सदिश एंटीबायोटिक G418 के लिए एक प्रतिरोध एक विधान EF1α प्रमोटर के नियंत्रण के तहत उन्नत transactivator Tet पर और प्रदान encodes। हस्तांतरण Ngn2 lentivirus के लिए इस्तेमाल किया वेक्टर है pLVX- (TRE-thight) - (माउस) Ngn2-PGK-puromycin (आर); यानी इस सदिश murine neurogenin-2 एक विधान PGK प्रमोटर के नियंत्रण के तहत puromycin प्रतिरोध जीन एक Tet नियंत्रित प्रमोटर के नियंत्रण के तहत और के लिए जीन encodes। इसलिए, इन दो हस्तांतरण वैक्टर का उपयोग करके, एक hiPSC लाइन बनाया जा सकता है जिसके लिए murine neurogenin -2 की अभिव्यक्ति डॉक्सीसाइक्लिन के साथ मध्यम सप्लीमेंट द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। HiPSCs के पारगमन के लिए, lentivirus कणों के साथ सतह पर तैरनेवाला प्रयोग किया जाता है, यानी बुद्धि (पाठ के शेष में 'lentivirus निलंबन' के रूप में)Hout ultracentrifugation का उपयोग कर कणों ध्यान दे।

  1. प्लेट hiPSCs (1 दिन)
    नोट: संस्करणों है कि इस प्रोटोकॉल में उल्लेख कर रहे हैं कि मान hiPSCs एक 6 अच्छी तरह से थाली में संवर्धित कर रहे हैं और एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को काटा जाता है। इसके अलावा, यह माना जाता है कि कोशिकाओं को एक 12 अच्छी तरह से थाली के 12 कुओं में बाद में चढ़ाया जाता है।
    1. पतला BMM प्राप्त करने के लिए 1% (वी / वी) तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (BMM) के साथ 10 एमएल ठंड DMEM / F12 तैयार करें। 800 एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से BMM पतला μL जोड़ें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कम से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं। उपयोग से पहले, आरटी पर 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
    2. 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 9 एमएल DMEM / F12 और कमरे के तापमान पर 1 एमएल सेल टुकड़ी समाधान (सीडीएस) के साथ गर्म 15 एमएल आवश्यक 8 (E8) मध्यम। साथ रो जुड़े प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोध E8 मध्यम अनुपूरक।
    3. hiPSCs का खर्च मध्यम Aspirate एकडी hiPSCs के लिए 1 एमएल सीडीएस जोड़ें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट - 3 सेते हैं। माइक्रोस्कोप के नीचे की जाँच कोशिकाओं को एक दूसरे से अलग करने के लिए कि क्या कर रहे हैं।
    4. कुएं में 2 एमएल DMEM / F12 जोड़ें, धीरे से एक 1,000 μL विंदुक के साथ कोशिकाओं को निलंबित और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण। सेल निलंबन के लिए 7 एमएल DMEM / F12 जोड़ें। 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
    5. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और तैयार E8 के माध्यम से 2 एमएल जोड़ने। एक सेल निलंबन जिसमें hiPSCs अलग कर रहे हैं (सेल clumps फार्म नहीं है) 15 एमएल ट्यूब के पक्ष के खिलाफ एक 1000 μL पिपेट की नोक लगा और धीरे कोशिकाओं resuspending द्वारा प्राप्त करते हैं। माइक्रोस्कोप कि क्या कोशिकाओं अलग कर रहे हैं के तहत की जाँच करें।
    6. कोशिकाओं (कोशिकाओं / एमएल) एक hemocytometer कक्ष का उपयोग की संख्या निर्धारित करते हैं।
      नोट: 80 पर एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से - कुल में 4.0 x 10 6 कोशिकाओं - 90% confluency आम तौर पर 3.0 निकलेगा।
    7. महाप्राण12 अच्छी तरह से थाली के कुओं से BMM पतला। 3.0 x 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं पतला। प्लेट 1 12 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के एमएल। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली हे / एन रखें।
  2. RtTA और Ngn2 lentivirus के साथ आईपीएस कोशिकाओं transduce (2 दिन)
    1. 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन कमरे के तापमान को साथ गर्म 12 एमएल E8 माध्यम। 8 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता E8 मध्यम करने के लिए रॉक अवरोध और polybrene साथ E8 मध्यम अनुपूरक।
    2. lentivirus निलंबन के साथ aliquots गला लें। lentivirus निलंबन के लिए 8 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए polybrene जोड़ें। खर्च मध्यम Aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए तैयार E8 माध्यम के 1 एमएल जोड़ने।
    3. और Ngn2 -lentivirus निलंबन - rtTA के विभिन्न मात्रा के साथ पारगमन प्रदर्शन करना। उदाहरण के लिए, transdu12 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए दोनों rtTA -lentivirus और Ngn2 -lentivirus निलंबन के 100 μL जोड़कर hiPSCs सीई। अन्य कुओं के लिए, 200 μL, 300 μL, 400 μL और 500 μL lentivirus के बजाय निलंबन 100 μL का उपयोग करें। 12 अच्छी तरह से थाली के दो कुओं की hiPSCs transduced नहीं किया जाना चाहिए; वे चयन के दौरान नियंत्रण के रूप में काम करेगा।
      ध्यान दें: transductions अधिमानतः, दो प्रतियों में प्रदर्शन कर रहे हैं इतना है कि पारगमन दक्षता चयन की शुरुआत के बाद और अधिक सही अनुमान लगाया जा सकता है (प्रोटोकॉल कदम 2.2.4 देखें)। lentivirus निलंबन की राशि है कि कुशलतापूर्वक hiPSCs के बहुमत transduce के लिए आवश्यक है lentivirus निलंबन और hiPSC लाइन है कि प्रयोग किया जाता है की अनुमापांक पर निर्भर करता है। lentivirus निलंबन के 500 μL hiPSCs transduce के लिए - इस अध्ययन में, हम आम तौर पर 100 का उपयोग करें।
    4. 5% सीओ का माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली की जगह6 घंटे के लिए 2। 6 घंटे ऊष्मायन अवधि के अंत से पहले, 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 12 के साथ गर्म 12 एमएल E8 मध्यम एमएल Dulbecco फास्फेट बफर खारा (DPBS) आरटी के लिए। रॉक अवरोध करनेवाला के साथ E8 मध्यम अनुपूरक।
    5. बिताए E8 मध्यम aspirate। 1 एमएल DPBS के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक को धो लें। तैयार E8 माध्यम के 1 एमएल प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली हे / एन रखें।
  3. ताज़ा करे E8 मध्यम (3 दिन)
    1. 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन आरटी के साथ गर्म 12 एमएल E8 माध्यम। 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं से खर्च मध्यम Aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए तैयार E8 माध्यम के 1 एमएल जोड़ने। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली हे / एन रखें।
  4. Puromycin और G418 (- 8 दिन 4) के साथ चयन को पूरा करें
    नोट: कूल्हे की कोशिका विभाजन दर पर निर्भर करता हैचयन अवधि, जो बिंदु पर संस्कृतियों को विभाजित करने की आवश्यकता के दौरान 80% confluency - अनुसूचित जाति लाइन और lentiviral पारगमन की दक्षता, कोशिकाओं को 70 तक पहुंच सकता है। क्योंकि बंटवारे के समय अग्रिम में भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, यह प्रोटोकॉल में उल्लेख नहीं किया जाएगा। हालांकि, बजाय E8 मध्यम puromycin और G418 का उल्लेख सांद्रता के साथ पूरक ताज़ा करने के लिए, एक hiPSC संस्कृति (vitronectin में लिपटे प्लेटों पर चढ़ाना कोशिकाओं सहित) एक सामान्य hiPSC संस्कृति के रूप में विभाजित कर सकते हैं। एकमात्र अपवाद है कि E8 मध्यम चयन जारी रखने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं का उल्लेख सांद्रता के साथ पूरक होना चाहिए।
    1. 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन कमरे के तापमान को साथ गर्म 12 एमएल E8 माध्यम। चयन के लिए puromycin और G418 जोड़ें; एंटीबायोटिक दवाओं के विभिन्न मात्रा के चयन की अवधि (तालिका 1) के दौरान जोड़ रहे हैं।
    2. G418- और puromycin के प्रतिशत का आकलन करके पारगमन की दक्षता का अनुमानप्रतिरोधी कोशिकाओं। प्रतिरोधी कोशिकाओं के प्रतिशत का अनुमान करने के लिए, अलग अलग परिस्थितियों (संस्कृतियों lentivirus निलंबन के विभिन्न मात्रा के साथ ट्रांसड्यूस) के लिए मृत कोशिकाओं का प्रतिशत (nonresistant कोशिकाओं) का अनुमान है और nontransduced कोशिकाओं (कोशिकाओं है कि एक चयन नियंत्रण के रूप में सेवा) के लिए। [- (मृत कोशिकाओं का प्रतिशत) 100%] के रूप में प्रतिरोधी कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना।
      नोट: lentivirus निलंबन के विभिन्न मात्रा के साथ transductions दो प्रतियों में प्रदर्शन किया गया, तो पारगमन दक्षता और अधिक सही अनुमान लगाया जा सकता है। गैर transduced कोशिकाओं के साथ हालत एक चयन नियंत्रण के रूप में कार्य करता है; संस्कृतियों lentivirus निलंबन के विभिन्न मात्रा के साथ ट्रांसड्यूस के लिए मृत कोशिकाओं का प्रतिशत कम होना चाहिए। प्रतिरोधी कोशिकाओं की अनुमानित प्रतिशत hiPSCs की संभावना है कि दोनों transgenes के लिए सकारात्मक रहे हैं चुनने के लिए प्रयोग किया जाता है। सामान्य तौर पर, हम चुन पारगमन हालत से hiPSCs थे सेल के> 90%एस 5 डी चयन अवधि जीवित रहते हैं।
    3. hiPSCs का खर्च मध्यम Aspirate और कुओं के लिए तैयार E8 माध्यम के 1 एमएल जोड़ने। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली हे / एन रखें।
G418 के अंतिम एकाग्रता Puromycin के अंतिम एकाग्रता
4 दिन 250 माइक्रोग्राम / एमएल 2 माइक्रोग्राम / एमएल
दिन 5 250 माइक्रोग्राम / एमएल 2 माइक्रोग्राम / एमएल
दिन 6 250 माइक्रोग्राम / एमएल 1 माइक्रोग्राम / एमएल
7 दिन 250 माइक्रोग्राम / एमएल 1 माइक्रोग्राम / एमएल
दिवस 8 250 माइक्रोग्राम / एमएल 1 माइक्रोग्राम / एमएल

तालिका 1: चयन अवधि के दौरान एंटीबायोटिक्स की सांद्रता।

  1. चयन करना बंद करो और नियमित रूप से संवर्धन (दिन 9 और बाद में) शुरू
    1. 5 डी चयन अवधि, संस्कृति सामान्य रूप hiPSCs rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs, अपवाद है कि कोशिकाओं के E8 मध्यम 50 ग्राम के अंतिम एकाग्रता / एमएल और puromycin के साथ की एक अंतिम एकाग्रता के लिए G418 के साथ पूरक है के साथ के बाद 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल।
      नोट: कोशिकाओं को अब एक बैकअप के रूप में सेवा करने के लिए (कोशिकाओं की cryopreservation के लिए मानक प्रोटोकॉल के अनुसार) जमे हुए किया जा सकता है। यह भेदभाव प्रोटोकॉल के reproducibility के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह कई भविष्य भेदभाव प्रयोगों के लिए rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs के एक ही बैच के उपयोग की अनुमति देता है।

3. 6 अच्छी तरह पर न्यूरॉन्स के लिए rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs के भेदभावMeas और ग्लास Coverslips

नोट: इस प्रोटोकॉल में, जानकारी के लिए दो अलग अलग substrates, यानी 6 अच्छी तरह से Meas और कांच coverslips (9 रिकॉर्डिंग और 1 संदर्भ में अच्छी तरह से प्रति एम्बेडेड microelectrodes के साथ 6 स्वतंत्र कुओं से बना उपकरणों) पर rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs फर्क के लिए प्रदान की जाती हैं 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं। प्रोटोकॉल, हालांकि, आसानी से बड़े substrates के लिए (जैसे, 12 या 6 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं के लिए), अनुकूलित किया जा सकता सतह क्षेत्र के अनुसार उल्लेख मूल्यों को स्केलिंग द्वारा।

  1. Meas या कांच coverslips (0 दिन और दिन 1) तैयार
    1. दिन भेदभाव की शुरुआत से पहले, निर्माता की सिफारिश के अनुसार Meas बाँझ।
    2. आसंजन प्रोटीन पाली एल ओर्निथिन (पीएलओ) बाँझ ultrapure पानी में एक अंतिम एकाग्रता 50 माइक्रोग्राम / एमएल पतला। कोट एक 100 μL रखकर 6 अच्छी तरह से Meas के सक्रिय इलेक्ट्रोड क्षेत्रप्रत्येक कुएं में पतला पीएलओ के ड्रॉप। 24 अच्छी तरह से थाली बाँझ चिमटी का उपयोग कर के कुओं में coverslips रखें। पतला पीएलओ के 800 μL प्रत्येक कुएं में जोड़ें। उन्हें 1000 μL विंदुक टिप के साथ नीचे धक्का द्वारा फ्लोटिंग से coverslips रोकें।
    3. 5% सीओ 2 के माहौल के साथ 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली हे / एन एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं। अगले दिन, पतला पीएलओ aspirate। 6 अच्छी तरह से Meas की कांच की सतहों और coverslips बाँझ ultrapure पानी के साथ दो बार धोएं।
    4. (6 अच्छी तरह से Meas के लिए) 20 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता और (कांच coverslips के लिए) 10 माइक्रोग्राम / एमएल ठंड DMEM / F12 में laminin पतला। इसके तत्काल बाद कोट प्रत्येक में 100 μL बूंद अच्छी तरह से रखने से 6 अच्छी तरह से Meas के सक्रिय इलेक्ट्रोड क्षेत्र। इसी तरह, 400 μL पतला laminin की 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में कोट करने के लिए coverslips जोड़ें। उन्हें 1,000 μL विंदुक टिप के साथ नीचे धक्का द्वारा फ्लोटिंग से coverslips रोकें।
    5. 5% सीओ 2 के माहौल में कम से कम 2 घंटे के लिए के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली सेते हैं।
  2. प्लेट hiPSCs (1 दिन)
    नोट: संस्करणों है कि कदम 3.2.1 में उल्लेख कर रहे हैं - 3.2.4 मान लेते हैं कि rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs 6 अच्छी तरह से थाली में सुसंस्कृत हैं और एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को काटा जाता है। संस्करणों है कि 6 अच्छी तरह से Meas और / या coverslips पर चढ़ाना कोशिकाओं के लिए आवश्यक हैं 6 अच्छी तरह से Meas और / या coverslips कि प्रयोग में इस्तेमाल कर रहे हैं की संख्या की संख्या पर निर्भर करता है; संख्या कदम 3.2.6 में निर्दिष्ट - 3.2.8 अलग प्रयोग आकार के लिए स्केलिंग अनुमति देते हैं।
    1. गर्म DMEM / F12, सीडी और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन आर / टी के साथ E8 माध्यम। 4 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता और E8 मध्यम रॉक अवरोध को डॉक्सीसाइक्लिन जोड़ें।
    2. RtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSCs का खर्च मध्यम Aspirate और 1 मीटर जोड़नेएल hiPSCs करने के लिए सीडी। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 मिनट - 3 सेते हैं। माइक्रोस्कोप के नीचे की जाँच कोशिकाओं को एक दूसरे से अलग करने के लिए कि क्या कर रहे हैं।
    3. कुएं में 2 एमएल DMEM / F12 जोड़ें, धीरे से एक 1,000 μL विंदुक के साथ कोशिकाओं को निलंबित और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण। सेल निलंबन के लिए 7 एमएल DMEM / F12 जोड़ें। 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
    4. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और तैयार E8 के माध्यम से 2 एमएल जोड़ने। 15 एमएल ट्यूब के पक्ष के खिलाफ एक 1000 μL पिपेट की नोक लगा और धीरे कोशिकाओं resuspending द्वारा hiPSCs अलग कर देना। माइक्रोस्कोप कि क्या कोशिकाओं अलग कर रहे हैं के तहत की जाँच करें।
    5. कोशिकाओं (कोशिकाओं / एमएल) एक hemocytometer कक्ष का उपयोग की संख्या निर्धारित करते हैं।
      नोट: 80 पर एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से - कुल में 4.0 x 10 6 कोशिकाओं - 90% confluency आम तौर पर 3.0 निकलेगा।
    6. पतला laminin aspirate। 6 अच्छी तरह से Meas के लिए, एक सीई प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को कमजोर7.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के डालूँगा निलंबन। 6 अच्छी तरह से Meas के प्रत्येक कुएं में सक्रिय इलेक्ट्रोड क्षेत्र पर सेल निलंबन के 100 μL की एक बूंद जोड़कर कोशिकाओं थाली। Coverslips के लिए, 4.0 x 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को कमजोर। 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए सेल निलंबन के 500 μL जोड़कर कोशिकाओं थाली।
      नोट: Meas पर अंतिम सेल घनत्व coverslips (चित्रा 1 ए और बी) पर की तुलना में अधिक है। हमने पाया है कि इस उच्च घनत्व सेल नेटवर्क गतिविधि का उचित रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक था। प्रोटोकॉल में, संख्या प्रदान की जाती हैं कि बाहर कर दिया assays के लिए इष्टतम किया जाना है।
    7. 5% सीओ 2 का माहौल 2 एच (MEAS) या हे / एन (24 अच्छी तरह से थाली) के लिए के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली रखें।
    8. 2 घंटे के बाद, ध्यान से 6 अच्छी तरह से Meas के प्रत्येक अच्छी तरह से तैयार E8 माध्यम के 500 μL जोड़ें। 6-हम जगहMeas करूँगा हे / 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एन।
  3. (2 दिन) मध्यम बदलें
    1. अगले दिन, 1% (वी / वी) एन 2 के पूरक, 1% (वी / वी) गैर आवश्यक अमीनो एसिड और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ DMEM / F12 तैयार करते हैं। जोड़े मानव पुनः संयोजक neurotrophin-3 (NT-3) 10 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी / एमएल, पुनः संयोजक मानव मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) के अंतिम एकाग्रता, और 4 माइक्रोग्राम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए डॉक्सीसाइक्लिन के लिए / एमएल। 37 डिग्री सेल्सियस तक मध्यम गर्म।
    2. मध्यम से 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए laminin जोड़ें। जिसके परिणामस्वरूप मध्यम फ़िल्टर। 6 अच्छी तरह से Meas के कुओं से खर्च मध्यम और 24 अच्छी तरह से थाली Aspirate और तैयार मध्यम के साथ बदलें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली हे / एन एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
  4. चूहे astrocytes जोड़ें (3 दिन)
    नोट: संस्करणों है कि इस प्रोटोकॉल में उल्लेख कर रहे हैं कि मान चूहे astrocytes T75 संस्कृति बोतल में सुसंस्कृत हैं। यह महत्वपूर्ण है कि चूहे astrocytes संस्कृतियों के लिए जोड़ रहे हैं कि अच्छी गुणवत्ता के हैं। हम अगर चूहे astrocytes अच्छी गुणवत्ता के हैं जाँच करने के लिए दो मापदंडों का उपयोग करें। सबसे पहले, चूहे astrocyte संस्कृति चूहा भ्रूण दिमाग से अलगाव के बाद दस दिनों के भीतर मिला हुआ विकसित करने के लिए सक्षम होना चाहिए। दूसरा, चूहे astrocyte संस्कृति बंटवारे के बाद, चूहे astrocytes मिला हुआ, tessellated monolayer (चित्रा 1 सी) के रूप में करने में सक्षम होना चाहिए। चूहे astrocyte संस्कृति इन दो मानदंडों को पूरा नहीं करता है, तो हम भेदभाव प्रयोगों के लिए इस संस्कृति का उपयोग नहीं करने की सलाह है।
    1. गर्म 0.05% आरटी के लिए trypsin-EDTA। 37 डिग्री सेल्सियस (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 1% के साथ DPBS और DMEM / F12 गर्म।
    2. चूहे astrocyte संस्कृति का खर्च मध्यम aspirate। 5 एमएल DPBS जोड़कर संस्कृति को धो लें और धीरे आसपास बेंत की मार।
    3. AspirDPBS खाया और 5 एमएल 0.05% trypsin EDTA जोड़ें। धीरे चारों ओर trypsin-EDTA बेंत की मार। 10 मिनट - 5% सीओ 2 का माहौल 5 के लिए के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
    4. माइक्रोस्कोप कि क्या कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं के तहत की जाँच करें। कुप्पी एक बार कुछ मार से पिछले कोशिकाओं को अलग करें।
    5. DMEM / F12 के 5 एमएल कुप्पी में जोड़े। एक 10 एमएल विंदुक के साथ कुप्पी के अंदर धीरे कोशिकाओं Triturate। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए। 8 मिनट के लिए 200 XG पर ट्यूब स्पिन।
    6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और DMEM / F12 के 1 एमएल में कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं (कोशिकाओं / एमएल) एक hemocytometer कक्ष का उपयोग की संख्या निर्धारित करते हैं।
    7. 6 अच्छी तरह से Meas की अच्छी तरह से प्रति 7.5 x 10 4 astrocytes जोड़ें। 24 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति 2.0 x 10 4 astrocytes जोड़ें। Meas और 24 अच्छी तरह से थाली हे सेते / एन 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में।
  5. (4 दिन) मध्यम बदलें
      नोट: साइटोसिन β डी arabinofuranoside माध्यम से जोड़ा जाता है astrocyte प्रसार को बाधित करने के लिए और शेष hiPSCs कि न्यूरॉन्स में फर्क नहीं कर रहे हैं को मारने के लिए।
    1. मध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म फ़िल्टर। 6 अच्छी तरह से Meas के कुओं से खर्च मध्यम और 24 अच्छी तरह से थाली Aspirate और तैयार मध्यम के साथ बदलें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली बनाए रखें।
  6. (6 दिन - 28) मध्यम ताज़ा करें
    नोट: 6 दिन से शुरू, ताज़ा आधामध्यम से हर दो दिन। बाद दिन 10 से, मध्यम astrocyte व्यवहार्यता का समर्थन करने के FBS के साथ पूरक है।
    1. 2% (वी / वी) बी -27 पूरक, 1% (वी / वी) एल alanyl-एल glutamine और 1% (वी / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ Neurobasal मध्यम तैयार। 4 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी / एमएल, और डॉक्सीसाइक्लिन के अंतिम एकाग्रता के लिए 10 एनजी / एमएल, BDNF के अंतिम एकाग्रता के लिए NT-3 जोड़े। दिन 10 के बाद से, यह भी 2.5% (v / v) FBS के साथ मध्यम पूरक। जिसके परिणामस्वरूप मध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म फ़िल्टर।
    2. 6 अच्छी तरह से Meas के कुओं और 24 अच्छी तरह से थाली एक 1000 μL पिपेट का उपयोग करने से खर्च मध्यम के आधे निकालें और तैयार मध्यम के साथ बदलें। 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से Meas और 24 अच्छी तरह से थाली बनाए रखें।

4. hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की neurophysiological प्रोफ़ाइल स्थापित

नोट: के बाद दो से तीन सप्ताहभेदभाव के duction, hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स अलग बहाव के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस खंड में, कुछ नीचे की ओर विश्लेषण के उदाहरण दिए गए हैं कि hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की neurophysiological प्रोफ़ाइल स्थापित करने के लिए किया जा सकता है।

  1. Meas का उपयोग कर न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधि विशेषताएँ
    1. रिकार्ड 20 Meas पर संवर्धित hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की electrophysiological गतिविधि के मिनट। रिकॉर्डिंग के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखने, और विदेश मंत्रालय पर humidified गैस (5% सीओ 2, 20% हे 2, 75% एन 2) के एक निरंतर, धीमी गति से प्रवाह inflating द्वारा माध्यम के वाष्पीकरण और पीएच परिवर्तन को रोकने ।
    2. 1200x प्रवर्धन (विदेश मंत्रालय 1060, एमसीएस) के बाद, 10 kHz पर संकेत नमूना एमसीएस डाटा अधिग्रहण कार्ड का उपयोग कर। डेटा (कील और फट पता लगाने) एक कस्टम सॉफ्टवेयर पैकेज 23 का उपयोग कर विश्लेषण।
  2. एकल कोशिका electrophysiological गतिविधि विशेषताएँ
  3. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप में एक जलमग्न तय चरण रिकॉर्डिंग कक्ष hiPSC व्युत्पन्न neuronal संस्कृतियों युक्त कवर फिसल जाता स्थानांतरण। रिकार्ड 20 सहज कार्रवाई संभावित पैदा पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं (sEPSC) 24 मिनट। neuroscientific प्रोग्राम का उपयोग synaptic घटना का पता लगाने।
  • न्यूरोनल आकृति विज्ञान और synapsin अभिव्यक्ति की विशेषताएँ
    1. फिक्स और MAP2 के लिए hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स दाग, synapsin-1/2, और PSD-95 22, 24, 25। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर synapsin-1/2 और PSD-95 puncta की संख्या यों।

    • Representative Results

    यहाँ हम सफलतापूर्वक एक प्रोटोकॉल जिसमें hiPSCs प्रतिलेखन कारक neurogenin -2 12 से अधिक व्यक्त द्वारा cortical न्यूरॉन्स में सीधे भेदभाव कर रहे हैं संशोधित किया है और हम Meas के उपयोग के लिए यह ढाल लिया है। यह दृष्टिकोण तेज और कुशल हमें भेदभाव के शामिल होने के बाद तीसरे सप्ताह के दौरान पहले से ही कार्यरत न्यूरॉन्स और नेटवर्क गतिविधि प्राप्त करने की अनुमति है।

    भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान कोशिकाओं आकृति विज्ञान न्यूरॉन्स समान शुरू: छोटे प्रक्रियाओं का गठन किया गया और न्यूरॉन्स एक दूसरे को (चित्रा 1 ए) को जोड़ने के लिए शुरू कर दिया। हम विकास के दौरान उनके न्यूरोनल आकृति विज्ञान और synaptic गुणों को मापने के द्वारा, एक स्वस्थ नियंत्रण hiPSC लाइन से निकाली गई न्यूरॉन्स की एक neurophysiological प्रोफ़ाइल की स्थापना की। hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स शुरू होने के बाद अलग अलग दिनों पर MAP2 और synapsin-1/2 के लिए दाग थेभेदभाव (2A चित्रा) के। निकाली गई न्यूरॉन्स 3 सप्ताह भेदभाव के शामिल होने के बाद पहले से ही परिपक्व न्यूरोनल आकृति विज्ञान दिखा। synapsin -1 / 2 puncta (synapses की संख्या के लिए एक उपाय) की संख्या synapsin -1 / 2 immunocytochemistry stainings पर आधारित मात्रा निर्धारित किया गया था। Synapsin -1 / 2 puncta की संख्या समय के साथ वृद्धि हुई है, सुझाव है कि न्यूरोनल कनेक्टिविटी का स्तर भी बढ़ रही है (चित्रा 2 बी)। Synapsin -1 / 2 puncta 23 दिनों भेदभाव के शामिल होने के बाद की संख्या दो स्वतंत्र आईपीएस लाइनों (चित्रा -2) में इसी तरह की थी। 23 DIV सबसे synapsin1 / 2 puncta पर PSD-95 puncta, जो कार्यात्मक synapses (चित्रा 2 डी) के लिए संकेत है juxtaposed थे।

    झांग एट अल द्वारा वर्णित परिणामों के साथ संगत।, हम उत्तेजक ऊपरी परत cortical न्यूरॉन्स की आबादी, अखिल neuronal और उप प्रकार विशेष cortical मीटर से इसकी पुष्टि उत्पन्न ऐसे BRN2 और SATB2 रूप arkers (परत द्वितीय / तृतीय)। हम न्यूरॉन्स कि गहरी परत न्यूरॉन्स CTIP2 (परत वी) या Foxp2 (परत हमने) (चित्रा 2 ई और एफ) के लिए सकारात्मक थे पालन नहीं किया था

    HiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की electrophysiological गतिविधि को चिह्नित करने के लिए, हम इन न्यूरॉन्स के विकास के दौरान मापा गया पर पूरे सेल वर्तमान और वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग, यानी आंतरिक गुणों और उत्तेजक इनपुट इस्तेमाल किया। न्यूरॉन्स भेदभाव और कोशिकाओं spiking के प्रतिशत के समय (चित्रा 2 जी और एच) से अधिक बढ़ गया था के बाद कार्रवाई की क्षमता पहले से ही एक सप्ताह उत्पन्न करने में सक्षम थे। इसके अलावा, न्यूरॉन्स भेदभाव के शामिल होने के बाद एक सप्ताह पहले से ही उत्तेजक synaptic इनपुट प्राप्त किया: दोनों आवृत्ति और उत्तेजक synaptic इनपुट के आयाम विकास के दौरान वृद्धि हुई (चित्रा 2I - कश्मीर)।

    NT "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> बेहतर कैसे एकल कोशिका गतिविधि नेटवर्क स्तर के कार्यों के लिए फार्म को जोड़ती है समझने के लिए, यह अध्ययन करने के लिए कैसे न्यूरॉन्स मिलकर काम जरूरी है Meas पर इन विट्रो neuronal नेटवर्क सुसंस्कृत। न्यूरोनल गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक मॉडल बनाते हैं। हम भेदभाव के शामिल होने के बाद 6 अच्छी तरह से Meas (चित्रा 2 एम) पर एक स्वस्थ नियंत्रण रेखा hiPSC सुसंस्कृत से निकाली गई न्यूरॉन्स की electrophysiological नेटवर्क गतिविधि के 20 मिनट दर्ज की गई। कुछ हफ्तों, न्यूरॉन्स स्वस्थ नियंत्रण hiPSCs से निकाली गई कार्यात्मक सक्रिय neuronal नेटवर्क का गठन, सहज घटनाओं (0.62 ± 0.05 कील / एस, चित्रा 2N) दिखा। (यानी भेदभाव की शुरुआत के बाद 16 डी) के विकास के इस स्तर पर कोई तुल्यकालिक सभी चैनलों से जुड़े घटनाओं । के Meas पता चला रहे हैं (चित्रा 2O) नेटवर्क गतिविधि के स्तर के विकास के दौरान वृद्धि हुई: टी के बाद चौथे सप्ताह के दौरान डिवाइस के सभी कुओं में, (चित्रा 2N 2.5 ± 0.1 कील / s) वह भेदभाव की प्रेरण, neuronal नेटवर्क सहज गतिविधि के उच्च स्तर से पता चला है। नेटवर्क भी प्रदर्शित तुल्यकालिक नेटवर्क फटने (4.1 ± 0.1 फट / मिनट, चित्रा 2O) लंबी अवधि के साथ (2100 ± 500 एमएस)।

    आकृति 1
    चित्रा 1: न्यूरॉन्स में hiPSC भेदभाव। Coverslips पर न्यूरॉन्स में hiPSCs भेदभाव के ए थ्री समय अंक। Meas पर hiPSCs के बी चढ़ाना। T75 फ्लास्क में 100% confluency पर सी astrocytes (ध्यान दें कि कोशिकाओं को एक tessellated monolayer फार्म)। स्केल सलाखों: 150 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    e_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र 2
    चित्रा 2. hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स विशेषता। ए hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स भेदभाव की शुरुआत के बाद MAP2 (हरा) और synapsin-1/2 (लाल) अलग अलग दिनों पर के लिए दाग रहे थे। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन। दो स्वतंत्र प्रयोगों में synapsin puncta के बी मात्रा। प्रत्येक प्रयोगों में कम से कम 10 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। दो स्वतंत्र आईपीएस लाइनों से निकाली गई न्यूरॉन्स में DIV23 पर synapsin puncta के सी मात्रा। डी hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स PSD-95 (हरा) के लिए दाग रहे थे और भेदभाव की शुरुआत के बाद synapsin-1/2 (लाल), 23 दिनों के लिए। Synapsin puncta PSD-95 puncta को juxtaposed हैं। ई hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स MAP2 (हरा) और BRN2 (लाल) या SATB2 (लाल) 23 डी भेदभाव की शुरुआत के बाद के लिए दाग रहे थे। MAP2 सकारात्मक कोशिकाओं की एफ प्रतिशत है किसंकेत दिया मार्करों के लिए सकारात्मक थे। जी प्रतिनिधि वर्तमान दबाना है कि कार्रवाई की क्षमता दिखा रिकॉर्डिंग के रूप में जल्दी के रूप में 7 डी भेदभाव की शुरुआत के बाद उत्पन्न किया जा सकता है। भेदभाव के शामिल होने के बाद अलग अलग दिनों जो एक या अधिक कार्रवाई क्षमता दिखाने पर कोशिकाओं के एच प्रतिशत। मैं उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं (EPSCs) भेदभाव के बाद अलग अलग दिनों पर hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स द्वारा प्राप्त की प्रतिनिधि निशान। विकास के दौरान उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं के जे आवृत्ति। विकास के दौरान उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं के लालकृष्ण आयाम। एल प्रतिनिधि के बिना (नियंत्रण) और CNQX (CNQX) के साथ EPSC रिकॉर्डिंग के निशान। एम न्यूरॉन्स एक hiPSC लाइन से निकाली गई 6 अच्छी तरह से विदेश मंत्रालय पर सुसंस्कृत थे और नेटवर्क गतिविधि hiPSC व्युत्पन्न neuronal नेटवर्क 16 और 23 डी भेदभाव के शामिल होने के बाद के लिए दिखाया गया है। गतिविधि से दर्जप्रत्येक अच्छी तरह से (10 किलोहर्ट्ज़ का नमूना दर) एक अलग रंग के साथ संकेत दिया है (रिकॉर्डिंग के 20 मिनट के 5 मिनट के लिए दिखाए जाते हैं)। एन फायरिंग दर 16 और 23 डी भेदभाव के शामिल होने के बाद। ओ जला दर 16 और 23 डी भेदभाव के शामिल होने के बाद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    परिणामों को देखते हुए, जिसके परिणामस्वरूप hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की गुणवत्ता कोशिकाओं का एक neurophysiological प्रोफाइल बनाने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। यही कारण है कि तीन से चार सप्ताह भेदभाव, आकृति विज्ञान, synapsin -1 / 2 अभिव्यक्ति और न्यूरॉन्स की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के शुरू होने से मूल्यांकन किया जा सकता है के बाद। उस समय बिंदु पर, hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स एक न्यूरोनल तरह आकारिकी दिखाने के लिए, MAP2, synapsin / PSD -95 सकारात्मक जब प्रदर्शन immunocytochemistry होने के लिए, और exhibi करने के लिए उम्मीद कर रहे हैंटी सहज electrophysiological गतिविधि (दोनों एकल कोशिका और नेटवर्क के स्तर पर)।

    Discussion

    यहाँ हम एक कुशल hiPSC-भेदभाव झांग एट अल द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल को लागू किया है। (2013) Meas पर hiPSC व्युत्पन्न neuronal नेटवर्क के नेटवर्क गतिविधि को मापने के लिए 12। हम neuronal भेदभाव उत्प्रेरण से पहले एक rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSC लाइन बनाने के द्वारा मूल प्रोटोकॉल अनुकूलित। इस अतिरिक्त कदम हमें विदेश मंत्रालय पर neuronal सेल घनत्व को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है। न्यूरोनल घनत्व पर नियंत्रण करने के लिए Meas प्रोटोकॉल अनुकूल ढालने के लिए और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण पूर्व अपेक्षित था। Meas का उपयोग कर neuronal नेटवर्क की गतिविधि को मापने के लिए, न्यूरॉन्स घने नेटवर्क बनाने के लिए सीधे विदेश मंत्रालय इलेक्ट्रोड 17,18 के शीर्ष पर की जरूरत है। यह जरूरी न्यूरॉन्स के चढ़ाना घनत्व पर कड़ा नियंत्रण की आवश्यकता है। RtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSC लाइन न्यूरॉन घनत्व क्योंकि इस रणनीति भेदभाव करने से पहले hiPSCs की तीव्र lentiviral transductions पर भरोसा नहीं करता है के नियंत्रण के लिए अनुमति देता है;rtTA / Ngn2 पॉजिटिव hiPSC लाइन इसलिए लगभग अंतिम उपज में किसी भी बदलाव के कारण, उदाहरण के लिए, lentiviral विषाक्तता और चर संक्रमण दक्षता के लिए समाप्त।

    प्रयोगात्मक प्रक्रिया का एक अन्य महत्वपूर्ण कदम चूहा astrocytes कि फर्क hiPSCs साथ cocultured कर रहे हैं की संख्या है। Astrocytes सक्रिय रूप से synapse गठन, रखरखाव, और उन्मूलन, जो सभी के न्यूरोनल कामकाज के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं कर रहे हैं को नियंत्रित करने से तंत्रिका सर्किट के विकास के शोधन के लिए योगदान करते हैं। इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल अत्यधिक astrocyte-निर्भर है: पूरी तरह से परिपक्व और कार्यात्मक synapses फार्म, न्यूरॉन्स astrocytes से समर्थन की आवश्यकता है। हम अनुभवी कि astrocytes की संख्या न्यूरॉन्स की परिपक्वता और सहज गतिविधि का प्रदर्शन करते neuronal नेटवर्क के गठन का समर्थन करने के लिए मोटे तौर पर hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की संख्या के बराबर होना चाहिए। हमारे astrocyte प्रोटोकॉल पैदावार प्राथमिक सेल संस्कृति के बाद सेएक सीमित जीवन काल के साथ Tures, चूहे astrocytes के अलगाव के लिए नियमित रूप से प्रदर्शन किया जा रहा है।

    प्रोटोकॉल झांग एट अल द्वारा प्रकाशित की हमारी अनुकूलन। (2013) 12 विदेश मंत्रालय प्रौद्योगिकी के साथ प्रयोग के लिए जाने की संभावना काफी hiPSC व्युत्पन्न नेटवर्क के नेटवर्क गतिविधि का अध्ययन करने की क्षमता में सुधार होगा। इससे पहले, Meas साथ hiPSC व्युत्पन्न neuronal नेटवर्क के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल समय लेने वाली भेदभाव प्रक्रियाओं 13-16 पर भरोसा किया। झांग एट अल से प्रोटोकॉल। (2013) एक तेजी से विकल्प प्रदान करता है, और हमारे संशोधन परिवर्तनशीलता का एक स्रोत है, जो इसे अब और अधिक व्यावहारिक विदेश मंत्रालय तकनीक के साथ संयोजन में hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का उपयोग करने के लिए, विशेष रूप से उच्च throughput या औषधीय अध्ययन में बनाता हटा। इसके अलावा, क्योंकि विधि झांग एट अल द्वारा प्रकाशित किया। (2013) 12 पैदावार ऊपरी परत cortical न्यूरॉन्स की एक सजातीय आबादी, हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल नेटवर्क में संभव ध्यान केंद्रित अध्ययनों में आता हैइस विशेष न्यूरोनल सबसेट के ctivity।

    बहरहाल, इस दृष्टिकोण भी कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, संस्कृतियों की एकरूपता भी एक नुकसान यह माना जा सकता है, क्योंकि संस्कृतियों कम विवो नेटवर्क, जहां न्यूरॉन्स के विभिन्न वर्गों (यानी निरोधात्मक और उत्तेजक न्यूरॉन्स) एक विषम नेटवर्क के गठन में समान होने की संभावना है। आगे विदेश मंत्रालय प्रौद्योगिकी के साथ hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के उपयोग को बढ़ाने के लिए, यह तेजी से (ट्रांस्जीन आधारित) अन्य न्यूरोनल सेल आबादी के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा। अगर प्रोटोकॉल उपलब्ध हो जाते हैं, इन विट्रो नेटवर्क और अधिक बारीकी से इन विवो नेटवर्क की नकल करेंगे। दूसरा, वर्तमान चूहे astrocytes में विकास का समर्थन करने के लिए hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में जोड़ा जाना चाहिए, और इसलिए परिणामस्वरूप न्यूरोनल नेटवर्क एक मानव न्यूरोनल नेटवर्क sensu stricto नहीं है। भविष्य सोल में astrocytes मई में hiPSCs फर्क के लिए विश्वसनीय प्रोटोकॉलइस समस्या को 26 ve। तीसरा, दो आयामी neuronal नेटवर्क, के रूप में यहाँ वर्णित है, जटिल तीन आयामी इन विवो neuronal नेटवर्क के अध्ययन के लिए एक सीमित मॉडल हैं। सौभाग्य से, विदेश मंत्रालय तकनीक के साथ संयोजन में चूहे प्राथमिक न्यूरॉन्स के तीन आयामी संस्कृतियों का वर्णन प्रोटोकॉल पहले से ही उपलब्ध हैं 27,28। भावी, तीन आयामी संस्कृति तकनीक और विदेश मंत्रालय प्रौद्योगिकी के साथ hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और astrocytes प्राप्त करने के लिए तेजी से भेदभाव प्रोटोकॉल का संयोजन जैविक तंत्र अंतर्निहित मस्तिष्क संबंधी बीमारियों में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Lebovitz's L-15 medium Gibco 11415-064
    B-27 supplement Gibco 0080085SA
    Poly-D-Lysine (PDL) Sigma-Aldrich P6407
    Ca2+/Mg2+-free HBSS  Gibco 14175-095
    0.05% Trypsin-EDTA  Gibco 25300-054
    2.5% Trypsin Gibco 15090-046
    High-glucose DMEM Gibco 11965-092
    FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma-Aldrich F2442-500ML
    Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
    70 µm cell strainer BD Falcon 352350
    DPBS Gibco 14190-094
    psPAX2 lentiviral packaging vector Addgene Plasmid #12260
    pMD2.G lentiviral packaging vector Addgene Plasmid #12259
    Basement membrane matrix Gibco A1413201
    DMEM/F12 Gibco 11320-074
    Cell detachment solution Sigma-Aldrich A6964
    E8 medium Gibco A1517001
    ROCK inhibitor Gibco A2644501  Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used.
    Polybrene Sigma-Aldrich H9268-5G
    G418 Sigma-Aldrich G8168-10ML
    Puromycin Sigma-Aldrich P9620-10ML
    Vitronectin Gibco A14700
    6-well MEAs Multi Channel Systems 60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr
    Glass coverslips VWR 631-0899
    Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma-Aldrich P3655-10MG
    Laminin Sigma-Aldrich L2020-1MG
    Doxycyclin Sigma-Aldrich D9891-5G
    N-2 supplement Gibco 17502-048
    Non-essential amino acids Sigma-Aldrich M7145
    NT-3, human recombinant Promokine C66425
    BDNF, human recombinant Promokine C66212
    Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
    L-alanyl-L-glutamine Gibco 35050-038
    Neurobasal medium Gibco 21103-049
    Cytosine β-D-arabinofuranoside  Sigma-Aldrich C1768-100MG
    Straight fine-tipped forceps Fine Science Tools 11251
    Fine-tipped spring scissors  Fine Science Tools 91500-09

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. Studying human disease using human neurons. Brain Res. , (2016).
    2. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).
    3. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).
    4. Wu, H., et al. Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).
    5. Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
    6. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
    7. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
    8. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
    9. Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture. J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).
    10. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
    11. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).
    12. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
    13. Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).
    14. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Sci Rep. 6, 26181 (2016).
    15. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Front Neurosci. 10, (2016).
    16. Heikkila, T. J., et al. Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro. Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).
    17. Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays. Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).
    18. Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces. J Neural Eng. 9 (2), (2012).
    19. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
    20. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079 (2013).
    21. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J Vis Exp. (63), e3965 (2012).
    22. Ba, W., et al. ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function. Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).
    23. Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer. Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).
    24. Ba, W., et al. TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function. Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).
    25. Benevento, M., et al. Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling. Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).
    26. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
    27. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci Rep. 4, 5489 (2014).
    28. Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model. J Vis Exp. (104), e53080 (2015).

    Tags

    विकास जीवविज्ञान अंक 119 प्रेरित pluripotent स्टेम सेल neuronal भेदभाव सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणियों lentiviral पारगमन astrocyte अलगाव न्यूरोनल नेटवर्क
    मापने नेटवर्क गतिविधि माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों पर के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का तेजी से neuronal भेदभाव
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Frega, M., van Gestel, S. H. C.,… More

    Frega, M., van Gestel, S. H. C., Linda, K., van der Raadt, J., Keller, J., Van Rhijn, J. R., Schubert, D., Albers, C. A., Nadif Kasri, N. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (119), e54900, doi:10.3791/54900 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter