Summary
Vi ändrar och genomföra ett tidigare publicerat protokoll beskriver snabb, reproducerbar och effektiv differentiering av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) till excitatoriska kortikala neuroner 12. Specifikt gör att våra modifikation kontroll av neuronal celltäthet och användning på mikroelektrodanordningar för att mäta elektrofysiologiska egenskaper på nätverksnivå.
Abstract
Neuroner som härrör från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) ger ett lovande nytt verktyg för att studera neurologiska sjukdomar. Under det senaste decenniet har många protokoll för differentiering hiPSCs till neuroner utvecklats. Men dessa protokoll är ofta långsamma med hög variabilitet låg reproducerbarhet, och låg effektivitet. Dessutom nervceller som erhållits med dessa protokoll är ofta omogna och saknar adekvat funktionell aktivitet både på encelliga och nätverksnivå om nervceller odlas i flera månader. Delvis på grund av dessa begränsningar, de funktionella egenskaperna hos hiPSC-härledda neuronala nätverk är fortfarande inte väl karakteriserade. Här anpassar vi en nyligen publicerad protokoll som beskriver produktion av humana neuroner från hiPSCs genom forcerad expression av transkriptionsfaktorn neurogenin-2 12. Detta protokoll är snabb (vilket ger mogna nervceller inom 3 veckor) och effektiv, med nästan 100% effektivitet transduc omvandlingsed-celler (> 95% av DAPI-positiva celler är MAP2-positiva). Dessutom ger protokollet en homogen population av excitatoriska neuroner som skulle göra det möjligt att utreda celltyp specifika bidrag till neurologiska sjukdomar. Vi ändrade det ursprungliga protokollet genom att generera stabilt transducerade hiPSC celler, vilket ger oss explicit kontroll över det totala antalet neuroner. Dessa celler används sedan för att generera hiPSC-härledda neuronala nätverk på mikro-elektrodgrupperna. På detta sätt kan den spontana elektrofysiologisk aktivitet av hiPSC-härledda neuronala nätverk mätas och karakteriserats, men behåller interexperimental konsistens i termer av celldensitet. Den presenterade protokollet är brett tillämpbar, i synnerhet för mekanistiska och farmakologiska studier på humana neuronala nätverk.
Introduction
Utvecklingen av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) differentieringsprotokoll för att generera humana neuroner in vitro har gett ett kraftfullt nytt verktyg för att studera neurologiska sjukdomar. Tills nyligen var studiet av dessa störningar försvåras avsevärt av avsaknaden av modellsystem med humana neuroner. Även gnagare kan användas för att studera neurologiska sjukdomar, kan resultaten av sådana studier inte översättas lätt för människor 1. Med tanke på dessa begränsningar, hiPSC härledda neuroner är ett lovande alternativ modell som kan användas för att belysa molekylära mekanismerna bakom neurologiska sjukdomar och för in vitro läkemedelsscreening.
Under det senaste decenniet, flera protokoll konvertera hiPSCs i nervceller har utvecklats 2-8. Men dessa protokoll som fortfarande begränsad på många sätt. Först, protokollen är ofta tidskrävande: generera nervceller med tillräcklig mognad (dvs. synapse formation) och funktionella aktiviteten kräver månader av odlingsförfaranden, vilket gör storskaliga studier svåra 9. Dessutom är effektiviteten hiPSC-till-neuron omvandlingen låg. Protokoll ger ofta en heterogen population av nervceller, och därmed inte tillåter studier av specifika delmängder av nervceller. Dessutom protokollen är inte reproducerbara, vilket ger olika resultat för olika IPSC linjerna 10,11. Slutligen mognaden scenen och funktionella egenskaperna hos de resulterande nervceller är också variabel 10.
För att ta itu med dessa problem, Zhang et al. (2013) 12 utvecklade ett protokoll som snabbt och reproducerbart genererar mänskliga nervceller från hiPSCs genom överuttryck transkriptionsfaktor neurogenin-2. Som rapporterats av författarna, sker differentieringen relativt snabbt (bara 2-3 veckor efter induktion av uttryck av neurogenin-2), är reproducerbar protokollet (neuronala egenskaper är oberoende av starting hiPSC linje), och den hiPSC-till-neuron konvertering är effektiv (nästan 100%). Befolkningen i nervceller genereras med deras protokoll är homogen (liknar övre skikt kortikala neuroner), vilket gör att utreda celltyp specifika bidrag till neuronala sjukdomar. Dessutom deras hiPSC-härledda neuroner uppvisade mogna egenskaper (t.ex. att förmågan att bilda synapser och robust funktionell aktivitet) efter bara 20 d.
Karaktärisera elektrofysiologiska egenskaperna hos hiPSC-härledda neuroner på nätverksnivå är en viktig förutsättning innan hiPSC tekniken kan utnyttjas för studiet av mänskliga sjukdomar. Av denna anledning har många forskargrupper nyligen börjat undersöka stamcells-härledda neuroner på nätverksnivå med hjälp av mikroelektrodgrupp (MEA) enheter (multikanalsystem, Reutlingen, Tyskland) 13-16. Elektroderna i ett MEA är inbäddade i ett substrat på vilket neuronala celler kan odlas.MEA kan användas för att undersöka de elektrofysiologiska egenskaperna hos neuronala nätverk och in vitro utveckla sin verksamhet. För närvarande är MEA används endast i kombination med differentieringsprotokoll som tar flera månader för att ge mogna nätverk. Därför bör kombinera MEA med en snabb differentiering protokoll underlätta användningen av denna teknik i storskaliga studier av neurologiska sjukdomar.
Här presenterar vi en modifiering av Zhang et al. (2013) 12 protokoll och anpassa den för användning på MEA. I synnerhet i stället för att förlita sig på en akut Lentiviral transduktion, istället har vi skapat hiPSC linjer som stabilt uttrycker rtTA / Ngn2 innan inducera differentiering. Vi gjorde detta i första hand att ha reproducerbar kontroll över den neuronala celltäthet, eftersom nervcelltätheten är avgörande för neuronal nätverksbildning, och för god kontakt mellan nervceller och elektroderna MEA 17,18. although Zhang et al. protokollet är mycket effektiv med avseende på omvandling av transducerade hiPSCs, är det i sig variabel med avseende på den slutliga utbytet av neuroner från antalet hiPSCs pläterade initialt (se figur 2E i Zhang et al.) 12. Med en stabil linje, vi eliminera många frågor som orsakar variation, såsom lentivirala toxicitet och infektionseffektivitet. Vi optimerade då de parametrar som på ett tillförlitligt sätt ger hiPSC-härledda neuronala nätverk på MEA, få nätverk mognad (t.ex. synkrona händelser med en majoritet av kanalerna) av den tredje veckan. Denna snabba och tillförlitliga protokoll bör möjliggöra direkta jämförelser mellan nervceller som härrör från olika (dvs patientspecifika) hiPSC linjer samt ger robust konsistens för farmakologiska studier.
Protocol
Alla experiment på djur har utförts i enlighet med de godkända djurskötsel och använda riktlinjerna i Animal Care kommittén, Radboud University Medical Centre, Nederländerna, (RU-december-2011-021, protokollnummer: 77.073).
1. Glia Cell Isolering och kultur
OBS: Protokollet presenteras här bygger på det arbete som McCarthy och de Vellis 19, och en mycket likartad detaljerat protokoll för mus astrocyter finns 20. För att generera primära kulturer av kortikala astrocyter från embryonala (E18) råtthjärnor, behöver en gravid råtta offras, embryona måste skördas från livmodern, och hjärnan måste isoleras från embryon. För att fylla en T75 kolv, cortex från 2 embryonala hjärnor behöver kombineras. Som ett alternativ, kan kommersiellt tillgängliga renade och frysta astrocyter köpas.
- Förbered T75 odlingskolv
- Späd Poly-D-lysin (PDL) isterilt, ultrarent vatten till en slutlig koncentration av 10 mikrogram / ml. Tillsätt 5 ml av den utspädda PDL till T75 odlingskolv. Swish runt försiktigt för att väta hela odlingsytan. Placera kolven i en fuktad 37 ° C inkubator under 3 h.
- Aspirera PDL från kolven. Skölj kolven 3x med 5 ml sterilt vatten för att avlägsna obundet PDL. Aspirera vattnet helt. Låt kolven torka i ett dragskåp med laminärt flöde eller användas omedelbart.
- Dissektion av cortex
- Förbered 50 ml dissektion medium: Lebovitz s L-15 medium med 2% (volym / volym) B-27 tillägg. Håll på is.
- Söva råttan djupt med isofluran i en induktionskammare (små Plexiglas rutan) tills andning upphör (~ 5-8 min). Ta råtta från induktionskammare och omedelbart avlivas genom cervikal dislokation.
- Spraya buken hos råtta med 70% EtOH och torka bort överskottet. Exponera och ta bort livmodern från dammen via kejsarsnitt avspå att använda en sax 21.
- Skär enskilda embryon från deras fostervatten säckar med sax, överföring till en steril petriskål fylld med kallt dissektion medium och hålla på is.
- Överföra embryon igen till en ny, steril 6 cm petriskål fylld med kallt dissektion medium. Utdrag hjärnor från embryona under ett stereomikroskop. Att exponera hjärnan försiktigt skala bort huden och skallen med pincett. Försiktigt ösa ut hela hjärnan och överför till en 35 mm petriskål med färskt, kallt dissektion medium.
OBS: Hela hjärnor dissekerades från embryon kan lagras i dissektion medium på is i flera timmar utan att förlora cellulär viabilitet. - Separera de två halvkloten av varje hjärna genom att skära genom mittlinjen med fina spets fjäder sax eller en skalpell. Försiktigt strippa hjärnhinnorna med raka spetsig pincett.
OBS: Det är mycket viktigt att avlägsna hjärnhinnorna helt. thär förhindrar förorening av astrocyternas kultur fibroblast. Fibroblaster snabbt delande celler och kommer så småningom tränga undan de andra cellerna. - Ta bort mitthjärnan / striatum och luktbulben med fjäder sax eller en skalpell. Se också till att ta bort hippocampus (C-formad struktur som är perimedian och caudal i förhållande till cortex) med fjäder sax eller en skalpell. Samla in de kortikala halvklot i ett 15 ml centrifugrör fylld med 5 ml dissektion medium. Håll på is.
- Dissociation av cortex
- Förbereda 2 ml Ca2 + / Mg2 + -fri Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med 0,25% trypsin (dissociation medium). Förbered 50 ml hög-glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 15% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin (odlingsmedium) och filtrera sterilisera.
- Låt vävnaden sedimentera till botten av centrifugröret. noggrant sompirat så mycket av dissekering mediet som möjligt från ovan vävnaden. Tvätta vävnaden med 5 ml Ca2 + / Mg2 + -fri HBSS (utan trypsin) och låt vävnaden sedimentera på botten av röret.
- Försiktigt aspirera HBSS. Tillsätt 2 ml dissociation medium och skaka röret försiktigt för att blanda enzymet runt vävnaden. Inkubera i en 37 ° C vattenbad under 5-10 min. Flick röret några gånger under inkubationen för att agitera vävnaden.
- Omedelbart mal sönder vävnad med hjälp av en 1000 mikroliter pipettspets. Ställa pipett volymen till ca 800 mikroliter. Aspirera bitarna och mata ut kraftfullt mot den sida av röret, direkt ovanför vätskeledningen. Försök dock att minimera bubblor eller skum. Upprepa tills vävnaden är tillräckligt dissocieras, ca 15 - 20x. Lägg 8 ml odlingsmedium för att inaktivera trypsin. Blanda försiktigt genom att vända röret flera gånger.
- Passera cellsuspensionen genom en 70 | im cellfilter placerades på toppen av en 50 mL centrifugrör. Skölja 15 ml rör med odlingsmedium och filtrera mediet genom cellen sil för att samla mediet i 50 ml rör med cellsuspensionen. Skölj cellfilter några gånger med odlingsmedium. Efter sköljning, bör den slutliga volymen vara ungefär 20-25 ml.
- Pelletera cellerna vid 200 xg under 10 min. Försiktigt aspirera så mycket mediet som möjligt, utan att vidröra cellpelleten. Resuspendera cellerna i 1 ml odlingsmedium med hjälp av en 1000 mikroliter pipett. Lägg till 11 ml förvärmt odlingsmedium och blanda försiktigt (för att förhindra bubblor) med en 10 ml pipett.
- Skölj PDL belagda T75-flaska en gång med 5 ml odlingsmedium. Aspirera mediet och överför cellsuspensionen till kolven. Alla celler är i suspensionen stryks, och vi tycker att det är i allmänhet onödigt att räkna dem, eftersom astrocyter inte kan skiljas från andra celler i suspensionen. Placera kolven i en befuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 feller två dagar.
- Utbyggnad och underhåll av de astrocyter
- Ersätta hela mediet för första gången 2 d efter initial plätering. Byt ut hela mediet efteråt var 3 d. Förvärm alltid färskt medium till 37 ° C före tillsats till cellerna.
OBS! Astrocyter kräver 7-10 d att uppgå till cirka 90% konfluens (astrocyterna visas som en tätt packad mosaikmonolager, med mikroglia och oligodendrocyter ligger ovanpå och blandas). - När astrocyter uppgå till cirka 90% konfluens, skaka kolven för att avlägsna kontaminerande gliaceller:
- Ta kolven ur inkubatorn och dra locket (fenol) eller täcka porten (filtrerade). För att ta bort mikroglia, skaka kolven på en orbital plattform vid 180 rpm under en timme. Aspirera mediet. Skölj en gång med 5 ml förvärmda odlingsmedium, aspirera och ersätta med 12 ml odlingsmedium.
- Att ta bortde oligodendrocyter tillbaka kolven till omlopps plattform och skaka vid 250 rpm, 37 ° C under minst 7 timmar, men företrädesvis O / N.
- Aspirera mediet. Skölj en gång med 5 ml förvärmda odlingsmedium, aspirera och ersätta med 12 ml odlingsmedium. Återgå kolven till inkubatorn.
- När 100% konfluenta, delbart astrocyterna användning av standardförfaranden i ett förhållande av 1: 3 till 1: 2 med 0,05% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA). En T75 kolv vid 100% konfluens typiskt ge ca 4,0 x 10 6 celler totalt. Enligt detta schema, kan kulturerna typiskt delas en gång per vecka.
OBS: När astrocyter når konfluens, kan de skördas och användas för hiPSC differentiering som beskrivs nedan i protokoll steg 3,4. Astrocyterna kan delas åtminstone en gång utan märkbar förlust av livsduglighet. De kan bibehållas under upp till 2 månader i odling. Av erfarenhet, primära embryonala dag 18 rått astrocyter progressively bli terminalt differentierade och / eller förlora viabilitet efter upprepad delning. Även om det är möjligt att frysa astrocyter för framtida bruk, föredrar vi att isolera astrocyter från färska embryonala hjärnor när det behövs.
- Ersätta hela mediet för första gången 2 d efter initial plätering. Byt ut hela mediet efteråt var 3 d. Förvärm alltid färskt medium till 37 ° C före tillsats till cellerna.
2. Framställning av rtTA / Ngn2 -positivt hiPSCs
OBS: hiPSCs används för våra experiment genererades internt av Lentiviral transduktion av humana fibroblaster med omprogrammering faktorer cMYC, Sox2, Oct4 och Klf4.
OBS: För generering av rtTA / Ngn2 -positiva hiPSCs, är lentivirala vektorer som används för att stabilt integrera transgenerna i genomet hos de hiPSCs. Protokollet för framställning av den lentivirus har tidigare 22 publicerats. Närmare uppgifter om de lentivirala förpackningar vektorer som används för att producera lentivirus partiklar rtTA och Ngn2 finns i
- Skylten hiPSCs (dag 1)
OBS: De volymer som anges i detta protokoll anta att hiPSCs odlas i ett 6-brunnars platta och att cellerna i en brunn skördas. Dessutom antas det att cellerna pläteras därefter i 12 brunnar i en 12 brunnars platta.- Förbered 10 ml kall DMEM / F12 med 1% (vol / vol) Basement Membrane Matrix (BMM) för att erhålla utspädd BMM. Tillsätt 800 mikroliter utspädd BMM per brunn i en 12 brunnar. Inkubera under åtminstone 1 h i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Före användning, inkubera plattan under 1 h vid RT.
- Varm 15 ml Essential 8 (E8) medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin, 9 ml DMEM / F12 och 1 ml celllösgörlösning (CDS) till rumstemperatur. Komplettera E8 medium med Rho-associerat proteinkinas (ROCK) inhibitor.
- Aspirera det använda mediet av hiPSCs end Tillsätt 1 ml CDS till hiPSCs. Inkubera 3-5 min i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Kontrollera under mikroskop huruvida cellerna lossnar från varandra.
- Tillsätt 2 ml DMEM / F12 i brunnen försiktigt suspendera cellerna med en 1000 mikroliter pipett och överföra celler till en 15 ml rör. Lägg 7 ml DMEM / F12 till cellsuspensionen. Snurra cellerna vid 200 xg under 5 min.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 2 ml av beredd E8 medium. Erhålla en cellsuspension i vilken de hiPSCs dissocieras (bildar inte cellklumpar) genom att sätta spetsen av en 1000 mikroliter pipett mot den sida av 15 ml rör och återsuspendering av cellerna försiktigt. Kontrollera under mikroskop om cellerna dissocieras.
- Bestäm antalet celler (celler / ml) med hjälp av en hemocytometer kammaren.
OBS: En sex brunnar väl vid 80 - 90% sammanflytning kommer typiskt att ge 3,0 - 4,0 x 10 6 celler totalt. - Aspireraden utspädda BMM från brunnarna i 12-brunnsplatta. Späd cellerna för att erhålla en cellsuspension av 3,0 x 10 4 celler / ml. Plattan 1 ml av cellsuspensionen per brunn i 12 brunnars platta. Placera 12 brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2.
- Omvandla de iPS-celler med rtTA och Ngn2 lentivirus (dag 2)
- Varm 12 mL E8-medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin till rumstemperatur. Komplettera E8 medium med ROCK-inhibitor och polybren till en slutlig koncentration av 8 | ig / ml till E8 mediet.
- Tina portioner med lentivirus fjädring. Lägg polybren till en slutlig koncentration av 8 | ig / ml till lentivirus suspensionen. Aspirera det använda mediet och tillsätt 1 ml av beredd E8 medium till varje brunn.
- Utför transduktion med olika mängder av få den rätta - och Ngn2 -lentivirus suspensioner. Till exempel, transduCE hiPSCs genom att tillsätta 100 mikroliter av både få den rätta -lentivirus och Ngn2 -lentivirus suspensionen till en brunn på 12 brunnar. För andra brunnar, använder 200 mikroliter, 300 mikroliter, 400 mikroliter och 500 mikroliter lentivirus fjädring i stället för 100 mikroliter. De hiPSCs av två brunnar i 12 brunnar bör inte omvandlas; de kommer att tjäna som kontroller under valet.
OBS: De transduktioner är företrädesvis i två exemplar, så att omvandlingseffektiviteten kan uppskattas mer exakt efter starten av markeringen (se protokoll steg 2.2.4). Mängden lentivirus fjädring som krävs för att effektivt transducera majoriteten av hiPSCs beror på titern av lentivirus suspensionen och hiPSC linje som används. I denna studie, oftast använder vi 100 - 500 mikroliter av lentivirus fjädring för att omvandla de hiPSCs. - Placera 12 brunnar i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 under 6 timmar. Före slutet av den 6 h inkubationsperioden, varm 12 mL E8-medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin och 12 ml Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) till RT. Komplettera E8 medium med ROCK-hämmare.
- Aspirera det använda E8 medium. Tvätta varje brunn med en ml DPBS. Tillsätt 1 ml av beredd E8 medium till varje brunn. Placera 12 brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2.
- Uppdatera E8 medium (dag 3)
- Varm 12 mL E8-medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin till RT. Aspirera det använda mediet från brunnarna i 12 brunnar och tillsätt 1 ml av det beredda E8-medium till varje brunn. Placera 12 brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2.
- Utför val med puromycin och G418 (dag 4-8)
OBS! Beroende på celldelningshastigheten av höftenSC linjen och effektivitet Lentiviral transduktion, kan cellerna når 70-80% konfluens under urvalsperioden, vid vilken tidpunkt kulturerna måste delas. Eftersom tidpunkten för uppdelningen inte kan förutses i förväg, kommer det inte att nämnas i protokollet. Men istället för att uppdatera den E8-medium kompletterat med de nämnda koncentrationerna av puromycin och G418, kan en dela upp hiPSC kulturen som en normal hiPSC kultur (inklusive utstrykning av celler på vitronektin-belagda plattor). Det enda undantaget är att E8 medium bör kompletteras med de nämnda koncentrationerna av antibiotika för att fortsätta valet.- Varm 12 mL E8-medium med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin till rumstemperatur. Lägg puromycin och G418 för selektion; olika mängder av de antibiotika tillsätts under perioden val (tabell 1).
- Uppskatta effektiviteten av transduktion genom att uppskatta procentandelen av G418- och puromycin-resistenta celler. För att uppskatta andelen resistenta celler, uppskatta andelen döda celler (nonresistant celler) för de olika villkor (kulturerna omvandlade med olika mängder av lentivirus fjädring) och för de nontransduced celler (cellerna som fungerar som ett urval kontroll). Beräkna procentandelen av resistenta celler som [100% - (procent av döda celler)].
OBS: Om transduktioner med olika mängder av lentivirus fjädring utfördes i duplikat, kan transduktion effektiviteten mer exakt uppskattas. Beskaffenheten med de icke-transducerade celler tjänar som en markering kontroll; procentsatserna för döda celler för odlingarna omvandlade med olika mängder av lentivirus fjädring bör vara lägre. Uppskattad procentandel av resistenta celler används för att välja de hiPSCs som sannolikt positivt för båda transgener. I allmänhet väljer vi de hiPSCs från transduktion villkoret var> 90% av cells överleva 5 d urvalsperioden. - Aspirera det använda mediet av de hiPSCs och tillsätt 1 ml av det beredda E8-medium till brunnarna. Placera 12 brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2.
| Slutlig koncentration av G418 | Slutlig koncentration av puromycin | |
| dag 4 | 250 | j, g / ml | 2 | ig / ml |
| dag 5 | 250 | j, g / ml | 2 | ig / ml |
| dag 6 | 250 | j, g / ml | 1 | j, g / ml |
| dag 7 | 250 | j, g / ml | 1 | j, g / ml |
| dag 8 | 250 | j, g / ml | 1 | j, g / ml |
Tabell 1: koncentrationer av antibiotika under urvalsperioden.
- Stoppa val och börja regelbunden odling (dag 9 och senare)
- Efter 5 d urvalsperioden, kultur få den rätta / Ngn2 -positiva hiPSCs som normala hiPSCs, med det undantaget att den E8 mediet av cellerna kompletteras med G418 till en slutlig koncentration av 50 mikrogram / ml och med puromycin till en slutlig koncentration av 0,5 | ig / ml.
OBS: Cellerna kan nu frysas (enligt standardprotokoll för kryokonservering av celler) för att fungera som en backup. Detta är ett viktigt steg för reproducerbarhet differentiering protokollet, eftersom det tillåter användning av samma parti rtTA / Ngn2 -positiva hiPSCs för många framtida differentieringsexperiment.
- Efter 5 d urvalsperioden, kultur få den rätta / Ngn2 -positiva hiPSCs som normala hiPSCs, med det undantaget att den E8 mediet av cellerna kompletteras med G418 till en slutlig koncentration av 50 mikrogram / ml och med puromycin till en slutlig koncentration av 0,5 | ig / ml.
3. Differentiering av rtTA / Ngn2 -positiva hiPSCs till nervceller på sex brunnarMEA och täckglas
OBS: I detta protokoll är de uppgifter som anges för differentiering rtTA / Ngn2 -positiva hiPSCs på två olika substrat, dvs sex brunnar MEA (enheter bestående av 6 oberoende brunnar med 9 inspelning och en referens inbäddade mikroelektroder per brunn) och täckglas i brunnarna på en 24-brunnars platta. Protokollen kan emellertid enkelt anpassas för större substrat (t.ex. för brunnarna i 12- eller 6-brunnsplattor), genom ökning av de nämnda värdena enligt ytan.
- Förbered MEA eller glastäck (dag 0 och dag 1)
- Dagen före starten av differentiering, sterilisera MEA i enlighet med tillverkarens rekommendation.
- Späd adhesionsproteinet Poly-L-Ornithine (PLO) i sterilt ultrarent vatten till en slutlig koncentration 50 | ig / ml. Coat den aktiva elektrodarean av sex brunnar MEA genom att placera en 100 mikroliterdroppe av den utspädda PLO i varje brunn. Placera täckglasen i brunnarna i 24-brunnar med användning av sterila pincetter. Tillsätt 800 mikroliter av den utspädda PLO i varje brunn. Förhindra täck flyter genom att trycka ner dem med 1000 mikroliter pipettspetsen.
- Inkubera 6-brunnars MEA och 24-brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Nästa dag, aspirera utspädda PLO. Tvätta glasytorna hos de sex-brunnars MEA och täckglasen två gånger med sterilt ultrarent vatten.
- Späd laminin i kall DMEM / F12 till en slutlig koncentration av 20 mikrogram / ml (för de sex-brunnars MEA) och 10 mikrogram / ml (för glastäckglas). Omedelbart belägga den aktiva elektrodarean av de 6-brunnars MEA genom att placera en 100 mikroliter droppe i varje brunn. På liknande sätt, tillsätt 400 mikroliter av den utspädda laminin i varje brunn i 24-brunnsplatta för att belägga täckglas. Förhindra täck flyter genom att trycka ner dem med 1000 mikroliter pipettspetsen.
- Inkubera 6-brunnars MEA och 24 brunnar i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 under åtminstone 2 h.
- Skylten hiPSCs (dag 1)
OBS: Volymerna som nämns i steg 3.2.1 - 3.2.4 antar att få den rätta / Ngn2 -positiva hiPSCs odlas i en 6-brunnar och att cellerna i en brunn skördas. De volymer som krävs för plätering av cellerna på 6-brunnars MEA och / eller täckglasen beror på antalet 6-brunnars MEA och / eller antalet täckglas som används i experimentet; siffrorna som anges i steg 3.2.6 - 3.2.8 tillåter skalning till olika experiment storlekar.- Varma DMEM / F12, CDS och E8-medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin R / T. Lägg doxycyklin till en slutlig koncentration av 4 mikrogram / ml och ROCK-inhibitor till E8 mediet.
- Aspirera det använda mediet av få den rätta / Ngn2 -positiva hiPSCs och tillsätt 1 mL CDS till hiPSCs. Inkubera 3-5 min i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2. Kontrollera under mikroskop huruvida cellerna lossnar från varandra.
- Tillsätt 2 ml DMEM / F12 i brunnen försiktigt suspendera cellerna med en 1000 mikroliter pipett och överföra celler till en 15 ml rör. Lägg 7 ml DMEM / F12 till cellsuspensionen. Snurra cellerna vid 200 xg under 5 min.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 2 ml av beredd E8 medium. Dissociera hiPSCs genom att sätta spetsen av en 1000 mikroliter pipett mot den sida av 15 ml rör och återsuspendering av cellerna försiktigt. Kontrollera under mikroskop om cellerna dissocieras.
- Bestäm antalet celler (celler / ml) med hjälp av en hemocytometer kammaren.
ANMÄRKNING: En 6-brunnars platta brunn vid 80-90% konfluens kommer typiskt att ge 3,0 - 4,0 x 10 6 celler totalt. - Sug upp det utspädda laminin. För sex brunnar MEA, späd cellerna för att erhålla en cell suspension av 7,5 x 10 5 celler / ml. Platta cellerna genom tillsats av en droppe av 100 mikroliter av cellsuspensionen på den aktiva elektrodarean i varje brunn i 6-brunnars MEA. För täckglas, späd cellerna för att erhålla en cellsuspension av 4,0 x 10 4 celler / ml. Platta cellerna genom att tillsätta 500 mikroliter av cellsuspensionen till brunnarna i 24-brunnars platta.
OBS: Den slutliga celldensiteten på MEA är högre än på täckglas (Figur 1A och B). Vi fann att denna höga celltätheten krävdes för korrekt inspelning av nätverksaktivitet. I protokollet, siffrorna tillhandahålls som visade sig vara optimalt för analyserna. - Placera 6-brunnars MEA och 24 brunnar i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 under 2 h (MEA) eller O / N (24 brunnsplatta).
- Efter 2 h, tillsätt försiktigt 500 mikroliter av den beredda E8 medium till varje brunn i 6-brunnars MEA. Placera 6-vill MEA O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2.
- Ändra mediet (dag 2)
- Nästa dag, förbereda DMEM / F12 med 1% (volym / volym) N-2 supplement, 1% (v / v) icke-essentiella aminosyror och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin. Lägg humant rekombinant neurotrofin-3 (NT-3) till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, humant rekombinant hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, och doxycyklin till en slutlig koncentration av 4 ^ g / mL. Värma mediet till 37 ° C.
- Lägg laminin till en slutlig koncentration av 0,2 mikrogram / ml till mediet. Filtrera den resulterande mediet. Aspirera det använda mediet från brunnarna i 6-brunns MEA och 24-brunnar och ersätta det med det färdiga mediet. Inkubera 6-brunnars MEA och 24-brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2.
- Lägg råtta astrocyter (dag 3)
OBS! Volymer som nämns i detta protokoll anta att rått astrocyter odlas i T75 odlingskolvar. Det är viktigt att rått astrocyter som läggs till odlingarna är av god kvalitet. Vi använder två kriterier för att kontrollera om de rått astrocyter är av god kvalitet. För det första bör råtta astrocyternas kultur kunna växa sammanflytande inom tio dagar efter det att isoleringen från råtta embryonala hjärnor. För det andra, efter en delning råttan astrocyt kulturen bör de rått astrocyter att kunna bilda ett konfluent, tessellated monoskikt (figur 1C). Om råttan astrocyternas kultur inte uppfyller dessa två kriterier, rekommenderar vi att inte använda denna kultur för differentieringsexperiment.- Varm 0,05% trypsin-EDTA till RT. Värma DPBS och DMEM / F12 med 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin till 37 ° C.
- Aspirera det använda mediet av råtta astrocyternas kultur. Tvätta kultur genom att tillsätta 5 ml DPBS och swish runt försiktigt.
- Aspiråt DPBS och tillsätt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Swish trypsin-EDTA runt försiktigt. Inkubera i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 under 5 - 10 min.
- Kontrollera under mikroskop om cellerna är fristående. Lossa de sista cellerna genom att träffa kolven några gånger.
- Tillsätt 5 ml av DMEM / F12 till kolven. Finfördela cellerna försiktigt i kolven med en 10 ml pipett. Samla cellsuspensionen i ett 15 ml rör. Snurra röret vid 200 xg under 8 minuter.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml DMEM / F12. Bestäm antalet celler (celler / ml) med hjälp av en hemocytometer kammaren.
- Lägg 7,5 x 10 4 astrocyter per brunn av de 6-brunnars MEA. Lägg 2,0 x 10 4 astrocyter per brunn i 24-brunnar. Inkubera MEA och 24-brunnar O / N i en fuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2.
- Ändra mediet (dag 4)
- Filtrera mediet och värm till 37 ° C. Aspirera det använda mediet från brunnarna i 6-brunns MEA och 24-brunnar och ersätta det med det färdiga mediet. Bibehålla de 6-brunnars MEA och 24-brunnar i en befuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2.
OBS: Från dag 6, uppdatera halvav mediet varannan dag. Från dag 10 och framåt, är det medium som kompletterats med FBS för att stödja astrocyt viabilitet.
- Förbereda Neurobasal-medium med 2% (volym / volym) B-27 supplement, 1% (volym / volym) L-alanyl-L-glutamin och 1% (volym / volym) penicillin / streptomycin. Lägga NT-3 till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, BDNF till en slutlig koncentration av 10 ng / ml, och doxycyklin till en slutlig koncentration av 4 | ig / ml. Från dag 10 och framåt, också komplettera mediet med 2,5% (volym / volym) FBS. Filtrera den resulterande mediet och värm till 37 ° C.
- Ta hälften av det använda mediet från brunnarna i 6-brunns MEA och 24-brunnar med hjälp av en 1000 mikroliter pipett och ersätta det med det färdiga mediet. Bibehålla de 6-brunnars MEA och 24-brunnar i en befuktad 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2.
4. Upprätta neurofysiologiska profil hiPSC härledda neuroner
OBS: Två till tre veckor efter den iproduktion av differentiering kan hiPSC-härledda neuroner användas för olika analyser nedströms. I detta avsnitt ges exempel på några efterföljande analyser ges som kan utföras för att fastställa neurofysiologisk profilen av hiPSC-härledda neuroner.
- Karakterisera neuronala nätverksaktivitet med hjälp av MEA
- Record 20 min av elektrofysiologisk aktivitet av hiPSC-härledda neuroner odlade på MEA. Under inspelningen, hålla temperaturen vid 37 ° C, och förhindra avdunstnings- och pH-förändringar av mediet genom uppblåsning av en konstant, långsamt flöde av befuktad gas (5% CO2, 20% O2, 75% N2) på MEA .
- Efter 1200X förstärkning (MEA 1060, MCS), sampla signalen på 10 kHz med hjälp av MCS datainsamlingskort. Analysera data (spik och brast detektions) med en anpassad mjukvara 23.
- Karakterisera encelliga elektrofysiologiska aktivitet
- Överför täckglas som innehåller hiPSC-härledda neuronala kulturer till en nedsänkt fast steg inspelning kammare i en upprätt mikroskop. Record 20 min spontana aktionspotential framkallade postsynaptiska strömmar (sEPSC) 24. Identifiera den synaptiska händelsen med neurovetenskapliga program.
- Fix och färga hiPSC-härledda neuroner för MAP2, synapsin-1/2, och PSD-95 22, 24, 25. Kvantifiera antalet synapsin-1/2 och PSD-95 puncta använder bildanalysmjukvara.
Representative Results
Här har vi framgångsrikt ändrat ett protokoll där hiPSCs differentieras direkt i kortikala neuroner genom överuttryck av transkriptionsfaktorn neurogenin-2 12 och vi har anpassat den för användning av MEA. Detta tillvägagångssätt är snabb och effektiv att tillåta oss att få funktionella nervceller och nätverksaktivitet redan under den tredje veckan efter induktion av differentiering.
Under differentiering protokollet cellerna började morfologiskt att likna neuroner: små processer bildades och nervceller började ansluta till varandra (Figur 1A). Vi etablerade en neurofysiologisk profil av nervceller som härrör från en frisk kontroll hiPSC linje, genom att mäta deras neuronala morfologi och synaptiska egenskaper under utveckling. hiPSC-härledda neuroner färgades för MAP2 och synapsin-1/2 vid olika dagar efter startenav differentiering (Figur 2A). De härledda neuroner visar mogna neuronal morfologi redan 3 veckor efter induktion av differentiering. Antalet synapsin-1/2 puncta (ett mått för antalet synapser) kvantifierades baserat på synapsin-1/2 Immuncytokemi färgningar. Antalet synapsin-1/2 puncta ökade med tiden, vilket tyder på att nivån av nervkopplingar också ökar (Figur 2B). Antalet synapsin-1/2 puncta 23 dagar efter induktion av differentiering var liknande i två oberoende IPS linjer (figur 2C). Vid 23 DIV mest synapsin1 / 2 puncta var placerad intill PSD-95 puncta, som är indikativ för funktionella synapser (figur 2D).
I överensstämmelse med de resultat som beskrivs av Zhang et al., Genererade vi en population av excitatoriska övre skikt kortikala neuroner, vilket bekräftas av pan-neuronala och subtyp specifika kortikal m arkers såsom BRN2 och SATB2 (skiktet II / III). Vi observerade inte nervceller som var positiva för djup skikt neuroner CTIP2 (lager V) eller FOXP2 (skikt VI) (Figur 2E och F)
För att karakterisera den elektrofysiologiska aktiviteten hos hiPSC-härledda neuroner, använde vi helcells-ström- och spännings klämma inspelningar, dvs inneboende egenskaper och excitatoriska ingång på dessa neuroner mättes under utveckling. Neuronerna var i stånd att alstra aktionspotentialer redan en vecka efter av differentiering och procentandelen spiking celler ökat över tiden (figur 2G och H). Dessutom fick nervceller excitatoriska synaptiska input redan en vecka efter induktion av differentiering: både frekvens och amplitud av den excitatoriska synaptiska ingång ökade under utveckling (Figur 2I - K).
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> För att bättre förstå hur encelliga aktivitet kombinerar att bilda nätverk nivå funktioner, är det viktigt att studera hur nervceller fungerar i samförstånd In vitro neuronala nätverk odlade på MEA. utgöra ett värdefullt experimentell modell för att studera neuronala dynamik. Vi spelade 20 minuter av elektronätverksaktivitet av neuroner som härrör från en frisk kontroll hiPSC linje odlas på 6 brunnar MEA (Figur 2M). Några veckor efter induktion av differentiering, nervceller härrör från friska kontroll hiPSCs bildade funktionellt aktiva neuronala nätverk, visar spontana händelser (0,62 ± 0,05 spik / s; Figur 2N). i detta skede av utvecklingen (dvs. 16 d efter starten av differentiering) inga synkrona händelser som involverar alla kanaler . av MEA detekteras (figur 2O) nivån på nätverksaktivitet ökade under utveckling: under den fjärde veckan efter t han induktion av differentiering, visade neuronala nätverk hög spontan aktivitet (2,5 ± 0,1 spik / s, Figur 2N) i alla brunnar i enheten. De nätverk också uppvisade synkrona nätverks skurar (4,1 ± 0,1 brast / min, figur 2O) med lång varaktighet (2100 ± 500 ms).
Figur 1: hiPSC differentiering till nervceller. A. Tre tidpunkter av hiPSCs differentiering till neuroner på täck. B. plätering av hiPSCs på MEA. C. Astrocyter på 100% konfluens i T75-kolv (observera att cellerna bildar en mosaikmonolager). Skalstrecken: 150 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. hiPSC-härledda neuroner Characterization. A. hiPSC-härledda neuroner färgades för MAP2 (grön) och synapsin-1/2 (röd) vid olika dagar efter starten av differentiering. Skala bar: 10 pm. B. Kvantifiering av synapsin puncta i två oberoende experiment. I varje experiment minst 10 celler analyserades. C. Kvantifiering av synapsin puncta vid DIV23 i neuroner härledda från två oberoende IPS linjer. D. hiPSC-härledda neuroner färgades för PSD-95 (grön) och synapsin-1/2 (röd) 23 dagar efter starten av differentiering. Synapsin puncta är placerad intill PSD-95 puncta. E. hiPSC-härledda neuroner färgades för MAP2 (grön) och BRN2 (röd) eller SATB2 (röd) 23 d efter starten av differentiering. F. Procent av MAP2-positiva celler somvar positiva för indikerade markörer. G. Representativa Tång inspelningar som visar att aktionspotentialer kan genereras så tidigt som 7 d efter starten av differentiering. H. Andel av celler vid olika dagar efter induktion av differentiering som visar en eller flera aktionspotentialer. I. Representativa spår av excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) tas emot av hiPSC-härledda nervceller vid olika dagar efter differentiering. J. Frekvens av excitatoriska postsynaptiska strömmar under utveckling. K. amplitud av excitatoriska postsynaptiska strömmar under utveckling. L. representant spår av epsc inspelningar utan (kontroll) och med CNQX (CNQX). M. Neuroner härledd från en hiPSC linje odlades på en 6-brunnars MEA och nätverksaktivitet visas för hiPSC-härledda neuronala nätverk 16 och 23 d efter induktion av differentiering. Aktiviteten registrerades frånvarje brunn (samplingshastighet på 10 kHz) anges med en annan färg (5 minuter av 20 min av inspelningen är visade). N. eldhastighet 16 och 23 d efter induktion av differentiering. O. Bristning hastighet 16 och 23 d efter induktion av differentiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Mot bakgrund av resultaten, kan bedömas kvaliteten på de resulterande hiPSC härledda neuron genom att göra en neurofysiologisk profil av cellerna. Det vill säga tre till fyra veckor efter starten av differentiering, morfologin, synapsin-1/2-uttryck och elektrofysiologi av neuronerna kan bedömas. Vid denna tidpunkt, är hiPSC-härledda neuroner väntas visa en neuronal-liknande morfologi, att vara MAP2, synapsin / PSD-95 positiva när de utför immuncytokemi, och utställningent spontan elektrofysiologiska aktivitet (både på encelliga och nätverksnivå).
Discussion
Här har vi genomfört en effektiv hiPSC-differentiering protokoll publicerats av Zhang et al. (2013) 12 för att mäta aktiviteten nätverk av hiPSC härledda neuronala nätverk på MEA. Vi anpassade ursprungliga protokollet genom att skapa en rtTA / Ngn2 -positivt hiPSC linje innan framkalla neuronal differentiering. Detta ytterligare steg ger oss möjlighet att kontrollera neuronala celltätheten på MEA. Kontroll över den neuronala densitet var en viktig förutsättning för att anpassa protokollet till MEA och för att säkerställa konsekvens. För att mäta aktiviteten av neuronala nätverk med MEA, nervceller måste bilda täta nätverk direkt ovanpå MEA elektroderna 17,18. Detta kräver nödvändigtvis strikt kontroll över plätering tätheten av nervceller. Få den rätta / Ngn2 -positivt hiPSC linje möjliggör styrning av neuron densitet eftersom denna taktik inte förlitar sig på akut lentivirala transduktioner av hiPSCs före differentiering;få den rätta / Ngn2 -positiv hiPSC linje därför nästan eliminerar varje variation i det slutliga utbytet på grund av, till exempel, lentivirala toxicitet och variabel infektionseffektivitet.
Ett annat kritiskt steg av den experimentella proceduren är antalet av de rått astrocyter som samodlades med de differentierande hiPSCs. Astrocyter aktivt bidra till förfining av att utveckla nervbanor genom att styra synaps bildning, underhåll och eliminering, vilka alla är viktiga processer för neuronal funktion. Protokollet presenteras i detta dokument är mycket astrocyternas beroende: att färdigutvecklat och bildar funktionella synapser, nervceller kräver stöd från astrocyter. Vi upplevde att antalet astrocyter bör vara ungefär lika med antalet hiPSC-härledda neuroner för att stödja mognaden av neuronerna och bildningen av neuronala nätverk som uppvisar spontan aktivitet. Eftersom våra astrocyternas protokoll utbyten primär cell culturer med en begränsad livslängd, har isoleringen av rått astrocyter som skall utföras regelbundet.
Vår anpassning av protokollet publicerats av Zhang et al. (2013) 12 för användning med MEA teknik kommer sannolikt avsevärt förbättra vår förmåga att studera aktiviteten nätverk av hiPSC-härledda nätverk. Tidigare protokoll som används för att studera hiPSC-härledda neuronala nätverk med MEA förlitat sig på tidsödande differentieringsförfaranden 13-16. Protokollet från Zhang et al. (2013) ger en snabb alternativ, och vår modifiering avlägsnar en källa till variabilitet, vilket gör det nu mer lämpligt att använda hiPSC-härledda neuroner i kombination med MEA teknik, särskilt i hög genomströmning eller farmakologiska studier. Dessutom, eftersom den metod som publicerats av Zhang et al. (2013) 12 ger en homogen population av övre skikt kortikala neuroner, gör vår anpassade protokoll möjliga fokuserade studier i nätverket enctivity av denna särskilda neuronala delmängden.
Icke desto mindre har denna strategi också flera begränsningar. För det första kan homogenitet kulturerna också betraktas som en nackdel, eftersom kulturer är mindre benägna att likna in vivo nätverk, där olika typer av neuroner (dvs hämmande och excitatoriska neuroner) utgör en heterogen nätverk. För att ytterligare förbättra användningen av de hiPSC-härledda neuroner med MEA-teknik, kommer det att vara viktigt att utveckla snabba (transgen baserade) differentieringsprotokoll för andra neuronala cellpopulationer. Om protokollen blir tillgängliga, skulle in vitro nätverk härma in vivo nätverk närmare. För det andra, för närvarande rått astrocyter måste läggas till de hiPSC-härledda neuroner för tillväxt stöd, och därför den resulterande neuronala nätverket är inte en mänsklig neuronala nätverket egentlig bemärkelse. Pålitliga protokoll för differentiering hiPSCs i astrocyter kan i framtiden solve detta problem 26. För det tredje, tvådimensionella neuronala nätverk, som beskrivs här, är en begränsad modell för att studera komplexa tredimensionella in vivo neuronala nätverk. Lyckligtvis protokoll beskriver tredimensionella kulturer av råtta primära neuroner i kombination med MEA teknik finns redan tillgängliga 27,28. Framåtriktat, bör kombinationen av snabba differentieringsprotokoll för att erhålla hiPSC-härledda neuroner och astrocyter med tredimensionella odlingstekniker och MEA teknik ger nya insikter i de biologiska mekanismerna bakom neurologiska sjukdomar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lebovitz's L-15 medium | Gibco | 11415-064 | |
| B-27 supplement | Gibco | 0080085SA | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Ca2+/Mg2+-free HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| High-glucose DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| psPAX2 lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12259 | |
| Basement membrane matrix | Gibco | A1413201 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| E8 medium | Gibco | A1517001 | |
| ROCK inhibitor | Gibco | A2644501 | Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-5G | |
| G418 | Sigma-Aldrich | G8168-10ML | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| Vitronectin | Gibco | A14700 | |
| 6-well MEAs | Multi Channel Systems | 60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr | |
| Glass coverslips | VWR | 631-0899 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655-10MG | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891-5G | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| NT-3, human recombinant | Promokine | C66425 | |
| BDNF, human recombinant | Promokine | C66212 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| L-alanyl-L-glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768-100MG | |
| Straight fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251 | |
| Fine-tipped spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. Studying human disease using human neurons. Brain Res. , (2016).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Wu, H., et al. Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture. J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).
- Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Sci Rep. 6, 26181 (2016).
- Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Front Neurosci. 10, (2016).
- Heikkila, T. J., et al. Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro. Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).
- Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays. Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).
- Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces. J Neural Eng. 9 (2), (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079 (2013).
- Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J Vis Exp. (63), e3965 (2012).
- Ba, W., et al. ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function. Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).
- Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer. Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).
- Ba, W., et al. TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function. Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).
- Benevento, M., et al. Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling. Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci Rep. 4, 5489 (2014).
- Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model. J Vis Exp. (104), e53080 (2015).
