Summary
Vi endre og implementere en tidligere utgitt protokoll som beskriver den raske, reproduserbar og effektiv differensiering av menneskeskapte Pluripotent stamceller (hiPSCs) til eksitatoriske kortikale nevroner 12. Nærmere bestemt tillater vår modifikasjon for kontroll av neuronal celletetthet og bruk av mikroelektrodegrupper for å måle elektrofysiologiske egenskaper på nettverksnivå.
Abstract
Nerveceller dyrket ut fra menneskeskapte Pluripotent stamceller (hiPSCs) gir et lovende nytt verktøy for å studere nevrologiske lidelser. I det siste tiåret, har mange protokoller for å differensiere hiPSCs i nevroner blitt utviklet. Men disse protokollene er ofte langsom med høy variasjon, lav reproduserbarhet, og lav effektivitet. I tillegg er de nevroner som oppnås med disse protokollene er ofte umodne og mangler tilstrekkelig funksjonell aktivitet både ved encellede og nettverksnivå med mindre nervecellene blir dyrket i flere måneder. Delvis på grunn av disse begrensningene, funksjonelle egenskaper hiPSC-avledet nevrale nettverk er fortsatt ikke godt karakterisert. Her tilpasser vi en nylig publisert protokoll som beskriver produksjonen av menneskelige nerveceller fra hiPSCs av tvang uttrykk for transkripsjonsfaktoren neurogenin-2 12. Denne protokollen er hurtig (givende modne neuroner i løpet av 3 uker) og effektiv, med nesten 100% omdannelse effektiviteten av sensorer,ed-celler (> 95% av DAPI-positive celler er MAP2 positive). Videre gir den protokoll en homogen populasjon av eksitatoriske neuroner som ville tillate undersøkelse av celletypespesifikke bidrag til nevrologiske lidelser. Vi har endret den opprinnelige protokoll ved å generere stabilt transduserte hiPSC celler, noe som gir oss eksplisitt kontroll over det totale antall nerveceller. Disse cellene blir deretter brukt til å generere hiPSC-avledede nevrale nettverk på mikroelektrodegrupper. På denne måte kan den spontane elektrofysiologisk aktivitet av hiPSC-avledede nevrale nettverk måles og karakterisert, og samtidig beholde interexperimental konsistens i form av celletetthet. Den presenterte protokollen er bredt anvendelig, spesielt for mekanistiske og farmakologiske studier på mennesker nevrale nettverk.
Introduction
Utviklingen av menneskeskapte Pluripotent stamceller (hiPSCs) differensieringsprotokoller for å generere menneskelige nevroner in vitro har gitt et kraftig nytt verktøy for å studere nevrologiske lidelser. Inntil nylig var studiet av disse lidelser sterkt hemmet av mangel på modellsystemer med humane nerveceller. Selv om gnagere kan brukes til å studere nevrologiske lidelser, kan resultatene av slike studier ikke oversettes lett til mennesker 1. Gitt disse begrensningene, hiPSC avledete neuroner er et lovende alternativ modell som kan brukes til å belyse molekylære mekanismer underliggende nevrologiske lidelser, og for in vitro legemiddelscreening.
I det siste tiåret, til flere protokoller konvertere hiPSCs i nerveceller er utviklet 2-8. Imidlertid er disse protokollene fremdeles begrenset på mange måter. Først protokollene er ofte tidkrevende: generere nevroner med tilstrekkelig modning (dvs. synapse formasjonen) og funksjonell aktivitet krever måneder med dyrknings prosedyrer, som gjengir store studier vanskelige 9. I tillegg er lav hiPSC-til-neuron omdannelseseffektiviteten. Protokoller ofte gir en heterogen populasjon av nerveceller, og således tillater ikke studier av spesifikke undersett av nevronale celler. Videre protokollene er ikke reproduserbare, noe som ga forskjellige resultater for forskjellige IPSC linjer 10,11. Til slutt, modningen trinnet og funksjonelle egenskaper til de resulterende neuroner er også variable 10.
For å løse disse problemene, Zhang et al. (2013) 12 utviklet en protokoll som raskt og reproduserbart genererer menneskelige nerveceller fra hiPSCs ved overekspresjon transkripsjonsfaktor neurogenin-2. Som rapportert av forfatterne, oppstår differensiering forholdsvis raskt (bare 2 - 3 uker etter indusering av ekspresjon av neurogenin-2), er reproduserbar protokollen (neuronal egenskaper er uavhengig av starting hiPSC linje), og den hiPSC-til-neuron-konvertering er svært effektiv (nesten 100%). Den populasjon av nerveceller som er generert med deres protokollen er homogen (likner øvre lag kortikale nevroner), slik at undersøkelse av celletypespesifikke bidrag til nevronale lidelser. Videre deres hiPSC-avledede nevroner utstilt modne egenskaper (f.eks, evnen til å danne synapser og robust funksjonell aktivitet) etter bare 20 d.
Karakterisere elektrofysiologiske egenskapene til hiPSC avledete neuroner på nettverksnivå er en viktig forutsetning før hiPSC teknologi kan utnyttes for studiet av menneskelige sykdommer. Av denne grunn har mange forskningsgrupper nylig begynt å undersøke stamcelle-avledede nevroner på nettverksnivå ved hjelp av mikro-elektrode array (MEA) enheter (flerkanalsystemer, Reutlingen, Tyskland) 13-16. Elektrodene på en MEA er innleiret i et substrat på hvilket nevronale celler kan dyrkes.MEAs kan brukes til å utforske de elektrofysiologiske egenskapene til nevrale nettverk og in vitro utviklingen av deres aktivitet. Foreløpig er MEAs bare brukes i kombinasjon med differensiering protokoller som tar flere måneder for å gi modne nettverk. Derfor kombinerer MEAs med en rask differensiering protokoll bør legge til rette for bruk av denne teknologien i stor skala studier av nevrologiske lidelser.
Her presenterer vi en modifikasjon av Zhang et al. (2013) 12 protokollen og tilpasse den til bruk på MEAs. Nærmere bestemt, i stedet for å stole på en akutt lentiviral transduksjon, vi i stedet opprettes hiPSC linjer som stabilt uttrykker rtTA / Ngn2 før indusering av differensiering. Vi gjorde dette først og fremst å ha reproduserbar kontroll med neuronal celletetthet, ettersom den nevronale celletettheten er kritisk for neuronal nettverkdannelse, og for god kontakt mellom nevroner og elektrodene på MEA 17,18. although Zhang et al. Protokollen er meget effektiv med hensyn til omdannelse av transduserte hiPSCs, er det iboende variabel med hensyn til det endelige utbyttet av neuroner fra antallet hiPSCs belagt innledning (se figur 2E i Zhang et al.) 12. Med en stabil linje, eliminerer vi mange saker som forårsaker variasjon, for eksempel lentiviral giftighet og infeksjon effektivitet. Vi optimalisert parametrene som pålitelig produserer hiPSC-avledet nevrale nettverk på MEAs, skaffe nettverk modning (f.eks synkrone hendelser som involverer et flertall av kanalene) av den tredje uken. Denne raske og pålitelige protokollen bør gjøre direkte sammenligninger mellom nevroner avledet fra forskjellige (dvs. pasientspesifikk) hiPSC linjer samt gi robust konsistens for farmakologiske studier.
Protocol
Alle forsøk på dyr ble utført i samsvar med godkjente dyr omsorg og retningslinjer for bruk av Care komiteen Animal, Radboud University Medical Centre, Nederland, (RU-desember-2011-021, protokollnummer: 77073).
1. Glia Cell Isolering og kultur
MERK: Protokollen som presenteres her er basert på arbeidet til McCarthy og de Vellis 19, og en svært lik detaljert protokoll for mus astrocytter er tilgjengelig 20. For å generere primærkulturer av kortikale astrocytter fra embryonale (E18) rottehjerner, trenger en gravid rotte å bli ofret, embryoene må høstes fra livmoren, og hjernen trenger å bli isolert fra embryoer. For å fylle en T75 kolbe, de cortices fra 2 embryonale hjerner må kombineres. Som et alternativ, kan kommersielt tilgjengelige rensede og frosne astrocytter kjøpes.
- Klargjør T75 kultur kolbe
- Fortynnet Poly-D-lysin (PDL) isterilt, ultrarent vann til en sluttkonsentrasjon på 10 ug / ml. Tilsett 5 ml av den fortynnede PDL til T75 kulturflaske. Swish rundt forsiktig å fukte hele veksten overflaten. Plassere kolben i en fuktet 37 ° C inkubator i 3 timer.
- Aspirer PDL fra kolben. Skyll kolben med 3 x 5 ml sterilt vann for å fjerne ubundet PDL. Aspirer vannet helt. Forlater kolben for å tørke i en laminær strømningshette eller brukes umiddelbart.
- Disseksjon av korteks
- Forbered 50 ml disseksjon medium: Lebovitz L-15 medium med 2% (v / v) B-27 supplement. Hold på is.
- Anesthetize rotte dypt med isofluran i en induksjonskammeret (små pleksiglass boks) til respirasjon opphører (~ 5-8 min). Fjern rotte fra induksjonskammeret og umiddelbart avlivet ved cervikal dislokasjon.
- Spray buken av rotte med 70% EtOH og tørk vekk overflødig. Avsløre og fjerne livmor fra demningen via keisersnitt sectipå å bruke en saks 21.
- Skjær enkelte embryoer fra sine fosterblærer med saks, overføre til en steril petriskål fylt med kaldt disseksjon medium, og holde på is.
- Overfør embryoer på nytt til en ny, steril 6 cm petriskål fylt med kaldt disseksjon medium. Utdrag hjerner fra embryoene under et stereomikroskop. Å utsette hjernen, forsiktig skrelle bort huden og hodeskallen ved hjelp av tang. Forsiktig øse ut hele hjernen og overføre til en 35 mm petriskål med friskt, kaldt disseksjon medium.
MERK: Hele hjernen dissekert fra embryo kan lagres i disseksjon medium på is i mange timer uten å miste mobilnettet levedyktighet. - Skill de to halvkuler av hver hjerne ved å skjære gjennom midtlinjen med fine spisser våren saks eller en skalpell. Nøye kle av hjernehinnene med rette fin-tipped tang.
MERK: Det er svært viktig å fjerne hjernehinnene helt. ther hindrer fibroblast forurensning av astrocytt kulturen. Fibroblaster er raskt delende celler, og vil etter hvert forskyve de andre cellene. - Ta av midthjernen / striatum og luktelappen med våren saks eller en skalpell. Pass også på å fjerne hippocampus (C-formet struktur som er perimedian og hale med hensyn til cortex) med våren saks eller en skalpell. Samle kortikale halvkuler i et 15 ml sentrifugerør fylt med 5 ml disseksjon medium. Hold på is.
- Dissosiasjon av korteks
- Forbered 2 ml Ca 2+ / Mg 2+ -fri Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med 0,25% trypsin (dissosiasjon medium). Forbered 50 mL høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 15% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin (kultur medium) og filtersteriliser.
- La vevet slå seg ned til bunnen av sentrifugerøret. nøye sompirat så mye av disseksjon medium som mulig fra ovenfor vevet. Vask vev med 5 ml Ca2 + / Mg2 + -fri HBSS (uten trypsin), og la vev for å slå seg ned på bunnen av røret.
- Nøye aspirer HBSS. Tilsett 2 ml dissosiasjon medium og flick røret forsiktig for å blande enzymet rundt vev. Inkuberes i et 37 ° C vannbad i 5-10 min. Flick røret et par ganger under inkubasjon å agitere vevet.
- Umiddelbart triturer vev ved hjelp av en 1000 mL pipette tips. Sett pipetter volumet til 800 mL. Aspirer stykkene og støte kraftig mot den side av røret, rett ovenfor fluidledningen. Men prøv å minimere bobler eller skumming. Gjenta til vevet er tilstrekkelig dissosiert, ca 15 - 20x. Tilsett 8 ml kulturmedium for å inaktivere trypsin. Bland forsiktig ved å snu røret flere ganger.
- Passere cellesuspensjonen gjennom et 70 mikrometer celle sil plassert på toppen av en 50 mL sentrifugerør. Skyll 15 ml rør med kulturmedium og filtrere mediet gjennom cellen sil for å samle mediet i 50 ml rør med cellesuspensjonen. Skyll celle sil noen ganger med kulturmediet. Etter skylling, bør det endelige volum være omtrent 20 - 25 ml.
- Pellet cellene ved 200 xg i 10 min. aspirere nøye så mye medium som mulig, uten å berøre cellepelleten. Resuspender cellene i 1 ml kulturmedium ved anvendelse av en 1000 ul pipette. Legg 11 ml forvarmet kulturmedium og bland forsiktig (for å hindre at bobler) ved anvendelse av en 10 ml pipette.
- Skyll PDL-belagte T75 kolbe gang med 5 ml kulturmedium. Aspirere mediet og overføre cellesuspensjonen til kolben. Alle cellene er i suspensjonen er belagt, og vi finner det vanligvis unødvendig å telle dem, ettersom astrocytter ikke kan skilles fra andre celler i suspensjonen. Plassere kolben i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO 2 feller to dager.
- Ekspansjon og vedlikehold av astrocytter
- Bytt ut hele medium for første gang 2 d etter første platekledning. Bytt ut hele medium etterpå hver 3 d. Alltid prewarm det friskt medium til 37 ° C før tilsetning til cellene.
MERK: astrocytter krever 7-10 d å nå ca 90% konfluens (de astrocytter vises som en tettpakket tessellated enkeltlag, med microglia og oligodendrocytes liggende oppå og blandet). - Når astrocytter når tilnærmet 90% konfluens, ristes kolben for å fjerne kontaminerende gliacellene:
- Fjern kolben fra inkubatoren og stramme hetten (fenol) eller dekke port (filtrert). For å fjerne mikroglia, ristes kolben på en orbital plattformen ved 180 rpm i 1 time. Aspirer medium. Skyll en gang med 5 ml forvarmet dyrkingsmedium, aspirer og erstatte med 12 ml kulturmedium.
- Å fjernede oligodendrocytter, returnerer kolben til orbital plattformen og riste ved 250 opm, 37 ° C i minst 7 timer, men fortrinnsvis O / N.
- Aspirer medium. Skyll en gang med 5 ml forvarmet dyrkingsmedium, aspirer og erstatte med 12 ml kulturmedium. Returner kolben til inkubatoren.
- Ved 100% konfluent, delt astrocytter ved anvendelse av standardprosedyrer ved et forhold på 1: 3 til 1: 2 med 0,05% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). En T75 kolbe på 100% konfluens vil typisk gi ca 4,0 x 10 6 celler totalt. Under denne planen, kan de kulturene vanligvis deles en gang per uke.
MERK: Når astrocytter når konfluens, kan de bli høstet og benyttet for hiPSC differensiering som beskrevet nedenfor i protokoll trinn 3.4. Astrocyttene kan deles opp i minst en gang uten et merkbart tap av levedyktighet. De kan opprettholdes i inntil 2 måneder i kultur. Av erfaring, primært embryonale dag 18 rotte astrocytter progressively bli terminalt differensiert og / eller miste levedyktighet etter gjentatte splitting. Selv om det er mulig å fryse astrocyttene for fremtidig bruk, foretrekker vi å isolere astrocytter fra friske embryonale hjerne når det er nødvendig.
- Bytt ut hele medium for første gang 2 d etter første platekledning. Bytt ut hele medium etterpå hver 3 d. Alltid prewarm det friskt medium til 37 ° C før tilsetning til cellene.
2. Generering av rtTA- / Ngn2 -positivt hiPSCs
MERK: hiPSCs brukes for våre eksperimenter ble generert internt av lentiviral transduksjon av menneskelige fibroblaster med omprogrammering faktorer cMYC, SOX2, OCT4 og KLF4.
MERK: For generering av rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs er lentiviral vektorer som brukes til å stabilt integrere transgener i genomet av hiPSCs. Protokollen for fremstilling av lentivirus er tidligere publisert 22. Detaljene av lentivirale emballasje vektorer som brukes til å produsere de rtTA- og Ngn2 lentivirus-partikler er gitt i
- Plate hiPSCs (dag 1)
MERK: Volumene som er nevnt i denne protokollen anta at hiPSCs dyrkes i en 6 brønn plate og at cellene i en brønn er høstet. I tillegg er det antatt at cellene blir sådd ut senere i 12 brønner i en 12-brønners plate.- Forbered 10 ml kald DMEM / F12 med 1% (v / v) basalmembran Matrix (BMM) under dannelse av fortynnet BMM. Legg 800 mL fortynnet BMM per brønn i en 12 brønners plate. Inkuberes i minst 1 time i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Før bruk, Inkuber platen i 1 time ved RT.
- Varm 15 ml Essential 8 (E8) medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin, 9 ml DMEM / F12 og 1 ml celle løsrivelse løsning (CDS) til romtemperatur. Supplere E8 medium med Rho-assosiert protein kinase (ROCK) hemmer.
- Aspirer brukt medium av hiPSCs end tilsett 1 ml CDS til hiPSCs. Inkuber 3 - 5 minutter i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er løsne fra hverandre.
- Tilsett 2 ml DMEM / F12 i brønnen, forsiktig suspendere cellene med en 1000 ul pipette og overføre cellene til en 15 ml tube. Legg 7 ml DMEM / F12 til cellesuspensjonen. Spinne cellene ved 200 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og tilsett 2 ml av den tilberedte E8 medium. Oppnå en cellesuspensjon hvor hiPSCs dissosiert (ikke danner celleklumper) ved å sette spissen av en 1000 ul pipette mot siden av 15 ml rør og resuspendering av cellene forsiktig. Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er dissosiert.
- Bestemme antall celler (celler / ml) ved anvendelse av et hemocytometer kammer.
MERK: En seks brønn plate vel på 80-90% konfluens vil typisk gi 3,0 - 4,0 x 10 6 celler totalt. - Sugden fortynnede BMM fra brønnene i 12 brønners plate. Fortynn cellene for å oppnå en celle-suspensjon av 3,0 x 10 4 celler / ml. Plate 1 ml av cellesuspensjonen pr brønn av 12 brønn plate. Plasser 12 brønn plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
- Transduce de iPS celler med rtTA- og Ngn2 lentivirus (dag 2)
- Varm 12 ml E8 medium med 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin til romtemperatur. Supplere E8 medium med ROCK-inhibitor og polybren til en sluttkonsentrasjon på 8 mg / ml til E8 medium.
- Tine porsjoner med lentivirus suspensjon. Legg polybren til en sluttkonsentrasjon på 8 mg / ml til lentivirus suspensjon. Aspirer brukte medium og tilsett 1 ml av den tilberedte E8 medium til hver brønn.
- Utfør transduksjon med ulike mengder av rtTA- - og Ngn2 -lentivirus suspensjoner. For eksempel, transduCE hiPSCs ved å tilsette 100 mL av både rtTA- -lentivirus og Ngn2 -lentivirus suspensjon til en brønn på 12-brønners plate. For de øvrige brønnene, bruke 200 mL, 300 mL, 400 mL og 500 mL lentivirus suspensjon i stedet for 100 mL. De hiPSCs av to brønner på 12 brønners plate bør ikke transduced; de vil tjene som kontroller under valget.
MERK: transductions blir fortrinnsvis utført i duplikat, slik at transduksjon effektivitet kan beregnes mer nøyaktig etter starten av det merkede (se protokoll trinn 2.2.4). Mengden av lentivirus suspensjon som er nødvendig for effektivt å omsette størstedelen av hiPSCs avhenger av titer av lentivirus suspensjonen og hiPSC linje som er brukt. I denne studien bruker vi vanligvis 100 - 500 mL av lentivirus suspensjon til transduce de hiPSCs. - Plasser 12 brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2 til 6 timer. Før slutten av den 6 timers inkubasjonstiden, varm 12 ml E8 medium med 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin og 12 ml Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) til RT. Supplere E8 medium med ROCK hemmer.
- Aspirer brukt E8 medium. Vask hver brønn med 1 ml DPBS. Tilsett 1 ml av den tilberedte E8 medium til hver brønn. Plasser 12 brønn plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
- Oppdater E8 medium (dag 3)
- Varm 12 ml E8 medium med 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin til RT. Aspirer brukte mediet fra brønnene i 12 brønners platen og tilsett 1 ml av den fremstilte E8 medium til hver brønn. Plasser 12 brønn plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
- Utfør utvalg med puromycin og G418 (dag 4-8)
MERK: Avhengig av celledeling frekvensen av HIPSC linje og effektiviteten av lentiviral transduksjon, kan cellene nå 70 - 80% konfluens i utvelgelses periode, på hvilket punkt kulturen må splittes. På grunn av at tidspunktet for splitting ikke kan forutsies på forhånd, vil det ikke bli nevnt i protokollen. Men i stedet for å oppdatere E8 medium supplert med de nevnte konsentrasjoner av puromycin og G418, kan man dele hiPSC kulturen som en normal hiPSC kultur (inkludert plating av cellene på vitronektin-belagte plater). Det eneste unntaket er at E8 mediet bør suppleres med de nevnte konsentrasjoner av antibiotika for å fortsette valget.- Varm 12 ml E8 medium med 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin til romtemperatur. Legg puromycin og G418 for valg; forskjellige mengder av antibiotika tilsettes under utvalgsperioden (tabell 1).
- Anslå effektiviteten av transduksjon ved å beregne prosentandelen av G418- og puromycin-resistente celler. For å beregne prosentandelen av resistente celler, beregne prosentandelen av døde celler (nonresistant celler) for de forskjellige forhold (kulturene transdusert med de forskjellige mengder av lentivirus suspensjon) og for nontransduced celler (cellene som tjener som et utvalg kontroll). Beregn prosentandelen av resistente celler som [100% - (prosentandel av døde celler)].
MERK: Dersom transductions med de forskjellige mengder av lentivirus suspensjon ble utført i duplikat, kan transduksjon effektiviteten beregnes mer nøyaktig. Tilstanden med de ikke-transduced celler fungerer som et utvalg kontroll; prosentandelen av døde celler i kulturene transdusert med de forskjellige mengder av lentivirus suspensjon bør være lavere. Den estimerte andelen resistente celler brukes til å velge de hiPSCs som sannsynligvis positiv for begge transgener. Generelt velger vi de hiPSCs fra transduksjon tilstand var> 90% av celles overleve fem d utvalget periode. - Aspirer brukt medium av hiPSCs og tilsett 1 ml av den tilberedte E8 medium til brønnene. Plasser 12 brønn plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
| Sluttkonsentrasjon av G418 | Sluttkonsentrasjon av puromycin | |
| dag 4 | 250 ug / mL | 2 ug / mL |
| dag 5 | 250 ug / mL | 2 ug / mL |
| dag 6 | 250 ug / mL | 1 pg / ml |
| dag 7 | 250 ug / mL | 1 pg / ml |
| dag 8 | 250 ug / mL | 1 pg / ml |
Tabell 1: Konsentrasjonene av antibiotika i utvelgelsesperioden.
- Stopp valg og begynne vanlig dyrking (dag 9 og senere)
- Etter 5 d utvalg periode, kultur de rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs som normale hiPSCs, med unntak av at det E8 medium av cellene er supplert med G418 til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml og med puromycin til en sluttkonsentrasjon på 0,5 ug / mL.
MERK: Cellene kan nå bli frosset (i henhold til standard protokoller for nedfrysing av celler) for å tjene som sikkerhetskopi. Dette er et viktig skritt for reproduserbarheten av differensiering protokollen, fordi den tillater bruk av den samme batch av rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs for mange fremtidige differensierings eksperimenter.
- Etter 5 d utvalg periode, kultur de rtTA / Ngn2 -positive hiPSCs som normale hiPSCs, med unntak av at det E8 medium av cellene er supplert med G418 til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml og med puromycin til en sluttkonsentrasjon på 0,5 ug / mL.
3. Differensiering av rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs til Nerveceller på 6-brønnenMEAs og dekkglass
MERK: I denne protokollen, er det gitt nærmere detaljer for å differensiere rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs på to forskjellige underlag, dvs. seks-brønns Meas (enheter består av 6 selvstendige brønner med 9-opptak og en referanseinnebygde mikroelektroder per brønn) og dekkglass i brønnene i en 24-brønns plate. Protokollene kan imidlertid lett tilpasses for større substrater (for eksempel, for brønnene i 12- eller 6-brønners plater), ved å skalere opp de nevnte verdier i henhold til det overflateareal.
- Forbered MEAs eller dekkglass (dag 0 og dag 1)
- Dagen før starten av differensiering, sterilisere MEAs i henhold til produsentens anbefaling.
- Fortynn bindingsproteinet, Poly-L-Ornitin (PLO) i sterilt ultrarent vann til en sluttkonsentrasjon 50 ug / ml. Coat den aktive elektroden område av seks-brønns MEAs ved å plassere en 100 mLslipp av den fortynnede PLO i hver brønn. Plassere objektglassene i brønnene i 24-brønns plate ved hjelp av sterile pinsetter. Legg 800 mL av den fortynnede PLO i hver brønn. Forhindre glassene fra flytende ved å dytte dem ned med 1000 mL pipette tips.
- Inkuber 6-brønns MEAs og 24-brønns plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Neste dag, aspirer utvannet PLO. Vask glassflater i de seks-brønns MEAs og Dekk to ganger med sterilt ultrarent vann.
- Fortynn laminin i kaldt DMEM / F12 til en sluttkonsentrasjon på 20 ug / ml (for 6-brønners MEAs) og 10 ug / ml (for dekkglass). Umiddelbart belegge det aktive elektrodeareal på 6-brønners MEAs ved å plassere en dråpe 100 ul i hver brønn. På samme måte, tilsett 400 ul av den fortynnede laminin i hver brønn på 24-brønners plate for å belegge dekkglass. Forhindre glassene fra flytende ved å dytte dem ned med 1000 mL pipette tips.
- Inkuber 6-brønns MEAs og 24 brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2 i minst 2 timer.
- Plate hiPSCs (dag 1)
MERK: Volumene som er nevnt i trinn 3.2.1 - 3.2.4 anta at rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs dyrkes i en seks-brønns plate og at cellene i en brønn er høstet. Mengdene som er nødvendig for plating av cellene på 6-brønners MEAs og / eller objektglassene avhenger av antall av seks-brønners MEAs og / eller antallet av dekkglass som er brukt i eksperimentet; tallene som er angitt i trinn 3.2.6 - 3.2.8 tillater skalering til ulike forsøks størrelser.- Varme DMEM / F12, CDS og E8 medium med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til R / T. Legg doksycyklin til en endelig konsentrasjon på 4 mg / ml og ROCK inhibitoren til E8 medium.
- Aspirer brukt medium av rtTA- / Ngn2 -positive hiPSCs og tilsett 1 mL CDS til hiPSCs. Inkuber 3 - 5 minutter i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2. Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er løsne fra hverandre.
- Tilsett 2 ml DMEM / F12 i brønnen, forsiktig suspendere cellene med en 1000 ul pipette og overføre cellene til en 15 ml tube. Legg 7 ml DMEM / F12 til cellesuspensjonen. Spinne cellene ved 200 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og tilsett 2 ml av den tilberedte E8 medium. Dissosiere hiPSCs ved å sette spissen av en 1000 ul pipette mot siden av 15 ml rør og resuspendering av cellene forsiktig. Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er dissosiert.
- Bestemme antall celler (celler / ml) ved anvendelse av et hemocytometer kammer.
MERK: En seks-brønns plate vel på 80-90% konfluens vil typisk gi 3,0 - 4,0 x 10 6 celler totalt. - Aspirer utvannet laminin. For de seks-brønns MEAs, fortynne cellene for å få en cell suspensjon av 7,5 x 10 5 celler / ml. Plate cellene ved å tilsette en dråpe av 100 ul av cellesuspensjonen på det aktive elektrodeareal i hver brønn av seks-brønners Meas. For glassene, fortynn cellene for å oppnå en celle-suspensjon av 4,0 x 10 4 celler / ml. Plate cellene ved tilsetning av 500 ul av cellesuspensjonen til brønnene i 24-brønns plate.
MERK: Den endelige celletetthet på MEAs er høyere enn på glassene (figur 1A og B). Vi fant at denne høy celletetthet var nødvendig for riktig registrering av nettverksaktivitet. I protokollen, tallene er gitt som viste seg å være optimal for analysene. - Plasser 6-brønns MEAs og 24 brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2 i 2 timer (MEAS) eller O / N (24 brønnsplate).
- Etter 2 timer, tilsett forsiktig 500 ul av den tilberedte E8 medium til hver brønn av seks-brønners Meas. Sett 6-vill MEAs O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
- Endre medium (dag 2)
- Den neste dag, forberede DMEM / F12 med 1% (v / v) N-2-supplement, 1% (v / v) ikke-essensielle aminosyrer og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin. Legg human rekombinant neurotrofin-3 (NT-3) til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml human rekombinant hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml, og doksycyklin til en sluttkonsentrasjon på 4 ug / ml. Varm opp mediet til 37 ° C.
- Legg laminin til en endelig konsentrasjon på 0,2 ug / ml til mediet. Filtrer den resulterende medium. Aspirer brukt medium fra brønnene på seks-brønns MEAs og 24-brønns plate og erstatte den med den forberedte medium. Inkuber 6-brønns MEAs og 24-brønns plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
- Legg rotte astrocytter (dag 3)
MERK: Volumene som er nevnt i denne protokollen anta at rotte astrocytter dyrkes i T75 kulturflasker. Det er viktig at rotte astrocytter som er lagt til kulturene er av god kvalitet. Vi bruker to kriterier for å kontrollere om rotte astrocytter er av god kvalitet. Først skal rotten astrocytt kulturen være i stand til å vokse konfluente i løpet av ti dager etter isolering fra rotte embryonale hjerner. For det andre, etter å splitte rotte astrocyte kultur, bør rotte astrocytter kunne danne en konfluent, tessellated enkeltlag (figur 1C). Hvis rotta astrocyte kultur ikke oppfyller disse to kriteriene, anbefaler vi ikke å bruke denne kulturen for differensiering eksperimenter.- Varm 0,05% trypsin-EDTA til RT. Varm DPBS og DMEM / F12 med 1% (v / v) penicillin / streptomycin til 37 ° C.
- Aspirer brukte medium av rotte astrocytt kulturen. Vask kulturen ved å tilsette 5 ml DPBS og swish den rundt forsiktig.
- Aspirspiste DPBS og tilsett 5 ml 0,05% trypsin-EDTA. Swish trypsin-EDTA rundt forsiktig. Inkuber i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2 i 5 - 10 min.
- Sjekk under mikroskopet hvorvidt cellene er frittliggende. Løsne de siste cellene ved å treffe flasken et par ganger.
- Tilsett 5 ml DMEM / F12 til kolben. Triturer cellene forsiktig inn i kolben med en 10 ml pipette. Samle cellesuspensjonen i et 15 ml rør. Spinn rør ved 200 xg i 8 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 1 ml DMEM / F12. Bestemme antall celler (celler / ml) ved anvendelse av et hemocytometer kammer.
- Legg 7,5 x 10 4 astrocytter per brønn av de seks-brønns MEAs. Tilsett 2,0 x 10 4 astrocytter per brønn på 24-brønners plate. Inkuber MEAs og den 24-brønns plate O / N i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
- Endre medium (dag 4)
- Filtrer mediet og varm til 37 ° C. Aspirer brukt medium fra brønnene på seks-brønns MEAs og 24-brønns plate og erstatte den med den forberedte medium. Opprettholde de seks-brønns MEAs og den 24-brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
MERK: Starter fra dag 6, oppdatere halvav mediet annenhver dag. Fra dag 10 og utover, er det medium supplert med FBS for å støtte astrocytt levedyktighet.
- Forbered Neurobasal medium med 2% (v / v) B-27 supplement, 1% (v / v) L-alanyl-L-glutamin og 1% (volum / volum) penicillin / streptomycin. Legg NT-3 til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml BDNF til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml, og doksycyklin til en endelig konsentrasjon på 4 ug / ml. Fra dag 10 og utover, også supplere medium med 2,5% (v / v) FBS. Filtrer det resulterende medium og varm til 37 ° C.
- Fjerne halvparten av det brukte mediet fra brønnene på seks-brønns MEAs og den 24-brønns plate ved anvendelse av en 1000 ul pipette og erstatte den med den preparerte medium. Opprettholde de seks-brønns MEAs og den 24-brønners plate i en fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
4. Etablere den nevrofysiologiske profil av hiPSC-avledet Nerveceller
MERK: To til tre uker etter iproduksjon av differensiering, kan de hiPSC-avledede nevroner brukes til ulike nedstrøms analyser. I denne delen er eksempler på noen nedstrøms analyser gitt som kan utføres for å etablere den nevrofysiologiske profil av hiPSC-avledede nevroner.
- Karakteriserer nevronale nettverk aktivitet ved hjelp MEAs
- Record 20 min av elektrofysiologisk aktivitet av hiPSC-avledet nerveceller dyrket på MEAs. Under innspillingen, holde temperaturen ved 37 ° C, og forebygge fordampning og pH-forandringer i mediet ved å blåse en konstant, langsom strøm av fuktet gass (5% CO2, 20% O2, 75% N 2) på MEA .
- Etter 1200X forsterkning (MEA 1060, MCS), sample signalet på 10 kHz bruker MCS datainnsamling kort. Analysere dataene (pigg og brast gjenkjenning) ved hjelp av en egendefinert programvarepakke 23.
- Preger encellede elektrofysiologisk aktivitet
- Overfør dekkglass som inneholder hiPSC-avledet nevronale kulturer til en neddykket fast scene opptak kammer i en oppreist mikroskop. Record 20 min av spontane aksjonspotensial fremkalt postsynaptiske strømmer (sEPSC) 24. Oppdage den synaptiske hendelse ved hjelp av nevrovitenskapelig program.
- Fest og beis hiPSC-avledede nevroner for MAP2, synapsin-1/2, og PSD-95 22, 24, 25. Kvantifisere antallet synapsin-1/2 og PSD-95 puncta bruker bildeanalyse programvare.
Representative Results
Her har vi lykkes modifiserte en protokoll der hiPSCs er differensiert direkte inn i kortikale nevroner ved over-uttrykker transkripsjonsfaktoren neurogenin-2 12 og vi har tilpasset det for bruk av Meas. Denne tilnærmingen er rask og effektiv slik at vi kan få funksjonelle nevroner og nettverksaktivitet allerede i løpet av den tredje uken etter induksjon av differensiering.
I løpet av differensieringen protokollen, cellene morfologisk begynte å ligne neuroner: små prosesser ble dannet og begynte neuroner tilkobling til hverandre (figur 1 A). Vi etablerte en nevrofysiologisk profil av nevroner avledet fra en frisk-kontroll hiPSC linje, ved å måle deres neuronal morfologi og synaptiske egenskaper under utvikling. hiPSC-avledede nevroner ble farget for MAP2 og synapsin-1/2 på forskjellige dager etter startav differensiering (figur 2A). De avledede neuroner viser modne neuronal morfologi allerede 3 uker etter induksjon av differensiering. Antallet synapsin-1/2 puncta (et mål for antallet av synapser) ble kvantifisert basert på synapsin-1/2 immunocytokjemi stainings. Antallet synapsin-1/2 puncta økt over tid, noe som tyder på at nivået av neuronal tilkobling er også øker (figur 2B). Antallet synapsin-1/2 puncta 23 dager etter induksjon av differensiering var lik i to uavhengige IPS linjer (figur 2C). På 23 DIV mest synapsin1 / 2 puncta ble sidestilt med PSD-95 puncta, som er veiledende for funksjonelle synapser (figur 2D).
I samsvar med resultatene som er beskrevet av Zhang et al., Genererte vi en populasjon av eksitatoriske øvre lag kortikale nevroner, bekreftet ved pan-neuronal og subtype-spesifikke cortical m arkers som BRN2 og SATB2 (lag II / III). Vi observerte ikke nevroner som var positive for dypt lag nevroner CTIP2 (lag V) eller Foxp2 (lag VI) (Figur 2E og F)
For å karakterisere elektrofysiologisk aktivitet av hiPSC-avledede nevroner, brukte vi hel-celle strøm og spenning klemme opptak, dvs. iboende egenskaper og stimulerende innspill på disse nevronene ble målt under utvikling. Neuronene var i stand til å generere aksjonspotensialer allerede en uke etter av differensiering og prosentandelen av spiking celler var øker over tid (figur 2G og H). Videre neuronene mottatte eksitatorisk synaptisk inngang allerede en uke etter induksjonen av differensiering: både frekvens og amplitude av den eksitatoriske synaptiske inngangen økes under utvikling (figur 2I - K).
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> For bedre å forstå hvordan encellede aktivitet kombinerer å danne nettverk-nivå funksjoner, er det viktig å studere hvordan nervecellene fungerer på konsert In vitro nevrale nettverk dyrket på MEAs. utgjør en verdifull eksperimentell modell for å studere nevrale dynamikk. Vi spilte inn 20 min av elektro nettverk aktivitet av nerveceller avledet fra en frisk-kontroll hiPSC linje dyrket på 6-brønners MEAs (figur 2M). Noen uker etter induksjon av differensiering, nevronene avledet fra friske kontroll hiPSCs dannet funksjonelt aktive nevrale nettverk, viser spontane hendelser (0,62 ± 0,05 pigg / s; Figur 2n). på dette stadiet av utvikling (dvs. 16 d etter starten av differensiering) ingen synkrone hendelser som involverer alle kanaler . av MEAs oppdages (figur 2o) nivået av nettverksaktivitet økte i utvikling: i løpet av fjerde uke etter t han induksjon av differensiering, de nevrale nettverk viste høy grad av spontan aktivitet (2,5 ± 0,1 pigg / s, figur 2N) i alle brønnene på enheten. Nettverkene også utstilt synkrone nett bursts (4,1 ± 0,1 burst / min, figur 2o) med lang varighet (2100 ± 500 ms).
Figur 1: hiPSC Differensiering i nerveceller. A. Tre tidspunkter av hiPSCs differensiering i neuroner på dekk. B. Plating av hiPSCs på MEAs. C. Astrocytter på 100% konfluens i T75 kolbe (merk at cellene danner en tessellated enkeltlag). Skala barer: 150 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. hiPSC-avledet Nerveceller Karakterisering. A. hiPSC-avledede neuroner ble farget for MAP2 (grønn) og synapsin-1/2 (rød) på forskjellige dager etter starten av differensieringen. Skala: 10 mikrometer. B. Kvantifisering av synapsin puncta i to uavhengige forsøk. I hvert forsøk på minst 10 celler ble analysert. C. Kvantifisering av synapsin puncta på DIV23 i nevroner avledet fra to uavhengige IPS linjer. D. hiPSC-avledede nevroner ble farget for PSD-95 (grønn) og synapsin-1/2 (rød) 23 dager etter starten av differensiering. Synapsin puncta er sidestilt til PSD-95 puncta. E. hiPSC-avledede neuroner ble farget for MAP2 (grønn) og BRN2 (rød) eller SATB2 (rød) 23 d etter starten av differensieringen. F. Andel MAP2 positive celler somvar positive for angitt markører. G. Representative strøm klem opptak viser at aksjonspotensialer kan genereres så tidlig som 7 dager etter starten av differensieringen. H. Andel av celler på ulike dager etter induksjon av differensiering som viser en eller flere aksjonspotensialer. I. Representative spor av eksitatoriske postsynaptiske strømmer (EPSCs) mottatt av hiPSC-avledet nevroner på forskjellige dager etter differensiering. J. Frekvens av eksitatoriske postsynaptiske strømninger under utvikling. K. Amplitude av eksitatoriske postsynaptiske strømninger under utvikling. L. Representant spor av EPSC innspillinger uten (kontroll) og med CNQX (CNQX). M. nevroner avledet fra en hiPSC linje, ble dyrket på en 6-brønners MEA og nettverk aktivitet er vist for hiPSC-avledede nevrale nettverk 16 og 23 d etter induksjonen av differensiering. Aktiviteten registreres frahver brønn (samplingsfrekvens på 10 kHz) er angitt med en annen farge (5 min av 20 min av opptaket blir vist). N. skuddtakt 16 og 23 d etter induksjonen av differensiering. O. Sprengning hastighet 16 og 23 d etter induksjon av differensiering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Gitt resultatene, kan kvaliteten av de resulterende hiPSC-avledede nevroner bedømmes ved å foreta en nevrofysiologisk profil av cellene. Det vil si, tre til fire uker etter starten av differensieringen, morfologi, synapsin-1/2 ekspresjon og elektro av neuroner kan bli vurdert. På dette tidspunktet blir de hiPSC-avledet nerveceller forventes å vise en neuronal-lignende morfologi, for å være MAP2, synapsin / PSD-95 positive ved utføring av immunocytokjemi, og til utstilt spontan elektrofysiologiske aktivitet (både ved enkeltcelle og nettverksnivå).
Discussion
Her har vi implementert en effektiv hiPSC-differensiering protokollen utgitt av Zhang et al. (2013) 12 for å måle nettverksaktivitet av hiPSC-avledet nevrale nettverk på MEAs. Vi tilpasset den opprinnelige protokollen ved å opprette en rtTA- / Ngn2 -positivt hiPSC linje før indusere neuronal differensiering. Denne ekstra trinn tillater oss å kontrollere nevronale celletetthet på MEA. Kontroll over den neuronale tettheten var en viktig forutsetning for å tilpasse protokollen i Meas og for å sikre konsistens. For å måle aktiviteten til nevrale nettverk ved hjelp MEAs, nervecellene trenger for å danne tette nettverk direkte på toppen av MEA elektroder 17,18. Dette krever nødvendigvis stram kontroll over plating tettheten av nerveceller. Den rtTA- / Ngn2 -positivt hiPSC serie muliggjør kontroll av nervecellen tetthet fordi denne taktikken ikke er avhengig av akutte lentiviral transductions av hiPSCs før differensiering;den rtTA / Ngn2 -positivt hiPSC linje derfor nesten eliminerer enhver variasjon i det endelige utbytte på grunn av, for eksempel, lentiviral toksisitet og variabel infeksjon effektivitet.
En annen kritisk trinn i den eksperimentelle prosedyren er antallet av rotter astrocytter som er cocultured med de unike hiPSCs. Astrocytter bidra aktivt til videreutvikling av utviklings nevrale kretser ved å kontrollere synapse formasjon, vedlikehold og eliminasjon, som alle er viktige prosesser for nevronal funksjon. Protokollen som presenteres i denne artikkelen er svært astrocyte avhengig: å fullt moden og danne funksjonelle synapser, nervecellene krever støtte fra astrocytter. Vi har opplevd at antall astrocytter bør være omtrent det samme som antallet av hiPSC-avledet nerveceller for å støtte modning av neuronene og dannelsen av nevrale nettverk som oppviser spontan aktivitet. Siden våre astrocyttkulturer protokollen gir primær celle Culstedene med en begrenset levetid, har isolering av rotte astrocytter som skal utføres regelmessig.
Vår tilpasning av protokollen publisert av Zhang et al. (2013) 12 for bruk med MEA teknologi vil trolig betydelig forbedre vår evne til å studere nettverk aktivitet av hiPSC-avledet nettverk. Tidligere protokollene som brukes for å studere hiPSC-avledet nevrale nettverk med MEAs avhengige av tidkrevende differensierings prosedyrer 13-16. Protokollen fra Zhang et al. (2013) gir en hurtig alternativ, og vår modifikasjon fjerner en kilde til variasjon, noe som gjør det nå mer mulig å bruke hiPSC-avledet nerveceller i kombinasjon med MEA teknologi, spesielt i high-throughput eller farmakologiske studier. I tillegg, fordi fremgangsmåten publisert av Zhang et al. (2013) 12 gir en homogen befolkning på øvre lag kortikale nevroner, våre tilpasset protokoll muliggjør fokuserte studier i nettverket enctivity av denne spesielle neuronal delsettet.
Likevel har denne tilnærmingen også flere begrensninger. For det første kan homogeniteten av kulturene også betraktes som en ulempe, fordi de kulturene er mindre sannsynlig å ligne in vivo-nettverk, hvor forskjellige klasser av nerveceller (dvs. hemmende og eksitatoriske neuroner) utgjør et heterogent nettverk. For ytterligere å øke bruken av hiPSC-avledede nevroner med MEA-teknologi, vil det være viktig å utvikle raske (transgene basert) differensiering protokoller for andre nervecellepopulasjoner. Hvis protokoller blir tilgjengelige, vil in vitro-nettverk etterligner in vivo-nettverk nærmere. For det andre, i det foreliggende rotte astrocytter må legges til de hiPSC-avledede neuroner for vekst støtte, og dermed den resulterende neuronal nettverket ikke er en human nevronal nettverk sensu stricto. Pålitelige protokoller for å differensiere hiPSCs inn kan astrocytter i fremtiden solhar dette problemet 26. For det tredje, to-dimensjonale nevrale nettverk, slik det er beskrevet her, er en begrenset modell for å studere komplekse tredimensjonale in vivo nevrale nettverk. Heldigvis protokoller som beskriver tredimensjonale kulturer av rotte primære nerveceller i kombinasjon med MEA-teknologi er allerede tilgjengelig 27,28. Prospektivt, bør kombinasjonen av raske differensiering protokoller for å få hiPSC-avledede nevroner og astrocytter med tredimensjonale kultur teknikker og MEA teknologi gir romanen innsikt i de biologiske mekanismene bak nevrologiske lidelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lebovitz's L-15 medium | Gibco | 11415-064 | |
| B-27 supplement | Gibco | 0080085SA | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Ca2+/Mg2+-free HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| High-glucose DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| psPAX2 lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G lentiviral packaging vector | Addgene | Plasmid #12259 | |
| Basement membrane matrix | Gibco | A1413201 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| E8 medium | Gibco | A1517001 | |
| ROCK inhibitor | Gibco | A2644501 | Alternatively, ROCK inhibitors like thiazovivin can be used. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-5G | |
| G418 | Sigma-Aldrich | G8168-10ML | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| Vitronectin | Gibco | A14700 | |
| 6-well MEAs | Multi Channel Systems | 60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr | |
| Glass coverslips | VWR | 631-0899 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655-10MG | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891-5G | |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| NT-3, human recombinant | Promokine | C66425 | |
| BDNF, human recombinant | Promokine | C66212 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| L-alanyl-L-glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768-100MG | |
| Straight fine-tipped forceps | Fine Science Tools | 11251 | |
| Fine-tipped spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. Studying human disease using human neurons. Brain Res. , (2016).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Wu, H., et al. Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture. J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).
- Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Sci Rep. 6, 26181 (2016).
- Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Front Neurosci. 10, (2016).
- Heikkila, T. J., et al. Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro. Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).
- Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays. Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).
- Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces. J Neural Eng. 9 (2), (2012).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079 (2013).
- Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J Vis Exp. (63), e3965 (2012).
- Ba, W., et al. ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function. Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).
- Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer. Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).
- Ba, W., et al. TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function. Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).
- Benevento, M., et al. Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling. Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci Rep. 4, 5489 (2014).
- Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model. J Vis Exp. (104), e53080 (2015).
