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Developmental Biology

में सक्रिय ERK के स्थानिक और लौकिक विश्लेषण doi: 10.3791/54901 Published: November 29, 2016

Summary

हम विच्छेदित सी में सक्रिय ERK के स्थानिक और लौकिक स्थानीयकरण के लिए एक immunofluorescence इमेजिंग आधारित पद्धति पेश एलिगेंस gonad। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सी में किसी भी सिगनल के दृश्य या संरचनात्मक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता एलिगेंस gonad, बशर्ते एक उपयुक्त एंटीबॉडी अभिकर्मक उपलब्ध है।

Abstract

Evolutionarily संरक्षित कोशिकी संकेत transducing RTK रास-ERK मार्ग एक महत्वपूर्ण काइनेज-संकेत झरना है कि मुख्य ERK, मार्ग के टर्मिनल काइनेज के सक्रियण के माध्यम से कई सेलुलर और विकास की प्रक्रिया को नियंत्रित करता है। ERK गतिविधि के तंग विनियमन सामान्य विकास और homeostasis के लिए आवश्यक है; अत्यधिक सेलुलर प्रसार में पीढ़ी सक्रिय ERK परिणाम है, जबकि underactive ERK कोशिका मृत्यु का कारण बनता है। सी एलिगेंस एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है कि मदद की है विकास के दौरान समारोह और RTK रास-ERK संकेतन मार्ग के नियमन के लिए चिह्नित है। विशेष रूप से, RTK रास-ERK मार्ग सी के लिए आवश्यक है germline विकास है, जो इस विधि का ध्यान केंद्रित है एलिगेंस। सक्रिय, ERK (dpERK) की diphosphorylated फार्म के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग, टकसाली स्थानीयकरण पैटर्न germline के भीतर देखे जा सकते हैं। क्योंकि इस पद्धति दोनों स्थानिक और अस्थायी नियंत्रण हैएड, reproducibly की परख के लिए dpERK क्षमता मार्ग है कि dpERK संकेत अवधि और आयाम है और इस तरह germline विकास को प्रभावित के नियामकों की पहचान के लिए उपयोगी है। यहाँ हम कैसे सफलतापूर्वक टुकड़े करना, दाग, और छवि dpERK सी के भीतर प्रदर्शित एलिगेंस gonad। इस विधि सी में किसी भी संकेत के स्थानिक स्थानीयकरण या संरचनात्मक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता एलिगेंस gonad, बशर्ते एक एंटीबॉडी immunofluorescence के साथ संगत उपलब्ध है।

Introduction

रिसेप्टर tyrosine kinase (RTK) -RAt सारकोमा (रास) -Extracellular संकेत विनियमित kinase (ERK) मार्ग एक संरक्षित काइनेज झरना है कि फोस्फोराइलेशन और ERK 1-3 के सक्रियण में परिणामों के माध्यम से बाह्य संकेत रिले। ERK प्रोटीन संरक्षित प्रोलाइन निर्देशित सेरीन / threonine एमएपी (माइटोजन सक्रिय प्रोटीन) काइनेज परिवार के सदस्य हैं, और सीधे संरक्षित Tey मूल भाव के threonine (टी) और tyrosine (वाई) पर दोहरे फोस्फोराइलेशन के माध्यम से खल्क द्वारा सक्रिय कर रहे हैं। सक्रिय ERK (diphosphorylated ERK, या dpERK के रूप में) फिर नीचे की ओर substrates 1-3 की एक बैटरी की अपनी फोस्फोराइलेशन के माध्यम से कई सेलुलर और विकास की प्रक्रिया को नियंत्रित करता है। इस प्रकार असामान्य गतिविधि ERK कई सेल और विकासात्मक दोष 4-7 की ओर जाता है।

ERK गतिविधि के कड़े नियमन के सामान्य विकास के लिए महत्वपूर्ण है: स्तनधारी प्रणालियों में बहुत ज्यादा ERK गतिविधि अत्यधिक सेलुलर प्रसार अग्रणी करने के लिए सुरागऑन्कोजेनिक विकास के लिए; बहुत कम गतिविधि कोशिका मृत्यु 4,6 की ओर जाता है। 30 मिनट या उससे कम लाती सेल प्रसार, लेकिन ERK सक्रियण 60 मिनट या अधिक लाती neuronal भेदभाव 8,9 के लिए के लिए PC12 कोशिकाओं में, ERK सक्रियण: इसके अतिरिक्त, ERK गतिविधि की अवधि में परिवर्तन भी अलग परिणामों को जन्म दे सकता है। ERK गतिविधि के तंग विनियमन इस प्रकार सामान्य विकास और homeostasis के लिए स्पष्ट रूप से आवश्यक है।

एलिगेंस समारोह और RTK रास-ERK संकेतन मार्ग 3,10-15 के नियमन के टुकड़े करना एक शक्तिशाली, और आनुवंशिक रूप से निंदनीय मॉडल प्रणाली है। स्तनधारी प्रणाली है, जो RAS और ERK, सी के लिए कई जीनों को नियंत्रित करने के सापेक्ष यह प्रतिपादन, जिसमें इस मार्ग 3,10-14 के समारोह टुकड़े करना एक आनुवंशिक रूप से और अधिक सुगम प्रणाली, - एलिगेंस एक आरएएस जीन (जाने-60) और एक ERK जीन (1 MPK) शामिल हैं। सी एलिगेंस germline अनिवार्य रूप से एक ट्यूब कि mitotic के होते हैऔर उसके समीपस्थ अंत (चित्रा 1) के 16 में अपने बाहर अंत में कोशिकाओं को परिपक्व oocytes स्टेम। जनन कोशिकाओं अर्धसूत्रीविभाजन एक विस्तारित meiotic प्रोफेज़ (pachytene), जिसके बाद वे पाश क्षेत्र में oocytes के लिए फार्म, अंत में समीपस्थ क्षेत्र में 16 oocyte परिपक्वता के दौर से गुजर शुरू के माध्यम से प्रगति बाहर का mitotic क्षेत्र के लिए सिर्फ समीपस्थ, और आरंभ करें।

हमारे अपने सहित कई प्रयोगशालाओं, आनुवंशिक अध्ययन से पता चला है कि RTK रास-ERK मार्ग सी में germline विकास के लिए आवश्यक है एलिगेंस 12,13,15,17-19। विशेष रूप से, हम उस ERK नियंत्रण पाया और germline विकास के दौरान कम से कम नौ अलग जैविक प्रक्रियाओं का समन्वय करता है, ऐसे में इस तरह oocyte विकास 11,18 के रूप में जैविक प्रक्रियाओं सेल रोगाणु सेल apoptosis के रूप में विकास स्विच से लेकर। ज्यादातर स्तनधारी सिस्टम, सी में बहुत ज्यादा ERK गतिविधि में की तरह कई छोटे oocytes के उत्पादन में germline परिणाम एलिगेंस, जबकि भी लीएक बड़े oocyte 11 में ttle गतिविधि का परिणाम है। इस प्रकार dpERK की तंग विनियमन सामान्य germline विकास के लिए आवश्यक है। DpERK मध्य pachytene दौरान अधिक है (जोन 1, चित्रा 1), पाश क्षेत्र में कम और उच्च फिर से परिपक्व में: ERK के सक्रिय रूप है, के रूप में विशिष्ट एक एंटीबॉडी dpERK करने द्वारा कल्पना, एक टकसाली, गतिशील, bimodal स्थानीयकरण पैटर्न को प्रदर्शित करता है oocytes (2 जोन, चित्रा 1)। हाल ही में, हमने पाया है कि पोषण जोन 1 12 में ERK सक्रिय करने के लिए इंसुलिन की तरह विकास फैक्टर रिसेप्टर 1 (DAF-2) के माध्यम से कार्य करता है; पहले काम से पता चला है कि शुक्राणु संकेत (Ephrin रिसेप्टर tyrosine काइनेज के माध्यम से) 2 जोन 13 में ERK को सक्रिय करता है।

कि germline में एक रिओस्तात के रूप में सक्रिय ERK कार्यों oocyte विकास, स्थानिक और लौकिक स्थानीयकरण, साथ ही dpERK के आयाम को विनियमित करने के लिए देखते हुए अपने सामान्य सिगनल परिणाम को समझने की कुंजी है। , विधि यहाँ वर्णित का उपयोग में परिवर्तनdpERK के टकसाली स्थानीयकरण आसानी से नजर रखी जा सकती है और भविष्यवाणियों ERK गतिविधि है और इस तरह के समारोह पर पर्यावरण या आनुवंशिक perturbations के प्रभाव पर निकाली गई। इस प्रकार, dpERK के लिए परख करने की क्रिया germline विकास के दौरान अपनी भूमिका के लिए एक व्यापक समझ में सक्षम बनाता है।

Protocol

यहां वर्णित प्रोटोकॉल अकशेरुकी मॉडल प्रणाली सी के लिए मुख्य रूप से है एलिगेंस, और सभी नैतिक दिशा निर्देशों संस्था द्वारा निर्धारित इस प्रकार है।

1. पशु रखरखाव

  1. सी बनाए रखें एलिगेंस निमेटोड विकास मध्यम 20,21 (एन जी एम, वहाँ सामग्री तालिका) पर शेयर संस्कृतियों काम कर अगर के साथ वरीयता प्राप्त कोलाई OP50।
  2. 16 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान में कीड़ा शेयरों को बनाए रखने।
    नोट: तेजी से विकास दर, अक्सर, न्यायपालिका germline विकास और निचले चिंता आकारों में उच्च तापमान के परिणाम पर कीड़े संवर्धन। इसके अतिरिक्त, तापमान संवेदनशील जीनोटाइप अलग तापमान पर अलग phenotypes प्रदर्शित करेगा।
  3. उनकी विकास दर के आधार पर 3 दिन के रूप में इतनी अच्छी तरह से खिलाया कीड़े की निरंतर आपूर्ति बनाए रखने के लिए - हर 2 नए एन जी एम प्लेटों के लिए कीड़े हस्तांतरण।
    नोट: dpERK स्तरों से जुड़े किसी भी प्रयोग के लिए, कीड़े नहीं एक भूखे या भीड़ से प्राप्त किया जाना चाहिएएड थाली। भीड़ या भुखमरी प्रभावों इंसुलिन कीड़े 22 में संकेत, और इंसुलिन को नियंत्रित सिगनल ERK 12 गतिविधि। इस प्रकार भूखे या भीड़ प्लेटों से कीड़े चर और मुश्किल-पुन: पेश धुंधला पैटर्न में परिणाम होगा।

Gonads प्राप्त करने के लिए वयस्क कीड़े की 2. विच्छेदन

  1. 150 डब्ल्यूटी (एन 2) या एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में वांछित और विशिष्ट विकास मंच (एल 1, एल 2, L3, L4, वयस्क, आदि।) M9 बफर के 100 μL में कम से कीड़े के वांछित जीनोटाइप - 100 उठाओ।
  2. M9 बफर के 900 μL के साथ microcentrifuge ट्यूब भरें (देखें सामग्री तालिका)। परिवेश के तापमान पर 1 मिनट के लिए एक microcentrifuge में 1,000 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
  3. धीरे M9 बफर के 900 μL हटाने और त्यागें। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत बफर निकालें सुनिश्चित करने के लिए कि कीड़े गलती से नहीं हटा रहे हैं।
  4. दोहराएँ कदम 2.2 - 2.3 दो और ताजा M9 के साथ समय हर बार बफर।यह सुनिश्चित करता है कि किसी भी बैक्टीरिया है कि कीड़े के साथ खत्म किया गया था प्रभावी ढंग से धुल जाते हैं।
  5. अंतिम धोने के बाद ट्यूब और त्यागने से M9 बफर के 900 μL हटा दें।
  6. एक फ्लैट नीचे कांच घड़ी डिश के लिए एक 200 μL-micropipette टिप के साथ 150 कीड़े - 100 युक्त शेष 100 M9 के μL बफर स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि micropipette टिप उपयोग करने से पहले 10 μL निशान पर काट रहा है। नहीं काटने टिप कीड़े के बाल काटना में परिणाम होगा।
  7. 0.1 एम levamisole के 3 μL कांच घड़ी M9 बफर में कीड़े युक्त डिश के लिए - 1 जोड़ें। धीरे यहां तक ​​कि मिश्रण सक्षम करने के लिए जब तक कीड़े बढ़ रोकने levamisole और M9 ज़ुल्फ़।
    नोट: Levamisole शेयरों ° लंबी अवधि के भंडारण के लिए सी -20 पर संग्रहित किया जा सकता है। आदेश में पशुओं में गतिशीलता की तेजी से नुकसान प्राप्त करने में levamisole के 0.25 मिमी - क्या 0.2 के साहित्य 23 में वर्णित किया गया है की तुलना में 3 मिमी - यहाँ, 1 की उच्च एकाग्रता का उपयोग करें। जानवरों को भी एल के लिए चारों ओर लूटना हैंओंग तरल निलंबन में, gonads में dpERK के परिणामस्वरूप पैटर्न (तनाव या पोषण या दोनों की कमी के कारण) चर हो सकता है। विच्छेदन के लिए 3 मिमी levamisole - अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य धुंधला पैटर्न 1 के साथ हासिल की है।
  8. दो 1 एमएल सीरिंज (सिरिंज का आकार कोई फर्क नहीं पड़ता, सुई का गेज महत्वपूर्ण है) के लिए दो 25 जी सुइयों संलग्न। स्थिति एक हाथ में एक सिरिंज (चित्रा 2)।
  9. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, के तहत और प्रत्येक कीड़ा पर एक सुई की स्थिति के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है और एक कैंची की तरह गति में दूसरा ग्रसनी बल्ब के पास कीड़ा पर एक ठीक कटौती जगह है। कीड़ा में एक कटौती के बाद अगले पशु के लिए आगे बढ़ना जब तक डिश में सभी जानवरों को कम से कम एक बार कटौती की गई है।
    नोट: - 2.9 समय के प्रति संवेदनशील हैं ध्यान में रखना कदम है कि 2.8 रहें। एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य dpERK पैटर्न के लिए पाँच मिनट के अंतर्गत में डिश में सभी कीड़े काटना। लंबे समय तक विच्छेदन बार dpERK संकेत से दूर एक मोड़ में परिणाम होगा, विशेष रूप से Z मेंएक 1. आवंटित समय सीमा में रहने के लिए विच्छेदन (यानी, 50 कीड़े बनाम 150) यदि आवश्यक का दौर प्रति कीड़े की संख्या को समायोजित करें।
    1. मामले में एक extruded gonad विच्छेदन के दौरान, एक ही जानवर में एक और कटौती का प्रयास नहीं करते दिखाई नहीं है। आमतौर पर है कि केवल जानवर कतरनी जाएगा और gonad के बाहर निकालना में परिणाम नहीं। इसके बजाय, अगले पशु पर चलते हैं। कीड़े जहां gonads बाहर निकालना नहीं है कि स्लाइड धारा 6 में बनाया जाएगा और इमेजिंग के दौरान नजरअंदाज किया जा सकता है पर इस तरह के रूप में दिखाई देगा
      नोट: विच्छेदन और प्रसंस्करण के सभी चरणों के माध्यम से, यह ध्यान रखें कि gonad शरीर / शव से जुड़ी रहेगी में सहन करने के लिए महत्वपूर्ण है। gonad और अलग सुई के साथ शरीर मजबूर मत करो। अक्सर बार जननांगों के ऊतकों में एक न्यायपालिका आंसू शरीर से gonad तोड़ करने की कोशिश में नकली एंटीबॉडी संकेत हो सकती है। शरीर / शव इमेजिंग कदम (धारा 6) के दौरान नजरअंदाज किया जा सकता है, और केवल gonad imaged। इसके अतिरिक्त, सोमetimes आंतों की कोशिकाओं को भी एंटीबॉडी यत्न किया जा रहा है के रूप में आंतरिक नियंत्रण / दैहिक नियंत्रण सेवा कर सकते हैं।

3. gonad फिक्सेशन

  1. विच्छेदन के बाद पूरा हो, कांच घड़ी और विच्छेदित जानवरों M9 के 100 μL युक्त डिश के लिए 3% paraformaldehyde (पीएफए) सीधे के 2 एमएल जोड़ने और parafilm के साथ कवर किया। एक रासायनिक धूआं हुड में शामिल किया घड़ी का शीशा पकवान रखें।
    सावधानी: पीएफए एक खतरनाक रासायनिक है। इस प्रकार, निर्धारण रासायनिक धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
  2. 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  3. एक डिस्पोजेबल 9 "कांच पाश्चर विंदुक का प्रयोग पाश्चर में पीएफए समाधान और विच्छेदित जानवरों के साथ 1x पीबीएस टी ड्राइंग द्वारा घड़ी का शीशा विच्छेदित जानवरों युक्त पकवान में जोड़ने के लिए 3 1x पीबीएस-टी (देखें सामग्री तालिका) एमएल। मिक्स पिपेट और धीरे घड़ी का शीशा डिश में वापस रिहा। washes के दौरान ट्यूबों के भंवर मत करो।
  4. एक fre का प्रयोगश गिलास पाश्चर विंदुक पाश्चर विंदुक में घड़ी का शीशा पकवान से तरल के 5 एमएल (विच्छेदित कीड़े युक्त, पीएफए ​​और 1x पीबीएस-टी) आकर्षित करने और नए सिरे से 5 एमएल कांच शंक्वाकार ट्यूब में सामग्री हस्तांतरण।
  5. अपकेंद्रित्र में 1,000 x जी एक नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में 30 सेकंड के लिए शंक्वाकार ट्यूब। कांच पाश्चर pipettes और शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग के रूप में विच्छेदित gonads प्लास्टिक से चिपके रहते हैं।
  6. निकालें और सतह पर तैरनेवाला ख्याल रखने के लिए इतनी के रूप विच्छेदित जानवरों को परेशान करने के लिए नहीं त्यागें। इतनी के रूप में विच्छेदित gonads को प्रभावित करने के लिए नहीं एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत शंक्वाकार ट्यूब से प्रत्येक धोने के बाद तरल निकालें, और उनके नुकसान को कम।
  7. एक ताजा पाश्चर विंदुक का प्रयोग, शंक्वाकार ट्यूबों के लिए 5 1x एमएल पीबीएस टी जोड़ें। अपकेंद्रित्र में 1,000 x जी 30 एस के लिए एक नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में शंक्वाकार ट्यूब। निकालें और सतह पर तैरनेवाला ख्याल रखने के लिए इतनी के रूप विच्छेदित जानवरों को परेशान करने के लिए नहीं त्यागें।
  8. तीन बार की कुल के लिए दोहराएँ कदम 3.7।
  9. एक ताजा पाश्चर विंदुक का प्रयोग, 100% के 2 एमएल जोड़नेट्यूबों के लिए मेथनॉल, और धीरे पाश्चर विंदुक में ड्राइंग द्वारा मेथनॉल के साथ gonads मिश्रण। 1 घंटे की एक न्यूनतम के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं।
    नोट: विच्छेदित gonads dpERK धुंधला के लिए अप करने के लिए 2 दिनों के लिए मेथनॉल में संग्रहित किया जा सकता है। अधिक से अधिक 2 दिनों के लिए और 2 सप्ताह के भंडारण विरोधी Lamin एंटीबॉडी के रूप में अन्य एंटीबॉडी धुंधला अनुप्रयोगों के साथ संगत है, लेकिन dpERK एंटीबॉडी के साथ नहीं।
  10. वांछित ऊष्मायन समय के बाद, क्रम gonads धोने के लिए तीन बार की कुल के लिए 3.7 चरण दोहराएँ। washes के दौरान ट्यूबों के भंवर मत करो। अंतिम धोने के बाद 5 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 1x पीबीएस-टी के 500 μL छोड़ दें।
  11. एक ताजा पाश्चर विंदुक एक ताजा 1 एमएल ग्लास ट्यूब (6 मिमी x 50 मिमी) में शंक्वाकार ग्लास ट्यूब की सामग्री हस्तांतरण का उपयोग करना। 10 मिनट - विच्छेदित जानवरों 5 के लिए गंभीरता से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें।
  12. एक ताजा पाश्चर विंदुक का प्रयोग और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, 1 एमएल ग्लास ट्यूब बुद्धि से संभव के रूप में धोने की बहुत दूरHout विच्छेदित gonads परेशान।

4. अवरूध्द और प्राथमिक एंटीबॉडी उपचार

  1. जोड़े में 30% की 100 μL सामान्य बकरी सीरम (NGS) 1x पीबीएस-टी में पतला 1 एमएल ग्लास ट्यूब में विच्छेदित जानवरों के लिए (देखें सामग्री तालिका)। 30% NGS अवरुद्ध बफर के रूप में कार्य करता है। Parafilm के साथ ट्यूब कवर तरल के वाष्पीकरण से बचने के लिए। 1 घंटे के लिए या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी पर सेते हैं।
  2. ऊष्मायन के वांछित समय के बाद, एक ताजा पाश्चर विंदुक का उपयोग अवरुद्ध बफर हटाने के लिए जितना संभव तरल हटाने। एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए कि gonads पाश्चर विंदुक में तैयार नहीं कर रहे हैं।
  3. MAPKYT एंटीबॉडी पतला है (देखें सामग्री तालिका, dpERK रूप में इस विधि में कहा गया है) 1: 400 में 30% NGS में। ट्यूब प्रति 100 μL का उपयोग करने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को तैयार है। अप्रयुक्त, पतला एंटीबॉडी एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  4. पतला विरोधी dpERK एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें ताकि1 एमएल कांच विच्छेदित जानवरों युक्त ट्यूबों के लिए lution। Parafilm साथ ट्यूब सील। 4 डिग्री सेल्सियस रात भर ट्यूबों सेते हैं।
  5. रात ऊष्मायन के बाद, आरटी पर ट्यूबों के लिए 1x PBST के 800 μL जोड़ें।
  6. एक ताजा कांच पाश्चर विंदुक में नमूना ड्रा और धीरे रिहाई सुनिश्चित करने के लिए कि gonads समान रूप से 1x पीबीएस-टी में निलंबित कर दिया है। gonads गंभीरता के साथ नीचे करने के लिए तय है। सतह पर तैरनेवाला निकालें। यह सुनिश्चित करता है कि विच्छेदित gonads धो रहे हैं लेकिन इस प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं।
  7. दोहराएँ कदम 4.5 - 4.6 तीन washes के एक कुल के लिए। washes के दौरान ट्यूबों के भंवर मत करो। तीसरे धोने के बाद हटा दें और विच्छेदित जानवरों को परेशान करने के बिना संभव के रूप में के रूप में ज्यादा सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए सुनिश्चित हो। सुनिश्चित करें कि एक ताजा पाश्चर विंदुक हर बार प्रयोग किया जाता है।

5. माध्यमिक एंटीबॉडी उपचार

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी के दौरान washes माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने तैयार करते हैं। पतला विरोधी माउस se1 पर condary एंटीबॉडी: 500 में 30% NGS। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ के रूप में, ट्यूब प्रति 100 μL का उपयोग करें। अप्रयुक्त एंटीबॉडी एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. 100 μL माध्यमिक एंटीबॉडी 1 एमएल कांच विच्छेदित जानवरों युक्त ट्यूबों का हल जोड़ें। Parafilm के साथ प्रत्येक ट्यूब कवर, और तब एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट कर ट्यूबों के अंधेरे में ट्यूब की सामग्री रखने के लिए। 2 घंटे के लिए आरटी पर नलियों सेते हैं, या वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस रात भर।
  3. ऊष्मायन के वांछित समय के बाद, ट्यूबों के लिए 1x पीबीएस-टी के 800 μL जोड़ें और दोहराने कदम 4.5 - 4.6 तीन बार की कुल के लिए। अंतिम धोने के बाद, हटाने और एक ताजा पाश्चर विंदुक का उपयोग कर एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के रूप में ज्यादा त्यागें।
  4. माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए washes के दौरान DAPI समाधान तैयार है। 1x PBST के 1 एमएल आय (1 मिलीग्राम / एमएल के एक 1,000x शेयर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत से) DAPI की 1 μL पतला।
  5. पतला DAPI समाधान के 800 μL युक्त ट्यूबों में जोड़ेविच्छेदित जानवरों। Parafilm के साथ ट्यूब के मुंह को कवर, और एल्यूमीनियम पन्नी में प्रत्येक ट्यूब लपेटो। 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  6. DAPI के साथ ऊष्मायन के बाद, एक ताजा पाश्चर विंदुक के साथ संभव के रूप में DAPI समाधान की बहुत दूर, एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे इतनी के रूप में विच्छेदित जानवरों को परेशान करने के लिए नहीं।
  7. ट्यूबों के लिए समाधान बढ़ते की 1 बूंद जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी में प्रत्येक ट्यूब लपेटें।
    नोट: dpERK धुंधला visualizing के लिए, दाग gonads तुरंत माइक्रोस्कोपी के लिए मुहिम शुरू की जानी चाहिए। ऐसे फॉस्फोरिलेटेड सेरीन 10 histone H3 के रूप में अन्य एंटीबॉडी अनुप्रयोगों के लिए, gonads अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए बढ़ते मीडिया में रखा जा सकता है।

6. कोडांतरण स्लाइड और इमेजिंग

  1. प्रयोगशाला टेप की एक परत लंबाई प्लेस, शीर्ष पर, दो गिलास खुर्दबीन स्लाइड (25 मिमी x 75 मिमी x 1 मिमी) चित्रा 3 के रूप में देखा की। दो टेप स्लाइड्स के बीच में एक नए सिरे से साफ गिलास खुर्दबीन स्लाइड रखें।
    नोट: मोटाईटेप की मदद करता है बीच स्लाइड पर एक agarose पैड उत्पन्न करते हैं। के रूप में टेप agarose पैड बनाने के लिए एक स्पेसर के रूप में कार्य करता है agarose पैड की मोटाई, टेप के लगभग बराबर है।
  2. बीच में खुर्दबीन स्लाइड पर ड्रॉप पिघल 2% agarose की ~ 200 μL (आसुत जल में किए गए)। जल्दी से एक नए सिरे से साफ स्लाइड जगह, सीधा करने के लिए और शीर्ष पर, agarose की।
  3. (- 2 मिनट 1) agarose जमना।
  4. शीर्ष माइक्रोस्कोप स्लाइड निकालें बहुत धीरे से, ऐसा है कि agarose पैड नष्ट नहीं है। agarose पैड या तो ऊपर या नीचे स्लाइड से जुड़ी रह सकते हैं। इससे कोई फर्क नहीं पड़ता है जो स्लाइड agarose पैड से जुड़ी है, जब तक यह agarose की एक चिकनी सतह है बनी हुई है।
  5. एक पाश्चर विंदुक agarose पैड पर विच्छेदित जानवरों हस्तांतरण का उपयोग करना। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक पाश्चर विंदुक का उपयोग स्लाइड से किसी भी अतिरिक्त तरल निकालें।
  6. एक बरौनी बाल या पतले तैयार केशिका का उपयोग करना, धक्का gonads और आंतों एकआदेश स्लाइड पर gonads बाहर का प्रसार करने में एक दूसरे से रास्ता।
  7. एक 24 मिमी x 50 मिमी आकार coverslip साथ खुर्दबीन स्लाइड कवर। यह सुनिश्चित करने के लिए कि coverslip कम से कम हवा के बुलबुले coverslip और स्लाइड के बीच का गठन किया जा रहा है स्लाइड पर धीरे उतारा है ख्याल रखना।
  8. एक स्लाइड बॉक्स में 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (स्लाइड फ्लैट झूठ बोल रही है, ऊपर coverslip साथ एक अपारदर्शी स्लाइड बॉक्स) पर स्टोर अतिरिक्त तरल लुप्त हो जाना और gonads (gonads पर coverslip के वजन की वजह से) कुछ हद तक चपटा बनने के लिए अनुमति देते हैं। gonads की मामूली सपाट एक अन्यथा दौर जननांगों ट्यूब के बेहतर इमेजिंग के लिए अनुमति देता है।
    1. एक बार जब coverslip मुहिम शुरू की है, उंगलियों के साथ coverslip के शीर्ष करने के लिए दबाव लागू करने के लिए नहीं है। अक्सर यह gonads और dpERK संकेत के नुकसान की विकृति का परिणाम है।
    2. केवल और अधिक प्रभावी इमेजिंग के लिए रात भर gonads समतल। स्लाइड के रूप में जल्द ही के रूप में वे इकट्ठा कर रहे देखी जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं। छवियों तुरंत लेने के लिए, धीरे अवशोषितcoverslip और एक साफ प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग कोनों से स्लाइड के बीच अतिरिक्त तरल।
  9. रात भर अवधि के बाद, स्लाइड सील और coverslip और स्लाइड सीमा के चारों कोनों पर पारदर्शी नेल पॉलिश topcoat के साथ coverslip। नेल पॉलिश / coverslip मुहर सुनिश्चित करता है कि coverslip जबकि इमेजिंग कदम नहीं करता है और नमूने के विनाश के खिलाफ सुरक्षा करता है।
  10. छवि 63X पर एक यौगिक माइक्रोस्कोप के साथ gonads। हालांकि उद्देश्य लेंस और माइक्रोस्कोप माइक्रोस्कोप और उपयोगकर्ता के आवेदन की उपलब्धता के आधार पर अलग किया जा सकता है। क्योंकि oocytes को proliferative क्षेत्र से पूरे gonad के आकार की तुलना में एक छवि में लिया जा सकता है बड़ा है, छवियों के रूप में 4। चित्रा 11-14, 18 में दिखाया गया ओवरलैपिंग सीमाओं के साथ एक असेंबल के रूप में लिया जाता है।
    1. कई मामलों में, जब तक कोई बड़ा परिवर्तन germline छवि के लिए बना रहे हैं, अंतिम इमेजिंग और विधानसभा के बाद शव को संपादित करें। स्टोर टीवह इकट्ठे छवि के साथ कच्चे छवियों 'से पहले' विधानसभा / संपादन की तुलना और 'के बाद' विधानसभा / छवियों का संपादन सक्षम करने के लिए।
      ध्यान दें: माइक्रोस्कोपी छवियों असेंबल की विधानसभा के दौरान सिग्नल की शक्ति या संतृप्ति के लिए बदल नहीं किया जाना चाहिए।

Representative Results

गुम्मट वयस्क उभयलिंगी पशुओं में, आम तौर पर dpERK -4 या -5 (जोन 2) के माध्यम से मध्य pachytene क्षेत्र, जोन 1 में और -1 से सबसे परिपक्व oocytes में कल्पना की है। इस सक्रियण पैटर्न में अव्यवस्थाएं संकेतन मार्ग में परिवर्तन को प्रतिबिंबित। महिला germlines 2 जोन में ERK की सक्रियता को प्रदर्शित नहीं करते जोन 1 में केवल कमजोर सक्रियण ये चित्रा 5 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं के साथ, शुक्राणु निर्दिष्ट नहीं करते हैं, और इस तरह।

आकृति 1
चित्रा 1: सी एलिगेंस germline आकृति विज्ञान। एक यू के आकार का gonad हाथ सफेद लाइन के साथ रेखांकित के साथ एक वयस्क उभयलिंगी का अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवि। वयस्क उभयलिंगी gonad बाहर का नोक पर mitotic सेल शामिल हैं। mitotic कोशिकाओं meiotic प्रोफेज़ (pachytene) matur में विकास के माध्यम से अर्धसूत्रीविभाजन और प्रगति दर्जसमीपस्थ gonad में ई oocytes। एक वयस्क उभयलिंगी gonad में dpERK के जोन 1 और 2 जोन मार्क टकसाली स्थानीयकरण। स्केल:। 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: विच्छेदन के दौरान सुई पदों का प्रदर्शन वाम:। इस प्रक्रिया में एक विच्छेदन की तस्वीर। अधिकार:। कृमि के संदर्भ में सुई पदों पर यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: agarose स्लाइड तैयार का प्रदर्शन। (ए) एक टेप lengthwis रखें2 स्वच्छ खुर्दबीन स्लाइड में ई। टेप के साथ दो स्लाइड्स के बीच एक नए सिरे से साफ खुर्दबीन स्लाइड के रूप में दिखाया रखें। तीन स्लाइड एक दूसरे की लंबाई। (बी) के बगल में केंद्र में स्लाइड के लिए agarose पिघल जोड़ रहे हैं। (सी) के लिए सीधा एक ताजा खुर्दबीन स्लाइड प्लेस, और की, मध्य स्लाइड शीर्ष पर, agarose की बूंद ले। ( डी) agarose जमना करने की अनुमति दें। (ई) शीर्ष स्लाइड जम agarose पैड के पीछे छोड़ने के लिए निकालें। विच्छेदित और दाग बढ़ते germlines के लिए agarose पैड के साथ नीचे स्लाइड का प्रयोग करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। के रूप में एक असेंबल DAPI के साथ एक जंगली प्रकार germline के असेंबल स्लाइड्स (टी इमेजिंगसेशन) और dpERK (नीचे) चैनल। छवियाँ सीमाओं ओवरलैपिंग के साथ 63X में ले लिया, पैनल ए और बी और प्रत्येक पैनल के लिए पैनल बी और सी DAPI और dpERK छवियों के लिए हरे बक्से के लिए सफेद बक्से दो अलग अलग चैनलों में एक साथ ले जाया गया। इकट्ठे की छवि चित्रा 5 ए में दिखाया गया है। स्केल पट्टी:। 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: गतिशील टेम्पोरल ERK की / स्थानिक एक्टिवेशन। (एसी) डब्ल्यूटी (एन 2) वयस्क (विकास के 24 घंटे के अतीत के मध्य L4 मंच) उभयलिंगी germlines डीएनए (बी, DAPI, सफेद) और dpERK के लिए दाग (सी, लाल)। जोन 1, pachytene क्षेत्र, और जोन 2, परिपक्व oocytes में dpERK संकेत प्रकाश डाला है। (डीएफ)कोहरे -2 (oz40) महिला germlines डीएनए (ई, DAPI) और dpERK (एफ) के लिए दाग (8 h विकास के अतीत के मध्य L4 मंच पर)। युवा महिला germlines जोन 1 में कमजोर dpERK प्रदर्शन, और एक शुक्राणु स्वतंत्र ढंग से एक भी oocyte में। जोन 2 शुक्राणु निर्भर करता है, और इस तरह महिला germline में अनुपस्थित है। स्केल पट्टी:। 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

सक्रिय ERK (dpERK) सी में एक टकसाली स्थानिक और गतिशील स्थानीयकरण पैटर्न प्रकार एलिगेंस germline। यह टकसाली dpERK स्थानिक पैटर्न (चित्रा 5), और आयाम एक वयस्क सी में एलिगेंस gonad, प्रभावी ढंग से कई जैविक प्रक्रियाओं है कि ERK को नियंत्रित करता है के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक असमर्थता अर्धसूत्रीविभाजन, एक phenotype महिला germlines कि शुक्राणु (चित्रा 5) निर्दिष्ट नहीं करते हैं, और इस तरह परिपक्व oocytes में ERK सक्रिय नहीं करते में मनाया के prophase में जोन में ERK सक्रिय करने के लिए oocytes 2 में परिणाम एक गिरफ्तारी में। महिला germlines 11,13 में 2 जोन में dpERK के प्रभावी संचय, oocyte परिपक्वता और ovulation की शुरुआत के साथ मिलकर में पुरुषों 'परिणामों के साथ संभोग। इस प्रकार स्थानिक पैटर्न और (जैसे कि शाही सेना के हस्तक्षेप मध्यस्थता जीन निष्क्रियता के रूप में) कुछ आनुवंशिक perturbations या रासायनिक उपचार पर dpERK के अस्थायी सक्रियण के विश्लेषण कारक है कि नियमित की पहचान के लिए अनुमति देता हैदेर ERK संकेतन और इस तरह ERK निर्भर जैविक प्रक्रियाओं। इस तरह के विश्लेषण भी संकेत दे रास्ते के बीच उपन्यास आनुवंशिक बातचीत की खोज के लिए सक्षम है।

किसी भी इमेजिंग आधारित विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण टोंटी ऐसे एंटीबॉडी कि आवेदन के लिए विशिष्ट हैं के रूप में कार्य अभिकर्मकों की उपलब्धता है। इस तरह के एक अभिकर्मक तो मौजूद है, तो इस तरह के एक के ऊपर वर्णित के रूप में तरीकों आसानी हित के किसी भी प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण पैटर्न के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। आवेदन इस प्रकार एक कार्य एंटीबॉडी की उपलब्धता द्वारा सीमित है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि विधि एक दिया विकास समय पर विच्छेदन और धुंधला का वर्णन है, यह केवल एक ही समय सीमा में जानकारी का कब्जा सक्षम बनाता है, और गतिशीलता या वास्तविक समय या प्रोटीन कारोबार की दर में प्रोटीन नियमन पर प्रकाश डाला नहीं है।

ऊपर वर्णित विधि फ्रांसिस एट अल से अनुकूलित है। 23 है, जो Seydoux और डन मीटर से अलग हैgonad बाहर निकालना और एंटीबॉडी धुंधला के लिए 24 ethod। विधि फ्रांसिस एट अल पर आधारित है। "निलंबन विधि" और Seydoux और डन विधि की तुलना के लिए "खुर फ्रीज विधि" कहा जाता है बुलाया जाएगा। निलंबन विधि ऐसे dpERK के रूप में संकेतन अणुओं, स्वाभाविक है कि कठोर से निपटने की स्थिति के प्रति संवेदनशील हैं की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थानीयकरण पैटर्न प्राप्त करने के लिए हमारे हाथ में बहुत प्रभावी किया गया है। dpERK स्थानीयकरण के मामले में, हमारे अनुभव में, जोन 1 में संकेत फ्रीज खुर विधि के साथ लगभग undetectable है। इसके अतिरिक्त, नमूना सुखाने, जो अक्सर फ्रीज खुर विधि के साथ हो सकता है, नकली एंटीबॉडी संकेतों में परिणाम है। निलंबन विधि, नमूना सुखाने के बाद से कम से कम gonads प्रक्रिया के दौरान तरल में निलंबित कर दिया है। हम यह भी पाते हैं कि निलंबन विधि एक एकल स्लाइड पर कई अलग जीनोटाइप इमेजिंग के लिए उपयोगी है। उदाहरण के लिए, इस तरह के रूप में दो hermaphrodites जीनोटाइप, तो बनाममहिलाओं सीधे dpERK स्थानीयकरण के लिए की तुलना में, दो जीनोटाइप एक साथ मिलाया जा सकता है करने के लिए जा रहे हैं और संसाधित। यह संभव है क्योंकि phenotypes अलग कर रहे हैं और DAPI morphologies के माध्यम से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। एक ही ट्यूब एक ही स्लाइड पर इमेजिंग द्वारा पीछा में धुंधला अलग जीनोटाइप से gonads के बीच प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, अगर DAPI morphologies अलग पहचाना नहीं कर रहे हैं, तो एक दो कदम एंटीबॉडी धुंधला अपनाया जा सकता है। सबसे पहले प्रत्येक व्यक्ति के जीनोटाइप दो अलग एंटीबॉडी के साथ व्यवहार किया जाता है, उत्परिवर्ती लिए WT और एंटीबॉडी बी के लिए एंटीबॉडी ए (दोनों एंटीबॉडी एक मेजबान dpERK एंटीबॉडी से अलग में उठाए जाने की जरूरत है)। एक बार दो जीनोटाइप प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया है, और धोया, वे एक ट्यूब में एक साथ मिलाया जा सकता है और अब, dpERK एंटीबॉडी के साथ दाग एक माध्यमिक एंटीबॉडी उपचार के बाद ट्यूब में सभी एंटीबॉडी कल्पना करने के लिए। एक क्षमता के लिए एक एकल स्लाइड पर अलग जीनोटाइप तुलना करने के लिए, विशेष रूप से जब डीसक्रियण पैटर्न के eductions किए जा रहे हैं अलग धुंधला की स्थिति से प्रभावित नहीं सटीक व्याख्याओं सुनिश्चित करता है।

जबकि लाभप्रद है, वहाँ निलंबन विधि भर में कई कदम है कि सावधान हेरफेर की आवश्यकता है। यह महत्वपूर्ण है कि विच्छेदन एक समय कुशल तरीके से होते हैं, महत्वपूर्ण बात, विच्छेदन पर 5 मिनट नहीं लेना चाहिए। लंबे समय तक विच्छेदन बार चर dpERK संकेत है, जो अक्सर ERK सक्रियण में विनियमित परिवर्तन, बजाय के रूप में तकनीकी विफलताओं के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती है, में परिणाम। क्योंकि विभिन्न धोने कदम gonads आसानी से pipetting त्रुटियों के कारण ट्यूब से खो दिया जा सकता भर में प्रत्येक विच्छेदन के लिए 150 पशु - यह 100 से अधिक के साथ शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है। कि जोड़ा जा सकता है (जैसे 50 जानवरों प्रत्येक के तीन बैचों के रूप में), या 150 का एक बड़ा बैच विदारक द्वारा gonads की हानि या तो कई छोटे समूहों में विदारक से कम किया जा सकता है एक और चुनौती एक अच्छी तरह से स्थान में झूठ बोलने के लिए gonads हो रही है गठनस्लाइड पर इतना है कि पूरे बाहर का gonad imaged किया जा सकता है। इसे सक्षम करने के लिए, एक माचिस या बाहर gonads अंतरिक्ष के लिए एक खींच लिया पिपेट पर एक बरौनी का उपयोग करें। हालाँकि, ध्यान के रूप में तो इस प्रक्रिया के दौरान gonads को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए। अक्सर इन तकनीकों के साथ यह स्लाइड पर विच्छेदन में महारत हासिल करने के कई प्रयास करने के साथ ही gonads की व्यवस्था लेता है।

एक बार इस तकनीक में महारत हासिल किया गया है, यह विभिन्न जैविक विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली विधि के रूप में कार्य करता है, और सिर्फ dpERK स्तरों की तुलना में अधिक अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए इस विधि सक्रिय p38 स्तर, या सक्रिय CDK स्तर, या किसी भी प्रोटीन जिसके लिए एक एंटीबॉडी अभिकर्मक मौजूद कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, विधि, उपन्यास अवरोधकों या मार्ग के activators के लिए परख करने के लिए पूरे जानवरों में एक रासायनिक निषेध स्क्रीन के साथ मिलकर किया जा सकता dpERK स्तरों के लिए परख करने की क्रिया के माध्यम से। यह दोनों प्रतिक्रिया और किसी भी अवरोधकों कि int सकता है के प्रति संवेदनशीलता का इन विवो readout के लिए अनुमति देगाRTK रास-ERK संकेतन मार्ग के साथ eract। इसके अलावा, इस पद्धति है कि सभी का इस्तेमाल किया जा सकता है और एक ही समय में कल्पना की कई संकेत दे outputs के साथ एंटीबॉडी संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है। कई एंटीबॉडी का उपयोग कई रास्ते हैं, उनके सक्रियण स्थिति के बीच संबंध की अनुमति देता है, और सभी एक ही ऊतक के भीतर परिणाम, इन मुलाकातों की बेहतर समझ के लिए सक्षम करने से। ये सिर्फ इस विधि के आगे अनुप्रयोगों के कुछ ही उदाहरण हैं, लेकिन इस प्रणाली के कई अनुसंधान के हितों का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Inc. A9539 Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution
Flat bottom glass watch dish Agar Scientific AGL4161 We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles BD PrecisionGlide 305122
Syringes (could be 1 or 5 mL) BD Syringes 1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisherbrand 12-550-343
Coverslips (24 x 50 mm) Corning 2935-245
5 mL glass conical tube Corning 8060-5
9" disposable Pasteur pipette Fisherbrand 13-678-20D
Clinical bench top centrifuge
Glass  tubes (6 x 50 mm) Fisherbrand 14-958-A
*M9 solution
Levamisole Sigma L9756
3% Paraformaldehyde (PFA) Electron microscopy services 17500 Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer
1x PBS-T 1x PBS with 0.1% Tween 20
Methanol Electron microscopy services 18510
Normal goat serum (NGS) Cell Signaling 5425 Diluted to 30% in 1x PBS-T
MAPKYT (dpERK) antibody  Sigma Inc. M9692 Dilution 1:400 in 30% NGS
Secondary antibody Invitrogen A-11005 Dilution 1:500 in 30% NGS
DAPI Sigma D9542
Vectashield Vector Labs H-1000
*M9 Buffer Recipe 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. 
**PBS (1x) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L
Nematode Growth Medium (NGM) 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4

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References

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में सक्रिय ERK के स्थानिक और लौकिक विश्लेषण<em&gt; सी। एलिगेंस</em&gt; जर्मलाइन
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Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).More

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).

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