Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Romlig og tidsmessig analyse av Active ERK i Published: November 29, 2016 doi: 10.3791/54901
Automatic Translation
1, 1,2
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center

Summary

Vi presenterer en immunfluorescens bildebasert metode for romlig og tidsmessig lokalisering av aktive ERK i dissekert C. elegans gonade. Protokollen er beskrevet her kan tilpasses for visualisering av en hvilken som helst signalering eller strukturelt protein i C. elegans gonade, gitt en passende antistoff reagens er tilgjengelig.

Abstract

Den evolusjonært konservert ekstracellulære signalførende RTK-RAS-ERK veien er en viktig kinase-signalkaskade som styrer flere cellulære og utviklingsprosesser hovedsakelig via aktivering av ERK, terminal kinase av veien. Tight regulering av ERK aktivitet er viktig for normal utvikling og homeostase; altfor aktive ERK resulterer i overdreven cellulær proliferasjon, mens active ERK fører til celledød. C. elegans er en kraftig modellsystem som har hjulpet karakteriserer funksjon og regulering av RTK-RAS-ERK signalveien under utvikling. Spesielt er det RTK-RAS-ERK-reaksjonsveien avgjørende for C. elegans germline utvikling, som er fokus for denne metoden. Ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for den aktive, diphosphorylated form av ERK (dpERK), den stereotype lokalisering mønsteret kan visualiseres i germline. Fordi dette mønsteret er både romlig og tidsmessig kontrollerendeed, evnen til å analysere reproduserbart dpERK er nyttige for å identifisere regulatorer av den bane som påvirker dpERK signal varighet og amplitude og således germline utvikling. Her viser vi hvordan du lykkes dissekere, beis og bilde dpERK i C. elegans gonade. Denne fremgangsmåten kan tilpasses for romlig lokalisering av en hvilken som helst signale eller strukturelt protein i C. elegans gonade, forutsatt et antistoff kompatibel med immunfluorescens er tilgjengelig.

Introduction

Den reseptor-tyrosinkinase (RTK) -RAt Sarkom (RAS) -Extracellular signal regulert kinase (ERK) pathway releer ekstracellulære signaler gjennom en konservert kinase kaskade som fører til fosforylering og aktivering av ERK 1-3. ERK-proteiner er medlemmer av den konserverte prolin-rettet serin / treonin-MAP (Mitogen Aktivert Protein)-kinase-familien, og blir direkte aktivert av MEK via dobbel fosforylering på treonin (T) og tyrosin (Y) av den konserverte TEY motiv. Aktiv ERK (referert til som diphosphorylated ERK, eller dpERK) regulerer så mange cellulære og utviklingsprosesser gjennom fosforylering av et batteri av nedstrøms underlag 1-3. Dermed unormal ERK aktivitet fører til mange celle og utviklingsmessige defekter 4-7.

Strengere regulering av ERK aktivitet er avgjørende for normal utvikling: i pattedyrsystemer for mye ERK aktivitet fører til overdreven mobil spredning ledendetil onkogene vekst; for lite aktivitet fører til celledød 4,6. Dessuten kan endringer i varigheten av ERK-aktivitet også føre til forskjellige resultater: i PC12-celler, ERK-aktivering i 30 minutter eller mindre induserer celleproliferasjon, men ERK-aktivering i 60 minutter eller mer induserer neuronal differensiering 8,9. Tight regulering av ERK aktivitet er dermed klart viktig for normal utvikling og homeostase.

C. elegans er en kraftig og genetisk formmodellsystem for å dissekere funksjon og regulering av RTK-RAS-ERK signalveien 3,10-15. I forhold til pattedyrsystemer, som inneholder flere gener for RAS og ERK, C. elegans inneholder en RAS-genet (la-60) og en ERK gen (MPK - 1), som gjør det en genetisk mer lettvint system der å dissekere funksjon av denne veien 3,10-14. Den C. elegans kimlinje er i det vesentlige et rør som består av mitotiskestamceller ved sin distale ende og modne oocytter ved sin proksimale ende (figur 1) 16. Kimceller initiere meiose proksimalt til den distale mitotisk sonen, og fremdrift gjennom en utvidet meiotisk prophase (pachytene), hvoretter de begynner å danne oocytter i sløyfen region, og til slutt gjennomgår oocytmodningen i det proksimale område 16.

Genetiske studier fra flere laboratorier, inkludert vår egen, har vist at RTK-RAS-ERK veien er viktig for germline utvikling i C. elegans 12,13,15,17-19. Nærmere bestemt har vi funnet at ERK styrer og koordinerer minst ni forskjellige biologiske prosesser under germline utvikling, som strekker seg fra utviklingsmessige brytere slik som bakterie-celle til celle apoptose biologiske prosesser som oocyte vekst 11,18. Mye som i pattedyrsystemer, for mye ERK aktivitet i C. elegans germline resultater i produksjon av flere små ubefruktede egg, mens for little aktivitet resulterer i en stor eggcelle 11. Dermed stram regulering av dpERK er viktig for normal germline utvikling. Den aktive form av ERK, som visualisert med et antistoff spesifikt for dpERK, viser en stereotype, dynamisk, bimodal lokalisering mønster: dpERK er høy i løpet av midten av pachytene (sone 1, figur 1), lav i sløyfen regionen og høy igjen i modne ubefruktede egg (sone 2, figur 1). Nylig, har vi funnet at ernæring virker gjennom den Insulin-like Growth Factor-reseptor-1 (daf-2) for å aktivere ERK i sone 1 12; tidligere arbeid viste at sæden signal (via Efrin reseptor-tyrosinkinase) aktiverer ERK i sone 2 13.

Gitt at aktive ERK fungerer som en rheostat i kimlinje for å regulere oocytt vekst, romlig og tidsmessig lokalisering, så vel som amplituden av dpERK, er nøkkelen til å forstå den normale signaleringen utfall. Ved å bruke den fremgangsmåten som er beskrevet her, endres istereotype lokalisering av dpERK lett kan overvåkes og spådommer avledet på virkningen av de miljømessige eller genetiske forstyrrelser på ERK aktivitet og dermed funksjon. Således analysere med hensyn på dpERK muliggjør en omfattende forståelse av sin rolle under germline utvikling.

Protocol

Protokollen er beskrevet her er først og fremst for virvelløse modellsystem C. elegans, og følger alle de etiske retningslinjene fastsatt av institusjonen.

1. Animal Vedlikehold

  1. Oppretthold C. elegans arbeider stamkulturer på nematode vekstmedium 20,21 (NGM, se Materialer tabell) agar sådd med E. coli OP50.
  2. Oppretthold orm aksjer ved temperaturer mellom 16 ° C og 25 ° C.
    MERK: Dyrking ormer ved høyere temperaturer fører til raskere vekst, ofte avvik kimcellelinje utvikling og lavere stamfisk størrelser. I tillegg vil temperatursensitive genotyper vise forskjellige fenotyper ved forskjellige temperaturer.
  3. Overfør ormer til nye NGM platene hver 2 - 3 dager, avhengig av deres veksthastighet for derved å opprettholde en konstant tilførsel av godt matet ormer.
    MERK: For en gitt eksperiment med dpERK nivåer, ormer bør ikke hentes fra et sultet eller publikumed plate. Trengsel eller sult påvirker insulinsignalering i ormer 22, og insulinsignaler regulerer ERK 12 aktivitet. Således ormer fra sultet eller fylte plater vil resultere i varierende og vanskelige å reprodusere fargemønstre.

2. Disseksjon av voksne ormer for Innhenting Gonader

  1. Pick 100-150 WT (N2) eller ønskede genotype av ormer ved den ønskede og bestemte utviklingsstadiet (L1, L2, L3, L4, voksen, osv.) I 100 ul av M9 buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  2. Fyll mikrosentrifugerør med 900 mL av M9 buffer (se Materialer tabell). Sentrifugere rørene ved 1000 x g i en mikrosentrifuge i 1 min ved omgivelsestemperatur.
  3. Fjern forsiktig 900 mL av M9 buffer og kast. Fjerne bufferen under et disseksjonsmikroskop for å sikre at ormer ikke ved et uhell fjernes.
  4. Gjenta trinn 2.2 - 2.3 to ganger med frisk M9 buffer hver gang.Dette sikrer at eventuelle bakterier som ble overført med ormene er effektivt vasket bort.
  5. Etter den siste vask fjerne 900 mL av M9 buffer fra røret og kast.
  6. Overfør de resterende 100 mL M9 buffer som inneholder 100 - 150 ormer med en 200 mL-mikropipette tips til en flat bunn glass watch parabolen. Pass på at mikropipette spissen er kuttet på 10 ul mark før bruk. Ikke skjærende tuppen vil resultere i skjæring av ormer.
  7. Legg 1 - 3 ul av 0,1 M levamisol til glassklokke skål inneholdende ormer i M9 buffer. Forsiktig virvle levamisol og M9 å aktivere selv blande til ormer slutter å bevege seg.
    MERK: levamisol aksjer kan oppbevares ved -20 ° C for langtidslagring. Her bruker den høyere konsentrasjon av 1 - 3 mM enn det som er blitt beskrevet i litteraturen 23 på 0,2 - 0,25 mm for levamisol, for å oppnå hurtig tap av mobilitet i dyrene. Hvis dyrene flå rundt for long i den flytende suspensjon, kan de resulterende mønstrene av dpERK i gonadene være variabel (på grunn av stress eller mangel på næring eller begge deler). Mer reproduserbare fargemønstre er oppnådd med 1-3 mM levamisol for disseksjon.
  8. Feste to 25 g nåler til to 1 ml sprøyter (størrelsen på sprøyten spiller ingen rolle, er måleren av nålen kritisk). Posisjon en sprøyte i hver hånd (figur 2).
  9. Under en dissekere mikroskop, plasserer hver nål under og over hvert orm som vist i figur 2 og plassere et fint kutt på orm i nærheten av andre svelget pære i en sakselignende bevegelse. Etter en kutt i ormen gå videre til neste dyr til alle dyrene i retten har blitt kuttet minst én gang.
    MERK: Vær oppmerksom på at trinn 02.08 til 02.09 er tid sensitive. Dissekere alle ormer i retten på under fem minutter for en reproduserbar dpERK mønster. Lengre disseksjon ganger vil resultere i en dreining av av dpERK signal, spesielt i Z-en 1. Juster antall ormer pr runde av disseksjon (dvs. 50 ormer vs 150) hvis det er nødvendig for å holde seg i den avsatte tidsrammen.
    1. I tilfelle en ekstrudert gonade er ikke synlig i løpet av disseksjon, ikke prøv en annen kutt i samme dyr. Vanligvis er det bare vil skjære dyr og ikke resulterer i ekstrudering av gonade. I stedet, gå videre til neste dyr. Worms der gonadene ikke Extrude vises som sådan på lysbildene som vil bli gjort i kapittel 6 og kan ignoreres under bildebehandling
      MERK: Gjennom alle de disseksjon og behandlingstrinn, er det viktig å huske på at gonade vil forbli festet til kroppen / kadaver. Ikke tving gonade og kroppen fra hverandre med nålen. Ofte et aberrant rive i gonadal vevet i et forsøk på å skille den gonade fra kroppen kan resultere i uønsket antistoff-signal. Kroppen / kadaver kan ignoreres under imaging trinn (§ 6), og bare den gonade avbildes. I tillegg, SOMetimes tarmcellene kan også tjene som interne kontroller / somatiske kontroller for antistoffet som analyseres.

3. Gonade Fixation

  1. Etter disseksjon er fullført, tilsettes 2 ml av 3% paraformaldehyd (PFA) direkte til glassklokke skål inneholdende 100 ul av M9 og de dissekerte dyr og dekk med Parafilm. Plasser dekket urglass rett i avtrekksskap.
    Forsiktig: PFA er et farlig kjemikalie. Således bør fiksering utføres i avtrekksskap.
  2. Inkuber ved RT i 10 min.
  3. Ved hjelp av en engangs 9 "glass Pasteur pipette legge 3 ml 1x PBS-T (se Materialer tabell) til klokken glassfat som inneholder de dissekerte dyr. Mix ved å tegne PFA løsning og 1x PBS-T med de dissekerte dyr inn i Pasteur pipette og slippe forsiktig tilbake på klokken glassfat. ikke vortex rør under vask.
  4. Ved hjelp av en fresh glass Pasteur pipette trekke 5 ml væske (inneholder dissekert ormer, PFA og 1x PBS-T) fra klokken glassfat inn i Pasteur pipette og overføre innholdet til en ny 5 ml glass konisk tube.
  5. Sentrifuger koniske rør på 30 sekunder i en klinisk sentrifuge ved 1000 x g. Bruk glass Pasteur pipetter og koniske rør som dissekerte gonadene holde seg til plast.
  6. Fjern og kast supernatanten ta vare for ikke å forstyrre de dissekerte dyr. Fjern væsken etter hver vask fra den koniske rør under et disseksjonsmikroskop for ikke å påvirke de dissekerte gonadene, og minimere deres tap.
  7. Ved hjelp av en frisk Pasteur pipette, tilsett 5 ml 1x PBS-T til de koniske rør. Sentrifuger de koniske rør i en klinisk sentrifuge i 30 sekunder ved 1000 x g. Fjern og kast supernatanten ta vare for ikke å forstyrre de dissekerte dyr.
  8. Gjenta trinn 3,7 i totalt tre ganger.
  9. Ved hjelp av en frisk Pasteur pipette, tilsett 2 ml av 100%metanol til rørene, og forsiktig blande gonadene med metanol ved å trekke opp i Pasteur-pipette. Inkuber røret ved -20 ° C i minimum 1 time.
    MERK: dissekert gonadene kan lagres i metanol for opp til 2 dager for dpERK farging. Lagring i mer enn 2 dager og opp til to uker er kompatibel med andre antistoff flekker programmer, for eksempel anti-Lamin antistoff, men ikke med dpERK antistoff.
  10. Etter den ønskede inkubasjonstiden, gjenta trinn 3,7 i totalt tre ganger for å vaske gonadene. Ikke vortex rør under vask. Etter den siste vask gitt 500 ul av 1 x PBS-T i 5 ml konisk rør.
  11. Ved hjelp av en frisk Pasteur pipette overføres innholdet i den koniske glassrøret inn i et friskt 1 ml glassrør (6 mm x 50 mm). La de dissekerte dyr å bosette av tyngdekraften i 5 - 10 min.
  12. Ved hjelp av en frisk Pasteur pipette og under et disseksjonsmikroskop, fjerne så mye av vaske som mulig fra en mL glassrør vettHout forstyrre dissekert gonadene.

4. Blokkere og primær antistoff Treatment

  1. Tilsett 100 ul av 30% normalt geiteserum (NGS) fortynnet i 1 x PBS-T (se Materialer tabell) til de dissekerte dyrene i 1 ml glassrør. 30% NGS tjener som blokkeringsbuffer. Dekk røret med Parafilm for å unngå fordampning av væsken. Inkuber ved romtemperatur i 1 time eller ved 4 ° C over natten.
  2. Etter den ønskede inkubasjonstiden, fjern blokkeringsbuffer ved anvendelse av en frisk Pasteur pipette for å fjerne så mye væske som mulig. Bruk en dissekere mikroskop for å sikre at gonadene ikke er trukket opp i Pasteur pipette.
  3. Fortynn MAPKYT antistoff (se tabell materialer, omtales i denne metoden som dpERK) ved 1: 400 i 30% NGS. Forbered nok antistoff fortynning til å bruke 100 mL per rør. Ubrukte, fortynnet antistoff kan lagres ved 4 ° C i en uke.
  4. Tilsett 100 ul av det fortynnede anti dpERK antistoff såning til 1 ml glassrør som inneholder dissekerte dyr. Tett rør med Parafilm. Inkuber rørene ved 4 ° C over natten.
  5. Etter inkubasjon over natten, tilsett 800 mL av 1x PBST til rørene ved RT.
  6. Trekke prøven opp i et nytt glass Pasteur pipette og forsiktig slipper å sikre at gonadene er jevnt suspendert i 1 x PBS-T. La gonadene sette seg på bunnen sammen med tyngdekraften. Fjern supernatanten. Dette sikrer at de dissekerte gonadene blir vasket, men ikke skades under prosessen.
  7. Gjenta trinn 04.05 til 04.06 for totalt tre vasker. Ikke vortex rør under vask. Etter tredje vask sørg for å fjerne og kast så mye supernatant som mulig uten å forstyrre de dissekerte dyr. Sørg for at en frisk Pasteur pipette brukes hver gang.

5. sekundært antistoff Behandling

  1. I løpet av det primære antistoff vasker forberede fortynning for det sekundære antistoff. Fortynn den anti-mus secondary antistoff i 1: 500 i 30% NGS. Som med det primære antistoff ved å bruke 100 pl per rør. Ubrukt antistoff kan lagres ved 4 ° C i en uke.
  2. Tilsett 100 ul sekundært antistoff løsning på 1 ml glassrørene inneholdende de dissekerte dyrene. Dekker hvert rør med Parafilm, og deretter vikle rørene i aluminiumsfolie for å holde innholdet i røret i mørket. Inkuber rørene ved RT i 2 timer, eller alternativt ved 4 ° C over natten.
  3. Etter den ønskede inkubasjonstiden, tilsett 800 ul av 1 x PBS-T til rørene og gjenta trinn 4.5 til 4.6 for totalt tre ganger. Etter siste vask og ta bort så mye av supernatanten som mulig under en dissekere mikroskop med en ny Pasteur pipette.
  4. Klargjør DAPI løsning i løpet av de vasker for den sekundære antistoff. Fortynn 1 mL av DAPI (fra en 1,000x lager av 1 mg / ml lagret ved -20 ° C) in- 1 ml 1x PBST.
  5. Legg 800 ul av den fortynnede løsning DAPI til rørene inneholdendedissekert dyr. Dekker munningen av røret med Parafilm og vikle hvert rør i aluminiumsfolie. Inkuber ved RT i 20 min.
  6. Etter inkubasjon med DAPI, fjerner så mye av DAPI-oppløsning som er mulig med en frisk Pasteur pipette, under et disseksjonsmikroskop for ikke å forstyrre de dissekerte dyrene.
  7. Tilsett 1 dråpe monteringsløsning til rørene. Pakk hvert rør i aluminiumsfolie.
    MERK: For å visualisere dpERK flekker, bør farget gonadene monteres for mikros umiddelbart. For andre antistoff applikasjoner som fosforylert serin 10 Histone H3, kan gonader holdes i montering media i opptil 2 uker ved 4 ° C i mørket.

6. Montering Lysbilder og bildebehandling

  1. Plassere et lag av lab bånd i lengderetningen, på toppen, av to glassmikroskopobjektglass (25 mm x 75 mm x 1 mm) som vist i figur 3. Sette inn en ny ren mikroskop-objektglass i mellom de to tapet lysbilder.
    MERK: Tykkelsenav båndet bidrar til å generere en agarose pad på midten lysbildet. Tykkelsen av agarose puten er nesten lik den for båndet, som kassetten tjener som et avstandsstykke for å skape agarose puten.
  2. Dråpe ~ 200 mL av smeltet 2% agarose (fremstilt i destillert vann) på objektglass i midten. Raskt plassere en frisk og ren lysbilde, vinkelrett og på toppen, av agarose.
  3. La den stivne agarose (1 - 2 min).
  4. Fjern den øverste objektglass meget forsiktig, slik at agarose puten ikke er ødelagt. Agarose puten kan forbli festet enten til toppen eller bunnen lysbildet. Det spiller ingen rolle hvilken glide agarose puten forblir festet til, så lenge det er en jevn overflate av agarose.
  5. Ved hjelp av en Pasteur pipette overføre dissekerte dyr på agarose puten. Fjern overflødig væske fra raset ved hjelp av en Pasteur pipette under et dissekere mikroskop.
  6. Ved hjelp av en øyenvippe hår eller fint trekkes kapillært, skyv gonader og tarmene envei fra hverandre for å spre gonadene ut på lysbildet.
  7. Dekk objektglass med en 24 mm x 50 mm størrelse dekkglass. Pass på at dekk senkes forsiktig ned på lysbildet med minimale luftbobler som dannes mellom dekkglass og lysbildet.
  8. Oppbevar ved 4 ° C over natten i en glideboks (et ugjennomsiktig lysbilde eske med skinnene liggende flate, dekkglass opp) for å tillate at overskudd av væske for å fordampe og gonadene til å bli litt flattrykt (på grunn av vekten av dekkglass på gonadene). Den liten utflating av gonadene gir bedre avbildning av en ellers runde gonadal tube.
    1. Når dekkglass er montert, ikke å legge trykk på toppen av dekkglass med fingrene. Ofte resulterer dette i forvrengning av gonadene og tap av dpERK signal.
    2. Flat gonadene natten bare for mer effektiv bildebehandling. Skinnene er klar til å bli sett på som snart de er sammenstilt. For å ta bilder umiddelbart, forsiktig absorbereden overskytende væske mellom dekkglass og objektglasset fra hjørnene ved hjelp av en ren lab vev.
  9. Etter over natten perioden, forsegle sklie og dekk med gjennomsiktig neglelakk topcoat på de fire hjørnene av dekkglass og lysbildet grensen. Neglelakk / dekkglass forsegling sikrer at dekkglasset ikke beveger seg, mens avbildning og beskytter mot ødeleggelse av prøvene.
  10. Bilde gonadene med et sammensatt mikroskop på 63X. Imidlertid objektivlinsen og mikroskop kan varieres basert på tilgjengeligheten av mikroskoper og brukerprogram. På grunn av størrelsen på hele gonade fra den proliferative regionen til oocyttene er større enn det som kan fanges opp i en bilde, blir bildene tatt som en montasje med overlappende grenser som er vist i figur 4. 11-14, 18.
    1. I mange tilfeller, redigere kadaveret etter siste bildebehandling og montering, så lenge ingen store endringer er gjort i germline bildet. butikk than råbilder langs den sammensatte bildet for å muliggjøre sammenligning av "før" montering / redigering og "etter" montering / redigering av bildene.
      MERK: mikroskopi bilder må ikke endres for signalstyrke eller metning under montering av montasjen.

Representative Results

I WT voksne tvekjønnet dyr, er dpERK vanligvis visualisert i midten pachytene regionen, sone 1, og i de mest modne eggceller fra -1 gjennom -4 eller -5 (sone 2). Forstyrrelser i denne aktivitetsmønsteret gjenspeile endringer i signalveien. Kvinnelige germlines spesifiserer ikke spermier og således ikke viser aktivering av ERK i sone 2, med bare svak aktivering i sone 1. Disse er representert i figur 5.

Figur 1
Figur 1: C. elegans germline Morfologi. Differential interferens kontrast (DIC) bilde av en voksen hermafroditt med en U-formet gonade arm skissert med den hvite linjen. Den voksne tvekjønnet gonade inneholder mitotiske celler ved den distale spissen. Mitotiske celler inn meiose og fremgang gjennom meiotisk prophase (pachytene) utvikler seg til mature oocytter i proksimale gonade. Sone 1 og sone 2 mark stereotype lokalisering av dpERK i en voksen tvekjønnet gonade. Scale. 20 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Demonstrasjon av nåleposisjonene under disseksjoner Venstre. Fotografi av en disseksjon i prosessen. Høyre:. Needle stillinger med referanse til ormen Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Demonstrasjon av Agarose Slide forberedelse. (A) Plasser en tape lengthwise over 2 rene objektglass. Plasser en frisk og ren objektglass mellom de to lysbilder med tape som vist. De tre lysbilder er ved siden av hverandre i lengderetningen. (B) Legg smeltet agarose til raset i sentrum. (C) Plasser en frisk objektglass vinkelrett, og på toppen av, midt slide, bærer dråpe agarose. ( D) La agarose å stivne. (E) Fjern den øverste lysbildet later størknet agarose puten. Bruk bunnen lysbilde med agarose pad for montering dissekert og farget germlines. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Imaging Slides som en montasje montasje av en villtype germline med DAPI (t.op) og dpERK (nederst) kanal. Bilder tatt på 63X med overlappende grenser, ble hvite bokser for panel A og B og grønne bokser for panel B og C. DAPI og dpERK bilder for hvert panel tatt samtidig i to forskjellige kanaler. Det sammensatte bildet er vist i figur 5A. Skala:. 20 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Dynamisk Temporal / Spatial Aktivering av ERK. (AC) WT (N2) voksen (24 timer tidligere mid-L4 utviklingstrinn) hermafroditt germlines farget for DNA (B, DAPI, hvit) og dpERK (C, rød). Den dpERK signal i sone 1, den pachytene regionen, og sone 2, modne oocytter er markert. (DF)tåke-2 (oz40) kvinnelige germlines (8 h forbi midten-L4 utviklingstrinn) farget for DNA (E, DAPI) og dpERK (F). Unge kvinnelige germlines vise svak dpERK i sone 1, og i en enkelt eggcelle i en sperm uavhengig måte. Sone 2 er sperm avhengig, og således fraværende i den kvinnelige germline. Skala:. 20 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Aktiv ERK (dpERK) følger en stereotype romlig og dynamisk lokalisering mønster i C. elegans germline. Denne stereotype dpERK romlig mønster (figur 5), og amplitude i en voksen C. elegans gonade, kan være effektivt korrelert med mange biologiske prosesser som ERK regulerer. For eksempel vil en manglende evne aktivere ERK i sone 2 gir en arrestasjon i oocytter i profase av meiose, en fenotype observert hos kvinnelige germlines som ikke angir sperm, og dermed ikke aktiverer ERK i modne oocytter (figur 5). Parring med hanner resultater i effektiv oppsamling av dpERK i sone 2 i kvinnelige germlines 11,13, kombinert med utbruddet av oocytmodningen og eggløsning. Således analyse av romlige og temporale mønstre aktivering av dpERK ved visse genetiske forstyrrelser (slik som RNA-interferens-formidlet gen-inaktivering) eller kjemiske behandlinger gir mulighet for identifisering av faktorer som forskriftensen ERK signalering og således ERK-avhengige biologiske prosesser. Slike analyser gjør det mulig også oppdagelsen av nye genetiske interaksjoner mellom signalveier.

En kritisk flaskehals for enhver tenkelig basert analyse er tilgjengeligheten av funksjonelle reagenser, slik som antistoffer som er spesifikke for programmet. Dersom et slikt reagens foreligger da fremgangsmåter slik som den er beskrevet ovenfor kan lett tilpasses for analyse av lokaliseringsmønster for hvilket som helst protein av interesse. Søknaden er således begrenset av tilgjengeligheten av et fungerende antistoff. I tillegg, fordi metoden beskriver disseksjon og flekker på et gitt utviklings tid, gjør det bare fange av informasjon i en tidsramme, og ikke kaste lys over dynamikken eller protein regulering i sanntid eller frekvensen av protein omsetning.

Fremgangsmåten beskrevet ovenfor er tilpasset fra Francis et al. 23, som er forskjellig fra den Seydoux og Dunn method 24 for gonade ekstrudering og antistoff farging. Fremgangsmåten basert på Francis et al., Vil bli kalt "suspensjon metoden" og den Seydoux og Dunn metode kalt "frosset cracking metode" for sammenligning. Suspensjonen metoden har vært svært effektive i våre hender for å få reproduserbare lokaliseringsmønstre signalmolekyler som dpERK, som er iboende mer følsom for harde bruksforhold. I tilfelle av dpERK lokalisering, i vår erfaring, signalet i sone 1 er nesten umulig å oppdage med fryse sprengning metoden. I tillegg prøve tørking, noe som ofte kan forekomme med det fryse cracking metode, resulterer i falske signaler antistoff. Suspensjonen metoden minimerer prøve tørking, ettersom gonadene blir suspendert i væsken under hele prosessen. Vi finner også at suspensjonen metoden er nyttig for å avbilde flere ulike genotyper på et enkelt lysbilde. For eksempel, hvis to genotyper som hermafroditter vskvinner er å være direkte i forhold til dpERK lokalisering, de to genotyper kan blandes sammen og behandlet. Dette er mulig fordi fenotyper er distinkt og kan skilles via DAPI morfologi. Farging i samme rør etterfulgt av bildediagnostikk på samme lysbilde åpner for direkte sammenligning mellom gonadene fra ulike genotyper. Alternativt, hvis DAPI morfologi ikke skjelnes, deretter en to-trinns antistoff flekker kan bli vedtatt. Først hver enkelt genotype ble behandlet med to forskjellige antistoffer, antistoff A for WT og antistoff B for mutant (begge antistoffene må heves i en vert forskjellig fra den dpERK antistoff). Når de to genotyper er farget med det primære antistoff, og vaskes, kan de bli blandet sammen i en tube, og nå farget med den dpERK antistoff, fulgt av et sekundært antistoff for å visualisere behandlings alle antistoffer i røret. En evne til å sammenligne ulike genotyper på et enkelt lysbilde, spesielt når deductions av aktiveringsmønstre blir gjort sikrer nøyaktige tolkninger som ikke berøres av distinkte flekker forhold.

Mens fordelaktig det er flere trinn i hele suspensjonen metode som krever forsiktig manipulering. Det er viktig at dissections forekomme i en tid effektiv måte; viktigst, bør disseksjoner ikke ta over 5 min. Lengre disseksjon ganger resultere i variabel dpERK signal, som ofte kan feiltolkes som regulerte endringer i ERK-aktivering, snarere enn som tekniske feil. Det er viktig å starte med over 100-150 dyr for hver disseksjon fordi hele ulike vaske trinn gonadene kan lett gå tapt fra rørene på grunn av pipettering feil. Tap av gonadene kan reduseres enten ved å dissekere i flere små grupper (for eksempel tre grupper av 50 dyr hver) som kan kombineres, eller ved å dissekere en stor gruppe med 150. En annen utfordring er å få gonadene til å ligge i et godt linjeavstand formasjonpå sleiden slik at hele distale gonade kan avbildes. For å aktivere dette, bruker en øyenvippe på en fyrstikk eller et trukket pipette til verdensrommet ut gonadene. Imidlertid bør man være forsiktig for ikke å skade gonadene under denne prosessen. Ofte med disse teknikkene tar det flere forsøk på å mestre disseksjoner samt arrangementer av gonadene på lysbilder.

Når denne teknikken har vært mestret, fungerer den som en kraftig metode for varierte biologiske analyser, og kan brukes til å undersøke mer enn bare dpERK nivåer. For eksempel kan brukes til denne fremgangsmåte for å visualisere aktive p38-nivåer, eller aktive CDK-nivåer, eller en hvilken som helst protein som et antistoff reagens eksisterer. I tillegg kan fremgangsmåten bli kombinert med en kjemisk inhibering skjerm i hele dyr for å assay for nye inhibitorer eller aktivatorer av den vei, via analysering for dpERK nivåer. Dette vil gi rom for en in vivo avlesning av både reaksjonen og følsomhet for eventuelle hemmere som kan interact med RTK-RAS-ERK signalveien. Videre kan denne fremgangsmåte anvendes i antistoff-kombinasjoner med flere signalutganger som alle kan anvendes og visualiseres på en gang. Bruke flere antistoffer tillater korrelasjon mellom flere veier, deres aktivisering status og utfall alt innenfor samme vev, slik at bedre forståelse av disse interaksjonene. Dette er bare noen få eksempler på ytterligere anvendelser av denne metoden, men dette systemet kan bli endret for å studere flere forskningsinteresser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Inc. A9539 Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution
Flat bottom glass watch dish Agar Scientific AGL4161 We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles BD PrecisionGlide 305122
Syringes (could be 1 or 5 mL) BD Syringes 1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisherbrand 12-550-343
Coverslips (24 x 50 mm) Corning 2935-245
5 mL glass conical tube Corning 8060-5
9" disposable Pasteur pipette Fisherbrand 13-678-20D
Clinical bench top centrifuge
Glass  tubes (6 x 50 mm) Fisherbrand 14-958-A
*M9 solution
Levamisole Sigma L9756
3% Paraformaldehyde (PFA) Electron microscopy services 17500 Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer
1x PBS-T 1x PBS with 0.1% Tween 20
Methanol Electron microscopy services 18510
Normal goat serum (NGS) Cell Signaling 5425 Diluted to 30% in 1x PBS-T
MAPKYT (dpERK) antibody  Sigma Inc. M9692 Dilution 1:400 in 30% NGS
Secondary antibody Invitrogen A-11005 Dilution 1:500 in 30% NGS
DAPI Sigma D9542
Vectashield Vector Labs H-1000
*M9 Buffer Recipe 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. 
**PBS (1x) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L
Nematode Growth Medium (NGM) 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
  2. McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
  3. Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
  4. Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
  5. Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
  6. Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
  7. Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).
  8. Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
  10. Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
  11. Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
  12. Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
  13. Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
  14. Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
  15. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
  16. Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
  17. Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
  18. Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
  19. Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
  20. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
  23. Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
  24. Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).

Tags

Developmental Biology RAS-ERK, Germline, immunfluorescens signalanlegg proteiner
Romlig og tidsmessig analyse av Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; kimcellelinje
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial… More

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter