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Developmental Biology

Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der doi: 10.3791/54901 Published: November 29, 2016

Summary

Wir präsentieren ein Immunofluoreszenz Imaging-basiertes Verfahren zur räumlichen und zeitlichen Lokalisierung von aktiven ERK im seziert C. elegans Gonaden. Das hier beschriebene Protokoll kann zur Visualisierung von beliebigen Signalisierungs- oder Strukturprotein in der C angepasst werden elegans Gonaden, sofern ein geeigneter Antikörper - Reagenz zur Verfügung steht.

Abstract

Das evolutionär konservierten extrazellulären Signal RTK-RAS-ERK Weg transduzierenden ist ein wichtiger Kinase-Signalkaskade , die mehrere zelluläre und Entwicklungsprozesse in erster Linie über die Aktivierung von ERK, die terminale Kinase des Weges steuert. Enge Regulierung der ERK-Aktivität ist wichtig für die normale Entwicklung und Homöostase; übermäßig aktiv ERK führt zu einem übermäßigen Zellproliferation, während Unterfunktion der ERK verursacht Zelltod. C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellsystem , das dazu beigetragen hat , die Funktion und Regulation von RTK-RAS-ERK - Signalwegs während der Entwicklung zu charakterisieren. Insbesondere ist die RTK-RAS-ERK Weg von wesentlicher Bedeutung für C. elegans - Keimbahn - Entwicklung, die im Fokus dieser Methode ist. Antikörper , die spezifisch an das aktive, diphosphorylierte Form von ERK (dpERK), der stereotypisch Lokalisierungsmuster innerhalb der Keimbahn sichtbar gemacht werden können Verwendung. Da dieses Muster ist sowohl räumlich als auch zeitlich controlled, die Fähigkeit dpERK reproduzierbar Assay ist nützlich Regler des Weges, die dpERK Signaldauer und die Amplitude und damit die Keimbahn Entwicklung beeinflussen zu identifizieren. Hier zeigen wir , wie man erfolgreich sezieren, Fleck und Bild dpERK innerhalb des C elegans Gonaden. Dieses Verfahren kann für die räumliche Lokalisierung jeder Signal oder Strukturprotein in der C angepasst werden elegans Gonaden, sofern ein Antikörper kompatibel mit Immunofluoreszenz zur Verfügung steht.

Introduction

Die Rezeptor - Tyrosinkinase (RTK) -Ratte Sarcoma (RAS) -Extracellular Signal regulierter Kinase (ERK) -Weg leitet extrazelluläre Signale durch eine konservierte Kinase - Kaskade, die in der Phosphorylierung und Aktivierung von ERK 1-3 führt. ERK - Proteine sind Mitglieder der konservierten Prolin-Serin / Threonin - MAP (Mitogen - aktivierte Protein) Kinase - Familie, und werden direkt von MEK durch duale Phosphorylierung am Threonin (T) und Tyrosin (Y) des konservierten Motivs TEY aktiviert. Aktive ERK (bezeichnet als diphosphorylierte ERK oder dpERK) regelt dann viele zelluläre und Entwicklungsprozesse durch die Phosphorylierung einer Batterie nachgeschalteter Substrate 1-3. So abnormal ERK - Aktivität führt zu vielen Zell- und Entwicklungsstörungen 4-7.

Strikte Regulierung der ERK-Aktivität ist entscheidend für die normale Entwicklung: in Säugetiersystemen zu viel ERK-Aktivität führt zu einer übermäßigen Zellproliferation führendenzu onkogene Wachstum; zu wenig Aktivität führt zum Zelltod 4,6. Zusätzlich können Änderungen in der Dauer der ERK - Aktivität auch zu deutlichen Ergebnissen führen: in PC12 - Zellen, ERK - Aktivierung für 30 min oder weniger induziert Zellproliferation, aber ERK - Aktivierung für 60 min oder mehr induziert die neuronale Differenzierung 8,9. Enge Regulierung der ERK-Aktivität ist somit eindeutig wichtig für die normale Entwicklung und Homöostase.

C. elegans ist ein leistungsfähiges und genetisch formbar Modellsystem die Funktion und Regulation des RTK-RAS-ERK - Signalwegs 3,10-15 zu sezieren. Relativ zu Säugersystemen, die mehrere Gene , die für RAS und ERK enthalten, C. elegans enthält ein RAS - Gen (let-60) und einem ERK - Gen (mpk - 1), ist es ein genetisch facile System , bei dem Rendern die Funktion dieses Weges 3,10-14 zu sezieren. Die C. elegans Keimbahn ist im wesentlichen ein Rohr , das von mitotischen bestehtStammzellen an seinem distalen Ende und reifen Oozyten an seinem proximalen Ende (1) , 16. Keimzellen initiieren Meiose gerade proximal zu dem distalen mitotischen Zone und schreitet voran durch eine ausgedehnte meiotischen Prophase (Pachytän), wonach sie beginnen Oozyten in dem Schleifenbereich zu bilden, schließlich erfährt Oozytenreifung im proximalen Bereich 16.

Genetische Studien von mehreren Labors, einschließlich unserer eigenen, haben gezeigt , dass die RTK-RAS-ERK Weg für die Entwicklung der Keimbahn in C. wesentlich ist elegans 12,13,15,17-19. Insbesondere fanden wir , dass ERK steuert und koordiniert mindestens neun unterschiedliche biologische Prozesse bei der Entwicklung der Keimbahn, aus der Entwicklungs Schalter hin wie germ cell apoptosis biologische Prozesse wie Oozyte Wachstum 11,18 zu Zelle. Ähnlich wie in Säugersystemen zu viel ERK - Aktivität in der C. elegans - Keimbahn - Ergebnisse bei der Herstellung von mehreren kleinen Oozyten, während eine zu little Aktivität führt zu einer großen Eizelle 11. So strenge Regulierung von dpERK ist wichtig für die normale Entwicklung der Keimbahn. Die aktive Form von ERK, wie es durch einen Antikörper , der spezifisch an dpERK visualisiert, zeigt eine stereotypisch, dynamisch, bimodalen Muster Lokalisierung: dpERK ist hoch in der Zwischen pachytänen (Zone 1, Abbildung 1), niedrig im Loop - Bereich und wieder hoch in reifen Oozyten (Zone 2, Abbildung 1). Kürzlich fanden wir , dass Ernährung wirkt über die Insulin-like Growth Factor - Rezeptor-1 (daf-2) ERK in Zone 1 12 zu aktivieren; früheren Arbeiten zeigten , dass das Spermium Signal (über die Ephrin - Rezeptor - Tyrosinkinase) ERK in Zone 2 13 aktiviert.

Da die aktiven ERK fungiert als Rheostat in der Keimbahn Oozyte Wachstum zu regulieren, räumliche und zeitliche Lokalisierung sowie Amplitude von dpERK, ist der Schlüssel zum Verständnis seiner normalen Signalisierungs Ergebnis. Das hier beschriebene Verfahren unter Verwendung von Änderungen in derstereotypisch Lokalisierung von dpERK werden kann leicht überwacht und Prognosen über die Auswirkungen der Umwelt- oder genetischen Störungen auf ERK-Aktivität und damit Funktion abgeleitet. Somit ermöglicht das Testen auf dpERK ein umfassendes Verständnis seiner Rolle während der Entwicklung der Keimbahn.

Protocol

Das hier beschriebene Protokoll ist in erster Linie für die wirbellosen Modellsystem C. elegans, und folgt den ethischen Richtlinien her durch die Institution.

1. Tierpflege

  1. Pflegen C. elegans Arbeitsstammkulturen auf Nematode Growth Medium 20,21 (NGM, siehe Materialien Tabelle) Agar mit E. ausgesät coli OP50.
  2. Pflegen Wurm Bestände bei Temperaturen zwischen 16 ° C und 25 ° C.
    HINWEIS: Würmer bei höheren Temperaturen führt zu einer schnelleren Wachstumsrate Anzucht, oft anomale Keimbahnentwicklung und niedriger Brut Größen. Zusätzlich temperaturempfindliche Genotypen werden verschiedene Phänotypen bei verschiedenen Temperaturen anzeigen.
  3. Übertragen Sie Würmer auf neue Platten NGM alle 2 - 3 Tage in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsrate, um eine konstante Versorgung mit gut genährten Würmern zu halten.
    HINWEIS: Bei jedem Experiment mit dpERK Ebenen, Würmer sollten nicht von einem verhungert oder Masse erhalten werdened Platte. Crowding oder Insulin Verhungern Auswirkungen Signalisierung in Würmern 22 und Insulin - Signal regelt ERK 12 Aktivität. So Würmer aus verhungert oder überfüllten Platten werden in variabel und schwer zu reproduzierende führen Färbungsmuster.

2. Dissektion der erwachsenen Würmer Gonaden zur Gewinnung von

  1. Pick - 100-150 WT (N2) oder gewünschten Genotyp von Würmern an der gewünschten und spezifischen Entwicklungsstufe (L1, L2, L3, L4, Erwachsene, etc.) In 100 & mgr; l M9 - Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Füllen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 & mgr; l M9 - Puffer (siehe Materialien Tabelle). Zentrifugiere die Röhrchen bei 1000 · g in einer Mikrozentrifuge für 1 min bei Raumtemperatur.
  3. Sanft 900 ul der M9-Puffer entfernen und entsorgen. Entfernen Sie die Puffer unter einem Präpariermikroskop zu gewährleisten, dass die Würmer nicht versehentlich entfernt werden.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,3 zwei weitere Male mit frischen M9 jedesmal puffern.Dadurch wird sichergestellt, dass alle Bakterien, die wurden mit den Würmern übertragen werden entfernt effektiv gewaschen.
  5. Nach dem letzten Waschen 900 & mgr; l M9-Puffer von dem Rohr und Verwerfen entfernen.
  6. Übertragen Sie die restlichen 100 & mgr; l M9-Puffer, die 100 enthält - 150 Würmer mit einem 200 & mgr; l-Mikropipettenspitze zu einem flachen Boden Glas Uhr Teller. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipettenspitze an der vor der Verwendung Marke 10 & mgr; l geschnitten wird. Nicht schneiden die Spitze in Scherung der Würmer führen.
  7. In 1-3 & mgr; l von 0,1 M Levamisol auf die Glas Uhr Schale die Würmer in M9-Puffer enthält. wirbeln Sie leicht die Levamisol und die M9 sogar zu ermöglichen, Mischen, bis die Würmer bewegen zu stoppen.
    HINWEIS: Levamisol Bestände können bei -20 ° C zur Langzeitlagerung gelagert werden. Hier verwenden die höhere Konzentration von 1 - 3 mM als das, was in der Literatur 23 von 0,2 beschrieben worden - 0,25 mM Levamisol zu erhalten , um einen schnellen Verlust der Mobilität in den Tieren. Wenn die Tiere zu l schinden umOng in der flüssigen Suspension können die resultierenden Muster der dpERK in den Gonaden variabel sein (aufgrund von Stress oder mangelnde Ernährung oder beides). 3 mM Levamisol für die Präparation - reproduzierbarer Färbemustern mit 1 erreicht wurden.
  8. Befestigen Sie zwei 25 G Nadeln auf zwei 1 ml-Spritzen (die Größe der Spritze spielt keine Rolle, die Lehre der Nadel kritisch ist). Positionieren Sie eine Spritze in jeder Hand (Abbildung 2).
  9. Unter einem Binokular, positionieren Sie jede Nadel unter und über jeder Wurm , wie in Abbildung 2 und legen Sie eine Feinschnitt an der Schnecke in der Nähe des zweiten Schlund Glühbirne in einer scherenartigen Bewegung gezeigt. Nach einem Schnitt in der Schnecke auf das nächste Tier zu bewegen, bis alle Tiere in der Schale mindestens einmal geschnitten worden.
    HINWEIS: Denken Sie, dass 2.8 Schritte - 2.9 sind zeitempfindlich. Präparieren Sie alle Würmer in der Schale in weniger als fünf Minuten für eine reproduzierbare dpERK Muster. Längere Dissektion Zeiten wird aus der Signal dpERK in einem Wende führen, vor allem in Zein 1. Stellen Sie die Anzahl der Würmer pro Runde Dissektion (dh 50 Würmer vs. 150) bei Bedarf in der vorgegebenen Zeitrahmen zu bleiben.
    1. Falls ein extrudierter Gonaden ist während der Präparation nicht sichtbar, nicht versuchen, einen anderen Schnitt im gleichen Tier. Normalerweise werden, dass nur das Tier scheren und nicht in der Extrusion der Gonaden führen. Stattdessen gehen Sie zum nächsten Tier auf. Worms, wo die Gonaden nicht extrudieren, werden als solche auf den Folien angezeigt werden, die in Abschnitt gestellt werden 6 und kann während der Bildgebung ignoriert werden
      HINWEIS: Durch all die Dissektion und Verarbeitungsschritte ist es wichtig, im Auge zu behalten, dass die Gonaden an den Körper / Karkasse befestigt bleiben. Sie nicht die Gonaden zwingen und den Körper auseinander mit der Nadel. Oft eine aberrant Riss im Gonadengewebe in einem Versuch, die Gonade von dem Körper zu trennen, können in unechten Antikörper Signal führen. Die Körper / Karkasse während der Abbildungsschritte (Abschnitt 6), und nur die Gonaden abgebildet ignoriert werden. Zusätzlich sometimes die Darmzellen auch als interne Kontrollen / somatische Kontrollen für den Antikörper, der getestet dienen kann.

3. Gonad Fixation

  1. Nachdem die Präparation abgeschlossen ist, fügen Sie 2 ml 3% Paraformaldehyd (PFA) direkt auf das Glas Uhr Schüssel, die die 100 & mgr; l M9 und den sezierten Tiere und Deckel mit Parafilm enthält. Legen Sie die bedeckte Uhrglas in einer chemischen Abzugshaube.
    Achtung: PFA ist eine gefährliche Chemikalie. Somit sollte die Fixierung in der chemischen Laborabzug durchgeführt werden.
  2. 10 min bei RT inkubiert.
  3. Eine Einweg - 9 "Pasteur - Glaspipette 3 ml 1x PBS-T hinzufügen (Werkstoff - Tabelle zu sehen) an das Uhrglas die sezierten Tiere. Mix durch die PFA - Lösung zeichnen und die 1x PBS-T mit den sezierten Tiere in das Pasteur enthält Pipette und sanft zurück in die Uhrglas freigibt. verwirbeln Sie nicht die Rohre während der Wäschen.
  4. Mit Hilfe eines fresh Glas Pasteur Pipette die 5 ml Flüssigkeit (enthaltend seziert Würmer, PFA und 1x PBS-T) aus dem Uhrglas in die Pasteurpipette zu ziehen und den Inhalt in ein frisches 5-ml-Glas konischen Röhrchen übertragen.
  5. Zentrifuge die konischen Röhrchen für 30 sec in einer klinischen Zentrifuge bei 1.000 x g. Verwenden Sie Glas Pasteur Pipetten und konische Röhrchen wie seziert Gonaden halten Sie sich an Kunststoff.
  6. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand darauf zu achten, um nicht die sezierten Tiere zu stören. Entfernen Sie die Flüssigkeit nach jeder Wäsche von der konischen Röhre unter einem Binokular, um nicht die seziert Gonaden zu beeinflussen, und minimieren den Verlust.
  7. Mit einer frischen Pasteurpipette 5 ml 1x PBS-T auf die konische Röhrchen. Zentrifuge die konischen Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge für 30 s bei 1.000 x g. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand darauf zu achten, um nicht die sezierten Tiere zu stören.
  8. Wiederholen Sie Schritt 3.7 für insgesamt dreimal.
  9. Mit einer frischen Pasteurpipette 2 mL 100%Methanol zu den Rohren, und sanft die Gonaden mit dem Methanol mischen, indem sie in der Pasteurpipette aufzustellen. Inkubieren der Röhrchen bei -20 ° C für mindestens 1 h.
    HINWEIS: Dissected Gonaden kann für bis zu 2 Tage für dpERK Färbung in Methanol gelagert werden. Lagerung für länger als 2 Tage und bis zu 2 Wochen ist kompatibel mit anderen Antikörperfärbung von Anwendungen, wie beispielsweise anti-Lamin-Antikörper, aber nicht mit dem Antikörper dpERK.
  10. Nach der gewünschten Inkubationszeit wiederholen Schritt 3.7 für insgesamt drei Mal, um die Gonaden zu waschen. Sie nicht die Rohre während der Wäschen verwirbeln. Nach dem letzten Waschen 500 ul 1x PBS-T in dem konischen Rohr 5 mL verlassen.
  11. Mit einem frischen Pasteur-Pipette, den Inhalt des konischen Glasrohr in eine frische 1-ml-Glasrohr (6 mm x 50 mm) übertragen. Lassen Sie die sezierten Tiere durch Schwerkraft absetzen 5 - 10 min.
  12. Mit einer frischen Pasteurpipette und unter einem Binokular, entfernen Sie so viel von der Wäsche wie möglich aus dem 1 ml Glasröhrchen without Störung der sezierten Gonaden.

4. Sperren und primärer Antikörper-Behandlung

  1. Je 100 & mgr; l 30% normalem Ziegenserum (NGS) , verdünnt in 1x PBS-T (siehe Materialien Tabelle) zu den sezierten Tiere in den 1 - ml - Glasröhrchen. 30% NGS dient als Blockierungspuffer. Decken das Rohr mit Parafilm Verdampfung der Flüssigkeit zu vermeiden. bei RT inkubieren 1 h oder bei 4 ° C über Nacht.
  2. Nach der gewünschten Zeit der Inkubation, entfernen Sie den Blockierungspuffer eine frische Pasteur-Pipette, die Beseitigung so viel Flüssigkeit wie möglich zu verwenden. Verwenden Sie ein Binokular, um sicherzustellen, dass Gonaden sind nicht in der Pasteurpipette erstellt.
  3. Verdünne die MAPKYT Antikörper (siehe Materialien Tabelle, in diesem Verfahren als dpERK bezeichnet) bei 1: 400 in 30% NGS. Bereiten Sie genügend Antikörper Verdünnung zu verwenden, 100 & mgr; l pro Röhrchen. Nicht verwendete, verdünnte Antikörper kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden.
  4. Geben Sie 100 ul der Antikörper anti-dpERK verdünnt, solution auf die 1 Glasröhrchen ml die sezierten Tiere enthalten. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm. Inkubieren der Röhrchen bei 4 ° C über Nacht.
  5. Nach Inkubation über Nacht, fügen 800 ul 1x PBST auf die Röhrchen bei RT.
  6. Zeichnen Sie die Probe in einem frischen Glas Pasteur Pipette auf und lassen Sie sanft, um sicherzustellen, dass die Gonaden gleichmäßig in der 1x PBS-T suspendiert sind. Lassen Sie die Gonaden auf den Boden mit der Schwerkraft absetzen. Entfernen Sie den Überstand. Dies stellt sicher, dass die sezierten Gonaden gewaschen werden, aber nicht während des Verfahrens beschädigt wird.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,6 für insgesamt drei Waschungen. Sie nicht die Rohre während der Wäschen verwirbeln. Nach dem dritten Waschen sicher sein, wie viel Überstand wie möglich zu entfernen und zu entsorgen, ohne die sezierten Tiere zu stören. Stellen Sie sicher, dass eine frische Pasteur-Pipette jedes Mal verwendet wird.

5. Sekundäre Antikörper-Behandlung

  1. Während der primären Antikörper herzustellen wäscht die Verdünnung für den sekundären Antikörper. Verdünnen Sie die Anti-Maus-sedäre Antikörper bei 1: 500 in 30% NGS. Wie bei dem primären Antikörper, verwenden 100 & mgr; l pro Röhrchen. Nicht verwendete Antikörper kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden.
  2. 100 l sekundären Antikörperlösung auf die 1-ml-Glasröhrchen, die sezierten Tiere enthält. Decken Sie jedes Röhrchen mit Parafilm, und dann wickeln die Röhrchen in Aluminiumfolie, um den Inhalt des Rohrs in dunkel halten. Inkubieren der Röhrchen bei RT für 2 h oder alternativ bei 4 ° C über Nacht.
  3. Nach der gewünschten Zeit der Inkubation, fügen 800 ul 1x PBS-T mit den Rohren und wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,6 für insgesamt dreimal. Nach dem letzten Waschen, zu entfernen und so viel von der Überstand wie möglich unter einem Präpariermikroskop mit einem frischen Pasteur pipette verwerfen.
  4. Bereiten Sie die DAPI-Lösung während der Waschungen für den sekundären Antikörper. Verdünnen Sie 1 ul DAPI (von 1,000x Lager von 1 mg / ml bei -20 ° C gelagert) in-1 ml 1x PBST.
  5. Hinzufügen 800 & mgr; l der verdünnten DAPI-Lösung auf die Rohre enthält, dieseziert Tiere. Decken Sie den Mund des Rohrs mit Parafilm und wickeln jedes Röhrchen in Aluminiumfolie. 20 min bei RT inkubiert.
  6. Nach der Inkubation mit DAPI, entfernen, so viel von der DAPI-Lösung wie möglich mit einer frischen Pasteurpipette unter einem Binokular, um nicht die sezierten Tiere zu stören.
  7. 1 Tropfen Lösung auf die Rohre montieren. Wickeln Sie jedes Röhrchen in Aluminiumfolie.
    HINWEIS: Für die Visualisierung dpERK Färbung gefärbt Gonaden sollte sofort für die Mikroskopie montiert werden. Für andere Antikörperanwendungen wie phosphoryliertes Serin 10 Histone H3, Gonaden können in Befestigungsmedium für bis zu 2 Wochen bei 4 ° C im Dunkeln gehalten werden.

6. Montage von Folien und Imaging

  1. Eine Schicht Labor Band der Länge nach , oben, aus zwei Glasobjektträger (25 mm x 75 mm x 1 mm) , wie in Abbildung 3 zu sehen. Legen Sie eine frische , saubere Objektträger aus Glas zwischen den beiden verklebten Folien.
    HINWEIS: Die Dickedes Bandes hilft, eine Agarose-Pad auf dem Mittelschlitten erzeugen. Dicke der Agarose-pad ist fast gleich derjenigen des Bandes, wenn das Band als Abstandshalter dient, um ein Agarose-Pad zu schaffen.
  2. Drop ~ 200 & mgr; l 2% geschmolzener Agarose auf dem Objektträger in der Mitte (in destilliertem Wasser). Schnell legen Sie eine frische, saubere Rutsche, die senkrecht zu und auf der Oberseite, der Agarose.
  3. Lassen Sie die Agarose solidify (1 - 2 min).
  4. Entfernen Sie die obere Objektträger sehr sanft, so dass die Agarose-Pad nicht zerstört wird. Die Agarose-Pad kann entweder an der oberen oder unteren Schlitten befestigt bleiben. Es ist egal, welche gleiten die Agarose-Pad bleibt an, solange es sich um eine glatte Oberfläche von Agarose ist.
  5. Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette die sezierten Tiere auf dem Agarose-Pad übertragen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Folie mit einer Pasteurpipette unter einem Binokular mit.
  6. Mit einem Wimpernhaar oder fein gezeichnet Kapillare, drücken Sie die Gonaden und Darm einArt und Weise voneinander, um die Gonaden aus auf der Folie zu verbreiten.
  7. Decken Sie den Mikroskop-Objektträger mit einem 24 mm x 50 mm Größe Deckglas. Achten Sie darauf, daß die Deckplättchen sanft auf den Objektträger mit minimaler Luftblasen zwischen dem Deckglas ausgebildet ist, und dem Schlitten abgesenkt wird.
  8. Lagerung bei 4 ° C über Nacht in einer Dia-Box (eine undurchsichtige Gleitkastens mit den Folien flach liegen, das Deckglas nach oben) um überschüssige Flüssigkeit zu verdampfen lassen und Gonaden etwas abgeflacht werden (aufgrund des Gewichts des Deckglases auf die Gonaden). Die leichte Abflachung der Gonaden ermöglicht eine bessere Bildgebung eines ansonsten runden Gonaden-Rohr.
    1. Sobald das Deckglas montiert ist, keinen Druck auf die Oberseite des Deckglases mit den Fingern anzuwenden. Häufig führt dies zu Verzerrungen der Gonaden und der Verlust des dpERK Signals.
    2. Flatten die Gonaden über Nacht nur für eine effektivere Bildgebung. Die Objektträger werden bereit betrachtet werden, sobald sie zusammengebaut sind. Um sofort Bilder nehmen, sanft aufnehmendie überschüssige Flüssigkeit zwischen dem Deckglas und dem Objektträger aus den Ecken eines sauberen Labor Gewebe verwendet wird.
  9. Nach der über Nacht Zeit, versiegeln Sie die Folie und das Deckglas mit transparentem Nagellack Deckschicht an den vier Ecken des Deckglases und der Schiebe Grenze. Der Nagellack / Deckdichtung sorgt dafür, dass das Deckglas nicht während Bildgebung bewegt und schützt vor Zerstörung der Proben.
  10. Bild die Gonaden mit einer Verbindung Mikroskop bei 63X. Jedoch ist die Objektivlinse und Mikroskop kann auf der Basis der Verfügbarkeit von Mikroskopen und Benutzeranwendung variiert werden. Da die Größe des gesamten Gonade von der proliferative Bereich zu den Oozyten größer ist als in einem Bild erfasst werden, werden die Bilder als Montage mit überlappenden Grenzen genommen , wie in 4 gezeigt. 11-14, 18.
    1. In vielen Fällen bearbeiten, um die Karkasse nach dem letzten Imaging und Montage, solange keine größeren Veränderungen der Keimbahn-Bild gemacht werden. Speicher ter Rohbilder entlang der zusammengesetzten Bildvergleich der "vor" Montage / Bearbeitung und "nach" Montage / Bearbeitung der Bilder zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die Mikroskopiebilder dürfen nicht für die Signalstärke oder Sättigung bei der Montage der Montage verändert werden.

Representative Results

In WT erwachsenen zwittrigen Tieren wird dpERK typischerweise Mitte pachytänen Region, Zone 1, und in den meisten reifen Eizellen von -1 bis -4 oder -5 (Zone 2) sichtbar gemacht. Störungen in diesem Aktivierungsmuster spiegeln Änderungen an der Signalweg. Weibliche Keimbahnen geben keine Spermien, und somit keine Aktivierung von ERK in Zone anzuzeigen 2, mit nur schwachen Aktivierung in Zone 1. Diese vertreten sind in Abbildung 5.

Abbildung 1
Abbildung 1: C. elegans Keimbahn - Morphologie. Differentielle Interferenzkontrast (DIC) Bild eines erwachsenen Hermaphroditen mit einem U-förmigen gonad Arm mit der weißen Linie umrissen. Der erwachsene zwittrigen Gonaden enthält mitotischen Zellen an der distalen Spitze. Die mitotische Zellen eindringen Meiose und Fortschritt durch meiotische Prophase (pachytänen) die Entwicklung in Mature Eizellen im proximalen Gonaden. Zone 1 und Zone 2 Zeichen stereotypisch Lokalisierung von dpERK bei einem Erwachsenen hermaphroditic Gonaden. Maßstab:. 20 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Demonstration der Nadelpositionen bei Dissektionen . Links: Fotografie einer Dissektion Prozess. Rechts:. Nadelpositionen mit Bezug auf den Wurm Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Demonstration von Agarose Slide Vorbereitung. (A) Legen Sie ein Band lengthwise über 2 sauberen Mikroskop-Objektträger. Legen Sie eine frische, saubere Mikroskop-Objektträger zwischen den beiden Schlitten mit dem Band, wie dargestellt. Die drei Folien sind nebeneinander in Längsrichtung . (B) in Agarose mit dem Schlitten in der Mitte aufgeschmolzen. (C) Legen Sie eine frische Mikroskop - Objektträger senkrecht zu und auf der Oberseite, der Mitte Rutsche, die Tropfen Agarose tragen. ( D) lassen Sie die Agarose zu verfestigen. (E) entfernen Sie die obere Schlitten hinter dem erstarrten Agarose - Pad zu verlassen. Verwenden Sie die untere Folie mit dem Agarose - Pad für die Montage präpariert und gefärbt Keimbahnen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Abbilden der Folien als Montage Montage eines Wildtyp - Keimbahn mit DAPI (t.op) und dpERK (unten) Kanal. Bilder bei 63X genommen mit den Grenzen überlappen, weiße Kästen für Panel A und B und grüne Kästen für Platte B und C. Die DAPI und dpERK Bilder für jede Platte wurden gleichzeitig in zwei verschiedenen Kanälen entnommen. Das zusammengesetzte Bild wird in 5A gezeigt. Maßstabsbalken:. 20 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Dynamische Temporal / Räumliche Aktivierung von ERK. (AC) WT (N2) erwachsenen Keimbahnen (24 Stunden nach Mitte L4 Stadium der Entwicklung) Zwitter gefärbt DNA (B, DAPI, weiß) und dpERK (C, rot). Das dpERK Signal in Zone 1, der pachytänen Region und Zone 2, die reifen Eizellen markiert ist . (DF)Nebel-2 (oz40) weibliche Keimbahnen (bei 8 h Vergangenheit Mitte L4 Entwicklungsstufe) gefärbt DNA (E, DAPI) und dpERK (F). Junge weibliche Keimbahn Anzeige schwach dpERK in Zone 1, und in einer einzigen Eizelle in einer Samen unabhängige Weise. Zone 2 ist Sperma abhängig und somit fehlt in der weiblichen Keimbahn. Maßstabsbalken:. 20 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Aktive ERK (dpERK) folgt eine stereotypisch räumliche und dynamische Lokalisierung Muster in C. elegans Keimbahn. Diese klischee dpERK räumliche Muster (Figur 5), und die Amplitude bei einem erwachsenen C. elegans Gonade, kann wirksam mit den vielen biologischen Prozessen in Beziehung gesetzt werden , die ERK reguliert. Zum Beispiel kann eine Unfähigkeit ERK in Zone 2 führt zu einer Verhaftung in Oozyten in der Prophase der Meiose zu aktivieren, einen Phänotyp in der weiblichen Keimbahnen beobachtet , dass Spermien nicht angeben, und somit nicht aktivieren ERK in reifen Eizellen (Abbildung 5). Paarung mit Männchen führt zu einer wirksamen Anhäufung von dpERK in Zone 2 in den weiblichen Keimbahnen 11,13, verbunden mit Beginn der Eizellreifung und Eisprung. So Analyse von räumlichen Mustern und zeitlichen Aktivierung von dpERK auf bestimmte genetische Störungen (wie RNA-Interferenz-vermittelte Gen-Inaktivierung) oder chemische Behandlungen können für die Identifizierung von Faktoren, die REGUspät ERK-Signal und damit ERK-abhängige biologische Prozesse. Solche Analysen auch Entdeckung neuer genetischer Interaktionen zwischen Signalwege aktivieren.

Ein kritischer Engpass für jede Abbildungsbasierte Analyse ist die Verfügbarkeit von funktionellen Reagenzien, wie Antikörper, die für die Anwendung spezifisch sind. Wenn ein solches Reagens dann leicht für die Analyse von Lokalisierungsmuster für jedes Protein von Interesse angepasst werden kann, oben beschriebenen Verfahren, wie das eine existiert. Die Anwendung ist somit durch die Verfügbarkeit eines funktionierenden Antikörper beschränkt. Darüber hinaus, da das Verfahren Präparation und Färbung bei einer gegebenen Entwicklungszeit beschreibt, ermöglicht es nur die Erfassung von Informationen in einem Zeitrahmen, und nicht Licht in Echtzeit oder die Geschwindigkeit der Proteinumsatzes auf die Dynamik oder Proteinregulierung nicht vergießen.

Das oben beschriebene Verfahren wird von Francis et al angepasst. 23, die aus dem Seydoux und Dunn m verschieden istethode 24 für gonad Extrusion und Antikörper - Färbung. Das Verfahren basiert auf Francis et al. Wird die "Suspensionsverfahren" und das Seydoux und Dunn Methode den "einfrieren Crackverfahren" zum Vergleich genannt aufgerufen werden. Das Suspensionsverfahren hat für den Erhalt reproduzierbarer Lokalisierungsmuster von Signalmolekülen in unseren Händen sehr effektiv wie dpERK, die von Natur aus empfindlicher auf harten Behandlungsbedingungen sind. Im Falle von dpERK Lokalisierung, in unserer Erfahrung ist das Signal in Zone 1 praktisch mit dem gefrierCrackVerfahren nicht nachweisbar. Zusätzlich Probentrocknung, die oft mit dem gefrierCrackVerfahren führt zu störenden Antikörper Signalen auftreten können. Die Suspension Methode minimiert Probentrocknung, da die Gonaden in Flüssigkeit während des gesamten Prozesses suspendiert sind. Wir finden auch, dass die Suspensionsverfahren zur Abbildung mehrerer verschiedener Genotypen auf einer einzelnen Folie geeignet ist. Wenn beispielsweise zwei Genotypen, wie Hermaphroditen vsWeibchen sind direkt verglichen dpERK Lokalisierung werden die beiden Genotypen zusammengemischt und verarbeitet werden können. Dies ist möglich , weil die Phänotypen unterschieden sind und über DAPI Morphologien unterscheiden. Färbung im gleichen Röhrchen, gefolgt von Abbildungs ​​auf derselben Folie ermöglicht den direkten Vergleich zwischen den Gonaden von verschiedenen Genotypen. Alternativ, wenn die DAPI Morphologien nicht unterscheidbar sind, dann ist ein Zweischritt-Antikörperfärbung kann angenommen werden. Zuerst jede einzelne Genotyp mit zwei unterschiedlichen Antikörpern, Antikörper A für WT und Antikörper B für Mutante behandelt wird (beide Antikörper müssen in einem Wirt verschieden von dem dpERK Antikörper gezüchtet werden). Sobald die beiden Genotypen wurden mit dem primären Antikörper gefärbt wurden und gewaschen, können sie zusammen in einem Röhrchen gemischt und nun mit dem dpERK Antikörper, gefolgt von einem sekundären Antikörper-Behandlung zu visualisieren alle Antikörper in dem Röhrchen gefärbt. Eine Fähigkeit, verschiedene Genotypen auf einer einzelnen Folie zu vergleichen, vor allem, wenn deductions von Aktivierungsmustern werden gewährleistet eine präzise Interpretationen vorgenommen und nicht von deutlichen Färbungsbedingungen beeinflusst.

Während vorteilhaft, gibt es mehrere Schritte während des gesamten Suspensionsverfahren, die eine sorgfältige Manipulation erfordern. Es ist entscheidend, dass die Dissektion in einer zeiteffizienten Weise erfolgen; wichtiger ist, sollten die Dissektionen nicht mehr als 5 Minuten dauern. Längere Dissektion Zeiten führen zu variablen dpERK Signal, das als geregelte Änderungen in ERK-Aktivierung werden oft falsch interpretiert und nicht als technische Ausfälle. Es ist wichtig, mit mehr als 100 zu beginnen - 150 Tiere für jede Sektion, weil in den verschiedenen Waschschritte die Gonaden leicht aus den Rohren aufgrund Pipettierfehler verloren gehen kann. Der Verlust der Gonaden reduziert werden kann entweder durch in mehreren kleinen Chargen (wie drei Chargen von 50 Tieren je) seziert, die kombiniert werden können, oder durch einen großen Stapel von 150 Sezieren Eine weitere Herausforderung besteht darin, die Gonaden in einem gut voneinander zu liegen Bildungauf der Folie, so dass der gesamte distale kann Gonade abgebildet werden. Um dies zu ermöglichen, mit der Wimper auf einem Zündholz oder einem gezogenen Pipette Raum aus den Gonaden verwenden. Allerdings sollte darauf geachtet werden, um nicht die Gonaden während dieses Prozesses zu beschädigen. Oft mit diesen Techniken dauert es mehrere Versuche, die Dissektionen sowie Anordnungen der Gonaden auf die Objektträger zu meistern.

Sobald diese Technik beherrscht wurde, dient es als eine leistungsfähige Methode für vielfältige biologische Analysen und verwendet werden können, mehr als nur dpERK Ebenen zu studieren. Zum Beispiel kann dieses Verfahren verwendet werden, um aktive p38-Spiegel oder aktiven CDK Ebenen visualisieren, oder jedes Protein, für das ein Antikörper-Reagenz vorhanden ist. Zusätzlich kann das Verfahren mit einem chemischen Hemmung Bildschirm in ganzen Tieren zu Assay für neue Inhibitoren oder Aktivatoren des Weges gekoppelt sein, über das Testen auf dpERK Ebenen. Dies wird für eine in vivo Auslesung beider Reaktions und Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren beliebigen ermöglichen , die int kanneract mit der RTK-RAS-ERK-Signalwegs. Darüber hinaus kann dieses Verfahren in Antikörper-Kombinationen mit mehreren Signalausgänge verwendet werden, die alle verwendet werden und zu einer Zeit sichtbar gemacht werden kann. multiple Antikörper unter Verwendung ermöglicht Korrelation zwischen mehreren Pfaden, deren Aktivierungszustand und über die Ergebnisse alle in dem gleichen Gewebe, ein besseres Verständnis dieser Wechselwirkungen ermöglicht. Dies sind nur einige Beispiele für weitere Anwendungen dieses Verfahrens, aber dieses System kann modifiziert werden, um mehrere Forschungsinteressen zu studieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Inc. A9539 Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution
Flat bottom glass watch dish Agar Scientific AGL4161 We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles BD PrecisionGlide 305122
Syringes (could be 1 or 5 mL) BD Syringes 1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisherbrand 12-550-343
Coverslips (24 x 50 mm) Corning 2935-245
5 mL glass conical tube Corning 8060-5
9" disposable Pasteur pipette Fisherbrand 13-678-20D
Clinical bench top centrifuge
Glass  tubes (6 x 50 mm) Fisherbrand 14-958-A
*M9 solution
Levamisole Sigma L9756
3% Paraformaldehyde (PFA) Electron microscopy services 17500 Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer
1x PBS-T 1x PBS with 0.1% Tween 20
Methanol Electron microscopy services 18510
Normal goat serum (NGS) Cell Signaling 5425 Diluted to 30% in 1x PBS-T
MAPKYT (dpERK) antibody  Sigma Inc. M9692 Dilution 1:400 in 30% NGS
Secondary antibody Invitrogen A-11005 Dilution 1:500 in 30% NGS
DAPI Sigma D9542
Vectashield Vector Labs H-1000
*M9 Buffer Recipe 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. 
**PBS (1x) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L
Nematode Growth Medium (NGM) 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4

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References

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Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline
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Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).More

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).

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