Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Rumlig og tidsmæssig analyse af Active ERK i Published: November 29, 2016 doi: 10.3791/54901
Automatic Translation
1, 1,2
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center

Summary

Vi præsenterer en immunfluorescens imaging-metode til rumlig og tidsmæssig lokalisering af aktiv ERK i dissekeret C. elegans gonade. Den her beskrevne protokol kan tilpasses til visualisering af enhver signal- eller strukturelle protein i C. elegans gonade, forudsat en egnet antistofreagens er tilgængelig.

Abstract

Den evolutionært bevaret ekstracellulære signal transducerende RTK-RAS-ERK-vejen er et vigtigt kinase-signaleringskaskade, der styrer flere cellulære og udviklingsmæssige processer hovedsagelig via aktivering af ERK, den terminale kinase af vejen. Tight regulering af ERK aktivitet er afgørende for en normal udvikling og homeostase; overdrevent aktive ERK resultater i overdreven cellulær proliferation, mens underaktiv ERK forårsager celledød. C. elegans er en kraftfuld model, der har været med til at karakterisere funktionen og reguleringen af RTK-RAS-ERK signalvejen under udvikling. Især RTK-RAS-ERK-vejen er afgørende for C. elegans germlinie udvikling, som er i fokus for denne fremgangsmåde. anvendelse af antistoffer specifikke for den aktive, diphosphorylated form af ERK (dpERK), den stereotype lokalisering mønster kan visualiseres i kimcellelinje. Fordi dette mønster er både rumligt og tidsligt Controlled, evnen til på reproducerbar analyse dpERK er nyttigt at identificere regulatorer af vejen, som påvirker dpERK signal varighed og amplitude og dermed kimcellelinje udvikling. Her demonstrerer vi, hvordan man med succes dissekere, bejdse, og image dpERK i C. elegans gonade. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til rumlig lokalisering af enhver signal- eller strukturelle protein i C. elegans gonade, forudsat et antistof kompatibel med immunofluorescens er tilgængelig.

Introduction

Den receptortyrosinkinase (RTK) -rotte sarkom (RAS) -Extracellular signal kinase (ERK) pathway relæer ekstracellulære signaler gennem en konserveret kinase kaskade, der resulterer i phosphorylering og aktivering af ERK 1-3. ERK-proteinerne er medlemmer af det konserverede prolin-serin / threonin-MAP (mitogenaktiveret protein) kinase familien, og påvirkes direkte af MEK via dobbelt phosphorylering på threonin (T) og tyrosin (Y) i det konserverede TEY motiv. Aktiv ERK (benævnt diphosphorylated ERK, eller dpERK) regulerer derefter mange cellulære og udviklingsprocesser gennem sin fosforylering af et batteri af downstream substrater 1-3. Således unormal ERK aktivitet fører til mange celle og udviklingsmæssige defekter 4-7.

Stringent regulering af ERK-aktivitet er kritisk for normal udvikling: i mammale systemer for meget ERK aktivitet fører til overdreven cellulær proliferation førendetil onkogen vækst; for lidt aktivitet fører til celledød 4,6. Derudover kan ændringer i varigheden af ERK aktivitet også føre til forskellige resultater: i PC12-celler, ERK-aktivering i 30 minutter eller mindre inducerer celleproliferation, men ERK-aktivering i 60 minutter eller mere inducerer neuronal differentiering 8,9. Tight regulering af ERK aktivitet er således klart afgørende for en normal udvikling og homeostase.

C. elegans er en kraftfuld, og genetisk formbart model system til at dissekere funktion og regulering af RTK-RAS-ERK signalvej 3,10-15. I forhold til mammale systemer, der indeholder multiple gener for RAS og ERK, C. elegans indeholder en RAS genet (lad-60) og en ERK gen (mpk - 1), hvilket gør det til et genetisk mere facile system, hvor at dissekere funktionen af denne vej 3,10-14. C. elegans germlinie det væsentlige et rør, der består af mitotiskestamceller ved sin distale ende og modne oocytter ved sin proximale ende (figur 1) 16. Kimceller initiere meiose lige proximalt til den distale mitotisk zone og fremskridt gennem en udvidet meiotiske profase (pachytene), hvorefter de begynder at danne oocytter i loop-regionen, endelig undergår oocytmodning i det proximale område 16.

Genetiske undersøgelser fra flere laboratorier, herunder vores egen, har vist, at RTK-RAS-ERK vej er afgørende for germlinie udvikling i C. elegans 12,13,15,17-19. Specifikt fandt vi, at ERK kontrol og koordinerer mindst ni forskellige biologiske processer under germlinie udvikling, lige fra udviklingsmæssige omskiftere såsom kimcelle apoptose til celle biologiske processer såsom oocyt vækst 11,18. Meget gerne i mammale systemer, for meget ERK aktivitet i C. elegans germlinie resulterer i produktion af flere små oocytter, mens for little aktivitet medfører en stor oocyt 11. Således stram regulering af dpERK er afgørende for normal germlinie udvikling. Den aktive form af ERK, som visualiseret ved et antistof specifikt til dpERK, viser en stereotyp, dynamisk, bimodal lokalisering mønster: dpERK er høj i midten pachytene (Zone 1, figur 1), lav i løkkeregionen og høj igen i modne oocytter (Zone 2, figur 1). For nylig fandt vi, at ernæring virker gennem Insulin-lignende vækstfaktor-receptor-1 (daf-2) for at aktivere ERK i zone 1 12; tidligere arbejde viste, at sæd signal (via Ephrin receptortyrosinkinase) aktiverer ERK i zone 2 13.

Eftersom aktive ERK fungerer som en rheostat i kimcellelinje at regulere oocyt vækst, rumlig og tidsmæssig lokalisering samt amplituden af ​​dpERK, er nøglen til at forstå dens normale signalering resultat. Brug den her beskrevne fremgangsmåde, ændringer istereotype lokalisering af dpERK kan nemt overvåges og forudsigelser udledt om virkningen af ​​de miljømæssige eller genetiske forstyrrelser på ERK aktivitet og dermed funktion. Således analyse for dpERK giver en omfattende forståelse af sin rolle under kimcellelinje udvikling.

Protocol

Protokollen beskrevet her er primært til hvirvelløse modelsystemet C. elegans, og følger alle de etiske retningslinjer, der er fastsat af institutionen.

1. Animalske Vedligeholdelse

  1. Vedligehold C. elegans arbejder stamkulturer på nematodevækst Medium 20,21 (NGM, se Materialer tabel) agar podet med E. coli OP50.
  2. Oprethold ormen lagre ved temperaturer mellem 16 ° C og 25 ° C.
    BEMÆRK: Dyrkning orme ved højere temperaturer resulterer i hurtigere vækst, ofte afvigende germlinie udvikling og lavere yngel størrelser. Derudover vil temperaturfølsomme genotyper vise forskellige fænotyper ved forskellige temperaturer.
  3. Overførsel orme til nye NGM plader hver 2 - 3 dage afhængig af deres vækstrate for således at opretholde en konstant forsyning af velnærede orme.
    BEMÆRK: For et givet eksperiment involverer dpERK niveauer, må IKKE indhentes orme fra en udsultet eller menneskemængdeed plade. Fortrængning eller sult virkninger insulin signalering i orme 22, og insulin signalering regulerer ERK 12 aktivitet. Således orme fra Starved eller overfyldte plader vil resultere i variable og vanskelige at reproducere farvede mønstre.

2. Dissektion af voksne orme for Indhentning Gonader

  1. Pick 100 - 150 WT (N2) eller ønsket genotype af orme på det ønskede og specifikke udviklingstrin (L1, L2, L3, L4, voksen, osv.) I 100 pi M9 buffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Fyld mikrocentrifugerør med 900 pi af M9-puffer (se Materialer tabel). Centrifuger rørene ved 1000 x g i en mikrocentrifuge i 1 minut ved stuetemperatur.
  3. Fjern forsigtigt 900 uL af M9 buffer og kassér. Fjern bufferen under et dissektionsmikroskop for at sikre, at ormene ikke et uheld fjernes.
  4. Gentag trin 2.2 - 2.3 to gange mere med frisk M9 buffer hver gang.Dette sikrer, at eventuelle bakterier, der blev fremført med ormene effektivt vaskes væk.
  5. Efter den sidste vask fjernes 900 pi af M9 buffer fra røret og kasseres.
  6. Overfør den resterende 100 pi M9 buffer indeholdende de 100 - 150 orme med en 200 pi-mikropipettespids til en fladbundet glas watch skålen. Sørg for, at mikropipettespidsen skæres ved 10 uL mærke den før brug. Ikke skære spidsen vil resultere i forskydning af orme.
  7. Tilsæt 1 - 3 pi 0,1 M levamisol til glasset watch skål indeholdende orme i M9-puffer. hvirvle forsigtigt levamisol og M9 at aktivere selv blanding indtil ormene op med at bevæge.
    BEMÆRK: levamisol lagre kan opbevares ved -20 ° C til langsigtet opbevaring. Her, brug den højere koncentration på 1 - 3 mM, end hvad der er blevet beskrevet i litteraturen 23 på 0,2 - 0,25mM af levamisol for at opnå hurtige tab af mobilitet i dyrene. Hvis dyrene flå rundt alt for long i den flydende suspension, kan de resulterende mønstre af dpERK i kønskirtlerne være variabel (på grund af stress eller mangel på ernæring eller begge). Mere reproducerbare farvningsmønstre er nået til 1 - 3 mM levamisol til dissektion.
  8. Fastgør to 25 G kanyler til to 1 ml sprøjter (størrelsen af ​​sprøjten er ligegyldigt, måleren af ​​nålen er kritisk). Placer en sprøjte i hver hånd (figur 2).
  9. Under et dissektionsmikroskop, placere hver nål under og over hver orm, som vist i figur 2 og placere en fin snit på orm nær den anden svælg pære i en saks-lignende bevægelse. Efter et snit i ormen gå videre til det næste dyr, indtil alle dyrene i skålen er blevet skåret mindst én gang.
    BEMÆRK: Vær opmærksom at trin 2,8-2,9 er tidsfølsomme. Dissekere alle orme i fadet på under fem min for en reproducerbar dpERK mønster. Længere dissektion gange vil resultere i en drejning væk fra dpERK signal, især i Zen 1. Juster antallet af orme pr runde af dissektion (dvs. 50 orme vs. 150) om nødvendigt at bo i den tildelte tidsramme.
    1. Hvis en ekstruderet gonadedosis ikke er synlig under dissektion, må du ikke forsøge en anden nedskæring i det samme dyr. Normalt det vil kun forskyde dyret og ikke medføre ekstrudering af gonaderne. I stedet gå videre til det næste dyr. Worms hvor gonaderne ikke ekstrudere vil blive vist som sådan på de dias, der vil blive foretaget i afsnit 6, og kan ignoreres under billedbehandling
      BEMÆRK: Gennem alle de dissektion og procestrin, er det vigtigt at huske på, at gonade vil forblive fastgjort til kroppen / slagtekroppen. Tving ikke gonade og kroppen fra hinanden med nålen. Ofte gange en afvigende tåre i gonadal væv i et forsøg på at adskille gonaderne fra kroppen kan resultere i falsk antistof signal. Kroppen / slagtekroppen kan ignoreres under de billeddannende trin (afsnit 6), og kun den gonade afbildet. Derudover whichetimes tarmcellerne kan også tjene som interne kontroller / somatiske kontrol for antistof, der analyseres.

3. gonade Fiksering

  1. Efter dissektion er færdig, tilsættes 2 ml 3% paraformaldehyd (PFA) direkte til glasset watch skål indeholdende 100 pi M9 og dissekerede dyr og dække med Parafilm. Placer dækket ur glasskål i et stinkskab.
    Advarsel: PFA er et farligt kemikalie. Således bør fiksering udføres i stinkskab.
  2. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
  3. Ved hjælp af en engangs 9 "glas Pasteur-pipette tilsættes 3 ml 1X PBS-T (se Materialer tabel) til urglasset skål indeholdende de dissekerede dyr. Blandes ved at trække PFA opløsning og 1 x PBS-T med de dissekerede dyr til Pasteur pipette og frigive blidt tilbage i uret glas fad. Undlad at slynge rørene under vaskene.
  4. Ved hjælp af en fresh glas Pasteur pipette trække 5 ml væske (indeholdende dissekerede orme, PFA og 1x PBS-T) fra uret glasskål i Pasteur-pipette og overføre indholdet i en frisk 5 ml glas konisk rør.
  5. Centrifuger koniske rør til 30 sek i en klinisk centrifuge ved 1000 x g. Brug glas Pasteur-pipetter og koniske rør som dissekerede kønskirtler holde sig til plast.
  6. Fjern og kassér supernatanten tage sig for ikke at forstyrre de dissekerede dyr. Fjern væsken efter hver vask fra den koniske rør under et dissektionsmikroskop for ikke at påvirke de dissekerede gonaderne, og minimere deres tab.
  7. Ved hjælp af en frisk Pasteur-pipette, tilsættes 5 ml 1x PBS-T til de koniske rør. Centrifuger koniske rør i en klinisk centrifuge i 30 s ved 1000 x g. Fjern og kassér supernatanten tage sig for ikke at forstyrre de dissekerede dyr.
  8. Gentag trin 3.7 i i alt tre gange.
  9. Ved hjælp af en frisk Pasteur-pipette, tilsættes 2 ml 100%methanol til rørene, og bland forsigtigt gonaderne med methanol ved at trække op i Pasteur-pipette. Inkubér røret ved -20 ° C i mindst 1 time.
    BEMÆRK: dissekerede gonader kan opbevares i methanol i op til 2 dage for dpERK farvning. Opbevaring i mere end 2 dage og op til 2 uger er kompatibel med andre antistof farvning applikationer, såsom anti-Lamin-antistof, men ikke med det dpERK antistof.
  10. Efter at den ønskede inkubationstid, gentag trin 3.7 i i alt tre gange for at vaske gonaderne. Undlad at slynge rørene under vaskene. Efter den sidste vask forlade 500 pi 1x PBS-T i 5 ml konisk rør.
  11. Ved hjælp af en frisk Pasteur pipette overføre indholdet af den koniske glasrør i en frisk 1 ml glasrør (6 mm x 50 mm). Lad dissekerede dyr at bosætte ved hjælp af tyngdekraften i 5 - 10 min.
  12. Ved hjælp af en frisk Pasteur pipette og under et dissektionsmikroskop, fjerne så meget af vask som muligt fra 1 ml glasrør witHout forstyrre dissekerede kønskirtlerne.

4. Blokering og Primary Antibody Behandling

  1. Tilsæt 100 pi 30% normalt gedeserum (NGS) fortyndet i 1 x PBS-T (se Materialer tabel) til de dissekerede dyr i 1 ml glasrør. 30% NGS tjener som den blokerende buffer. Dæk rør med Parafilm at undgå fordampning af væsken. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time eller ved 4 ° C natten over.
  2. Efter at den ønskede inkubationstid, fjerne blokerende buffer under anvendelse af en frisk Pasteur pipette, fjerne så meget væske som muligt. Brug en dissektionsmikroskop at sikre, at gonaderne ikke er udarbejdet i Pasteur-pipette.
  3. Fortyndes MAPKYT antistof (se Materialer tabel, der henvises til i denne metode som dpERK) ved 1: 400 i 30% NGS. Forbered nok antistof fortynding til at bruge 100 uL pr rør. Ubrugt, fortyndet antistof kan opbevares ved 4 ° C i en uge.
  4. Tilsæt 100 pi af fortyndet anti-dpERK antistof såurening til 1 ml-glasrør indeholdende de dissekerede dyr. Forsegl rør med Parafilm. Inkuber rørene ved 4 ° C natten over.
  5. Efter inkubation natten over, tilsættes 800 pi af 1x PBST til rørene ved stuetemperatur.
  6. Trække prøven op i en frisk glas Pasteur-pipette og slip forsigtigt for at sikre, at gonaderne jævnt suspenderes i 1 x PBS-T. Lad gonaderne sedimentere til bunden med tyngdekraften. Fjern supernatanten. Dette sikrer, at dissekerede gonaderne vaskes men ikke beskadiget ved processen.
  7. Gentag trin 4,5 - 4,6 i alt tre vaske. Undlad at slynge rørene under vaskene. Efter den tredje vask skal du fjerne og kassere så meget supernatant som muligt uden at forstyrre dissekerede dyr. Sikre, at en frisk Pasteur-pipette anvendes hver gang.

5. sekundært antistof Behandling

  1. Under det primære antistof vasker forberede fortyndingen til det sekundære antistof. Fortynd anti-muse secondary antistof ved 1: 500 i 30% NGS. Som med det primære antistof, bruge 100 pi pr rør. Ubrugt antistof kan opbevares ved 4 ° C i en uge.
  2. Tilsæt 100 pi sekundært antistof opløsning til 1 ml-glasrør indeholdende de dissekerede dyr. Dæk hvert rør med Parafilm, og derefter wrap rørene i aluminiumfolie for at holde indholdet af reagensglasset i mørke. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 2 timer, eller alternativt ved 4 ° C natten over.
  3. Efter at den ønskede inkubationstid, tilsættes 800 pi af 1 x PBS-T til rørene og gentag trin 4,5 - 4,6 i alt tre gange. Efter den sidste vask, fjerne og bortskaffe så meget af supernatanten som muligt under et dissektionsmikroskop under anvendelse af en frisk Pasteur pipette.
  4. Forbered DAPI løsning under de vasker i det sekundære antistof. Fortynd 1 pi DAPI (fra en 1.000 x lager på 1 mg / ml opbevaret ved -20 ° C) in- 1 ml 1x PBST.
  5. Tilføj 800 pi af den fortyndede DAPI løsning til rørene indeholdendedissekerede dyr. Dæk mundingen af ​​røret med Parafilm, og wrap hvert rør i aluminiumfolie. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.
  6. Efter inkubationen med DAPI, fjerne så meget af DAPI-opløsning som muligt med en frisk Pasteur pipette under et dissektionsmikroskop for ikke at forstyrre de dissekerede dyr.
  7. Tilsættes 1 dråbe montering opløsning til rørene. Pak hvert rør i alufolie.
    BEMÆRK: visualisere dpERK farvning, bør farvede kønskirtler monteres til mikroskopi samme. For andre antistof applikationer såsom phosphoryleret serin 10 Histone H3, kan gonader holdes ved montering medier i op til 2 uger ved 4 ° C i mørke.

6. Montering Slides og Imaging

  1. Læg et lag af lab tape længderetningen, oven, af to mikroskopobjektglas (25 mm x 75 mm x 1 mm), som ses i figur 3. Placer en frisk og ren objektglas i mellem de to tapede objektglas.
    BEMÆRK: Tykkelsenaf båndet hjælper generere en agarose pad på den midterste slide. Tykkelse af agarose puden er næsten lig med den for båndet, som båndet fungerer som et afstandsstykke for at skabe den agarose pad.
  2. Drop ~ 200 pi smeltet 2% agarose (fremstillet i destilleret vand) på mikroskopobjektglasset i midten. Hurtigt placere en frisk ren dias, vinkelret på og på toppen, på agarose.
  3. Lad agarose størkne (1 - 2 min).
  4. Fjern det øverste mikroskopobjektglas meget forsigtigt, således at agarose puden ikke ødelægges. Den agarose pad kan forblive enten til toppen eller bunden dias. Det er ligegyldigt hvilken skubbe agarose puden forbliver fastgjort til, så længe det er en glat overflade af agarose.
  5. Ved hjælp af en Pasteur-pipette overføre dissekerede dyr på agarose pad. Fjern overskydende væske fra slide ved hjælp af en Pasteur-pipette under et dissektionsmikroskop.
  6. Brug en øjenvippe hår eller fint trukket kapillarrør, skubbe gonaderne og tarme enmåde fra hinanden for at sprede gonaderne ud på objektglasset.
  7. Dæk mikroskopobjektglasset med en 24 mm x 50 mm størrelse dækglas. Sørg for, at dækglasset sænkes forsigtigt på objektglasset med at blive dannet minimale luftbobler mellem dækglasset og objektglasset.
  8. Opbevares ved 4 ° C natten over i et dias boks (en uigennemsigtig slide boks med dias ligger fladt, dækglas op) for at tillade overskydende væske til at fordampe og kønskirtler bliver noget fladtrykt (som følge af vægten af ​​dækglasset på kønskirtlerne). Den lille udfladning af gonaderne giver mulighed for bedre billeddannelse af en ellers runde gonadal rør.
    1. Når dækglasset er monteret, ikke at påføre tryk på toppen af ​​dækglasset med fingrene. Ofte resulterer dette i forvridning af gonader og tab af dpERK signalet.
    2. Glat gonaderne natten kun for mere effektiv billeddannelse. Dias er klar til visning, så snart de er samlet. At tage billeder med det samme, forsigtigt absorbereden overskydende væske mellem dækglasset og dias fra hjørnerne ved hjælp af en ren lab væv.
  9. Efter natten periode, forsegle dias og dækglasset med gennemsigtig neglelak topcoat på de fire hjørner af dækglasset og slide grænsen. Den neglelak / dækglas tætning sikrer, at dækglasset ikke bevæger sig, mens billedbehandling og beskytter mod ødelæggelse af prøverne.
  10. Billede gonaderne med et sammensat mikroskop ved 63X. Men objektivlinsen og mikroskop kan varieres baseret på tilgængeligheden af ​​mikroskoper og brugerens anvendelse. Fordi størrelsen af hele gonaden fra den proliferative region til oocytterne er større, end der kan indfanges i ét billede, vises billederne tages som en montage med overlappende grænser som vist i figur 4. 11-14, 18.
    1. I mange tilfælde, redigere slagtekroppen efter den endelige billedbehandling og montage, så længe der ikke større ændringer er lavet til kimcellelinje billede. Store than rå billeder langs den samlede billede for at muliggøre sammenligning af 'før' montering / redigering og "efter" samling / redigering af billederne.
      BEMÆRK: De mikroskopi billeder må ikke ændres for signalstyrke eller mætning under samlingen af ​​montagen.

Representative Results

I WT voksne tvekønnede dyr, er dpERK typisk visualiseres i midten pachytene region, Zone 1, og i de mest modne oocytter fra -1 til -4 eller -5 (zone 2). Forstyrrelser i denne aktivering mønster afspejler ændringer i signalvejen. Kvindelige kønsceller ikke angiver sperm, og derfor ikke vise aktivering af ERK i zone 2, med kun svag aktivering i Zone 1. Disse er repræsenteret i figur 5.

figur 1
Figur 1: C. elegans germlinie Morfologi. Differential Interference kontrast (DIC) billede af en voksen hermafrodit med én U-formet gonadedosis arm skitseret med den hvide linje. Den voksne hermafroditiske gonadedosis indeholder mitotiske celler ved den distale spids. De mitotiske celler ind meiose og fremskridt gennem meiotisk profase (pachytene) udvikle sig til Mature oocytter i den proximale gonade. Zone 1 og Zone 2 mark stereotype lokalisering af dpERK i en voksen tvekønnede gonade. Scale:. 20 pm Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Demonstration af Needle positioner under dissektioner Venstre:. Fotografi af en dissektion i processen. Til højre:. Needle positioner med reference til ormen Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Demonstration af agarose Slide Forberedelse. (A) Placer et bånd lengthwise på 2 rene objektglas. Placer en frisk og ren mikroskopobjektglas mellem de to dias med båndet som vist. De tre dias er ved siden af hinanden på langs. (B) Tilføj smeltet agarose til dias i midten. (C) Placer en frisk objektglas vinkelret på, og på toppen af den midterste dias, bærer dråbe agarose. ( D) Lad agarose at størkne. (E) Fjern det øverste lysbillede efterlader det størknede agarose pad. Brug den nederste slide med agarose pad til montering dissekeret og farvede kønsceller. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Billedbehandling af Slides som Montage Montage af en vildtype germline med DAPI (t.op) og dpERK (nederst) kanal. Billeder taget på 63X med overlappende grænser blev hvide kasser til panel A og B og grønne bokse til panel B og C. DAPI og dpERK billeder til hvert panel taget samtidigt i to forskellige kanaler. Den samlede billede er vist i figur 5A. Målestok:. 20 pm Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Dynamisk Temporal / Spatial Aktivering af ERK. (AC) WT (N2) voksen (24 timer tidligere mid-L4 udviklingstrin) hermafroditiske kønsceller farvet for DNA (B, DAPI, hvid) og dpERK (C, rød). Den dpERK signal i zone 1, den pachytene region, og zone 2, de modne oocytter er fremhævet. (DF)tåge-2 (oz40) kvindelige kønsceller (ved 8 h forbi midten L4 fase af udvikling) farvet for DNA (E, DAPI) og dpERK (F). Unge kvindelige kønsceller vise svag dpERK i zone 1, og på én ægcelle i en sædcelle uafhængig måde. Zone 2 er sperm afhængig, og dermed fraværende i den kvindelige kimcellelinje. Målestok:. 20 pm Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Aktiv ERK (dpERK) følger en stereotyp rumlige og dynamisk lokalisering mønster i C. elegans germlinie. Denne stereotype dpERK rumligt mønster (figur 5), og amplitude i en voksen C. elegans gonade, effektivt kan korreleres med mange biologiske processer, ERK regulerer. For eksempel, at en manglende evne aktivere ERK i zone 2 resultater i en anholdelse i oocytter i profasen af meiose, en fænotype observeret i kvindelige kønsceller, som ikke angiver sperm, og derfor ikke aktiverer ERK i modne oocytter (figur 5). Parring med hanner resultater i effektiv akkumulation af dpERK i zone 2 i de kvindelige kønsceller 11,13, kombineret med debut af oocyt modning og ægløsning. Således analyse af rumlige mønstre og tidsmæssig aktivering af dpERK på visse genetiske forstyrrelser (såsom RNA-interferens medieret gen inaktivering) eller kemiske behandlinger giver mulighed for identifikation af faktorer, forordsen ERK-signalering og dermed ERK-afhængige biologiske processer. Sådanne analyser også muliggøre opdagelsen af ​​nye genetiske interaktioner mellem signalveje.

En kritisk flaskehals for enhver billeddannelse baseret analyse er tilgængeligheden af ​​funktionelle reagenser, såsom antistoffer, der er specifikke for anvendelsen. Hvis en sådan reagens eksisterer derefter metoder som den ovenfor beskrevne kan let tilpasses til analyse af lokalisering mønster for ethvert protein af interesse. Ansøgningen er således begrænset af tilgængeligheden af ​​en fungerende antistof. Desuden, fordi den metode beskriver dissektion og farvning på et givet udviklingsmæssige tid, det kun muliggør registrering af oplysninger på ét tidsramme, og ikke kaste lys over dynamikken eller protein regulering i realtid eller sats af protein omsætning.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde er tilpasset fra Francis et al. 23, som er forskellig fra Seydoux og Dunn metode 24 for gonadedosis ekstrudering og antistoffarvning. Metoden er baseret på Francis et al., Vil blive kaldt "suspension metoden", og Seydoux og Dunn metode kaldet "fryse revner metode" til sammenligning. Suspensionen metode har været meget effektive i vores hænder for at opnå reproducerbare lokalisering mønstre af signalmolekyler som dpERK, der i sagens natur er mere følsomme over for barske håndteringsforhold. I tilfælde af dpERK lokalisering, i vores erfaring, at signalet i zone 1 er næsten ikke målbart med fryse krakning metode. Derudover prøve tørring, som ofte kan forekomme med fastfrysningen krakning fremgangsmåde, resulterer i falske antistof-signaler. Suspensionen metode minimerer prøve tørring, eftersom gonaderne suspenderes i flydende under hele processen. Vi konstaterer også, at suspensionen er nyttig til billeddannelse af flere forskellige genotyper på en enkelt objektglas. For eksempel, hvis to genotyper, såsom hermafroditter vshunner er der direkte sammenlignes for dpERK lokalisering, de to genotyper kan blandes sammen og behandles. Dette er muligt, fordi de fænotyper er forskellige og kan skelnes via DAPI morfologier. Farvning i det samme rør efterfulgt af billeddannelse på samme glas giver mulighed for direkte sammenligning mellem gonaderne fra forskellige genotyper. Alternativt, hvis DAPI morfologier ikke skelnes, så en to-trins antistof farvning kan vedtages. Først hver enkelt genotype behandles med to forskellige antistoffer, antistof A for WT og antistof B for mutant (begge antistoffer skal rejses i en vært adskilt fra dpERK antistof). Når de to genotyper er farvet med det primære antistof, og vasket, kan de blandes sammen i et rør og nu farvet med dpERK antistof, efterfulgt af et sekundært antistof behandling for at visualisere alle antistofferne i røret. En evne til at sammenligne forskellige genotyper på en enkelt objektglas, især når deductions af aktiveringsmønstre der gøres sikrer præcise fortolkninger ikke er påvirket af forskellige farvning betingelser.

Mens fordelagtigt, der er flere trin i hele suspensionen metode, der kræver omhyggelig manipulation. Det er afgørende, at de dissektioner opstå i en tid effektiv måde; vigtigere, bør dissektioner ikke overtage 5 min. Længere dissektion gange resulterer i variabel dpERK signal, som ofte kan misfortolkes som regulerede ændringer i ERK aktivering, og ikke som tekniske fejl. Det er afgørende at starte med over 100-150 dyr i hver dissektion fordi hele forskellige vask trin gonaderne kan nemt tabt fra rørene på grund af pipetteringsfejl. Tab af gonader kan reduceres enten ved at dissekere i multiple små partier (såsom tre partier af 50 dyr hver), der kan kombineres, eller ved at dissekere en stort parti af 150. En anden udfordring er at få gonaderne til at ligge i et godt fordelte dannelsepå objektglasset, således at hele distale gonadedosis kan afbildes. For at aktivere dette, skal du bruge en øjenvippe på en tændstik eller en trukket pipette til rummet ud gonaderne. Imidlertid bør man være omhyggelig for ikke at beskadige gonaderne under denne proces. Ofte med disse teknikker, det tager flere forsøg på at mestre de dissektioner samt arrangementer af gonaderne onto dias.

Når denne teknik er styr på den, det tjener som en kraftfuld fremgangsmåde til varieret biologiske analyser, og kan bruges til at studere mere end bare dpERK niveauer. For eksempel denne metode kan anvendes til at visualisere aktive p38-niveauer, eller aktive CDK niveauer, eller helst protein, for hvilket der findes et antistof reagens. Derudover kan fremgangsmåden være koblet med en kemisk hæmning skærm i hele dyr til analyse for hidtil ukendte inhibitorer eller aktivatorer af vejen, via analysere for dpERK niveauer. Dette vil muliggøre en in vivo udlæsning af både reaktion og følsomhed over for eventuelle inhibitorer, som kan interact med RTK-RAS-ERK signalvej. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes i antistof kombinationer med flere signaludgange, som alle kan anvendes og visualiseres på én gang. Brug af flere antistoffer tillader korrelation mellem flere veje, deres aktivering status, og resultater alle inden det samme væv, hvilket muliggør en bedre forståelse af disse interaktioner. Disse er blot nogle få eksempler på yderligere anvendelser af denne metode, men dette system kan ændres til at studere flere forskningsinteresser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Inc. A9539 Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution
Flat bottom glass watch dish Agar Scientific AGL4161 We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles BD PrecisionGlide 305122
Syringes (could be 1 or 5 mL) BD Syringes 1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisherbrand 12-550-343
Coverslips (24 x 50 mm) Corning 2935-245
5 mL glass conical tube Corning 8060-5
9" disposable Pasteur pipette Fisherbrand 13-678-20D
Clinical bench top centrifuge
Glass  tubes (6 x 50 mm) Fisherbrand 14-958-A
*M9 solution
Levamisole Sigma L9756
3% Paraformaldehyde (PFA) Electron microscopy services 17500 Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer
1x PBS-T 1x PBS with 0.1% Tween 20
Methanol Electron microscopy services 18510
Normal goat serum (NGS) Cell Signaling 5425 Diluted to 30% in 1x PBS-T
MAPKYT (dpERK) antibody  Sigma Inc. M9692 Dilution 1:400 in 30% NGS
Secondary antibody Invitrogen A-11005 Dilution 1:500 in 30% NGS
DAPI Sigma D9542
Vectashield Vector Labs H-1000
*M9 Buffer Recipe 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. 
**PBS (1x) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L
Nematode Growth Medium (NGM) 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
  2. McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
  3. Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
  4. Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
  5. Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
  6. Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
  7. Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).
  8. Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
  10. Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
  11. Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
  12. Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
  13. Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
  14. Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
  15. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
  16. Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
  17. Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
  18. Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
  19. Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
  20. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
  23. Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
  24. Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).

Tags

Developmental Biology RAS-ERK, Kimcellelinje, immunofluorescens signalproteiner
Rumlig og tidsmæssig analyse af Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; Kimcellelinje
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial… More

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter