Summary
We presenteren een immunofluorescentie-imaging methode voor ruimtelijke en temporele lokalisatie van actieve ERK in de ontleed C. elegans gonade. De hier beschreven protocol kan worden aangepast voor visualisatie van elke signalering of structurele eiwit in het C. elegans gonade, mits een geschikt antilichaam reagens beschikbaar is.
Abstract
De evolutionair geconserveerde extracellulaire signaal transducerende RTK-RAS-ERK route is een belangrijke-kinase signalerende cascade die meerdere cellulaire en ontwikkelingsprocessen regelt voornamelijk via activatie van ERK, de terminal kinase van de route. Strakke regulatie van ERK-activiteit essentieel is voor normale ontwikkeling en homeostase; overactief ERK resulteert in excessieve cellulaire proliferatie, terwijl onderactieve ERK veroorzaakt celdood. C. elegans is een krachtig model systeem dat heeft geholpen kenmerkend zijn voor de functie en regulatie van RTK-RAS-ERK signaleringsroute tijdens de ontwikkeling. Met name de RTK-RAS-ERK route essentieel is voor C. elegans kiembaan ontwikkeling, die de focus van deze werkwijze. Met antilichamen die specifiek de actieve vorm van diphosphorylated ERK (dpERK), de lokalisatie stereotype patroon kan worden gevisualiseerd in de kiemlijn. Omdat dit patroon is zowel ruimtelijk als in de tijd controlled, het vermogen om reproduceerbaar testen dpERK is nuttig regulatoren van de route die dpERK signaalduur en amplitude en dus kiemlijn ontwikkeling beïnvloeden. Hier laten we zien hoe succesvol te ontleden, vlek, en het beeld dpERK binnen de C. elegans gonade. Deze methode kan worden aangepast voor het ruimtelijk lokaliseren van elke signalering of structurele eiwit in het C. elegans gonaden, een antilichaam verschaft compatibel met immunofluorescentie beschikbaar.
Introduction
De receptortyrosinekinase (RTK) Rat Sarcoom (RAS) -Extracellular signaalgereguleerde Kinase (ERK) pathway relais extracellulaire signalen via een geconserveerd kinase cascade die leidt tot de fosforylering en activering van ERK 1-3. ERK eiwitten zijn leden van de geconserveerde proline-gerichte serine / threonine MAP (mitogeen geactiveerd eiwit) kinase familie, en rechtstreeks door MEK geactiveerd via dubbele fosforylering op threonine (T) en tyrosine (Y) van de geconserveerde TEY motief. Actieve ERK (aangeduid als diphosphorylated ERK, of dpERK) regelt vervolgens vele cellulaire en ontwikkelingsprocessen door de fosforylering van een batterij van de downstream-substraten 1-3. Zo leidt abnormale ERK activiteit veel mobiele en ontwikkelingsstoornissen gebreken 4-7.
Strikte regulering van ERK-activiteit is essentieel voor de normale ontwikkeling: zoogdiersystemen teveel ERK activiteit leidt tot excessieve cellulaire proliferatie leidendeoncogene groei; te weinig activiteit leidt tot celdood 4,6. Bovendien, veranderingen in de duur van ERK activiteit kan ook leiden tot verschillende resultaten: in PC12-cellen, ERK activatie gedurende 30 minuten of minder induceert celproliferatie, maar ERK activatie gedurende 60 min of meer induceert neuronale differentiatie 8,9. Strakke regulering van de ERK activiteit is dus duidelijk essentieel voor een normale ontwikkeling en homeostase.
C. elegans is een krachtige, en genetisch kneedbaar modelsysteem om de functie en regulering van de RTK-RAS-ERK signaleringsroute 3,10-15 ontleden. Ten opzichte van zoogdiersystemen, die meerdere genen voor RAS en ERK, C. bevatten elegans bevat een RAS-gen (let-60) en een ERK gen (MPK - 1), waardoor het een genetisch meer gemakkelijke systeem om de functie van deze pathway 3,10-14 ontleden. De C. elegans kiembaan is in wezen een buis die bestaat uit mitotischestamcellen aan zijn distale uiteinde en rijpe oöcyten aan het proximale einde (figuur 1) 16. Kiemcellen initiëren meiose net proximaal van de distale zone mitotische en vooruitgang door langere meiotische profase (pachytene), waarna ze beginnen te vormen eicellen in het lusgebied tenslotte maturatie ondergaat in het proximale gebied 16.
Genetische studies van verschillende laboratoria, waaronder onze eigen, hebben aangetoond dat de RTK-RAS-ERK route essentieel is voor kiemlijn ontwikkeling in C. elegans 12,13,15,17-19. We troffen dat ERK controles en coördineert tenminste negen verschillende biologische processen tijdens kiemlijn ontwikkeling gaande van ontwikkelingsstoornissen schakelaars zoals kiemcel apoptose biologische processen zoals eicelkwaliteit 11,18 cel. Net als in zoogdiersystemen, teveel ERK activiteit in de C. elegans kiembaan leidt tot de productie van meerdere kleine oöcyten, terwijl ook little activiteit leidt tot een grote 11 eicel. Aldus strakke regulering van dpERK is essentieel voor normale ontwikkeling kiemlijn. De actieve vorm van ERK, zoals gevisualiseerd door een antilichaam specifiek voor dpERK, wordt een stereotype, dynamische, bimodale lokalisatie patroon: dpERK hoog in mid-pachytene (Zone 1, figuur 1), onderaan de lusgebied en weer hoog in volwassen eicellen (Zone 2, figuur 1). Onlangs vonden we dat voeding werkt door de insuline-achtige groeifactor receptor-1 (daf-2) naar ERK te activeren in Zone 1 12; eerder werk toonde aan dat het sperma signaal (via de Efrine receptor tyrosine kinase) activeert ERK in Zone 2 13.
Aangezien actieve ERK functioneert als een regelbare weerstand in de kiemlijn te eicelkwaliteit, ruimtelijke en temporele lokalisatie, alsmede amplitude van dpERK reguleren, is de sleutel tot het begrip van de normale signalering resultaat. Als hier beschreven veranderingen in destereotiepe lokalisatie van dpERK kan eenvoudig worden gecontroleerd en voorspellingen afgeleid over de impact van de milieu-of genetische verstoringen op ERK activiteit en dus de functie. Zo testen op dpERK zorgt voor een beter begrip van haar rol tijdens kiemlijn ontwikkeling.
Protocol
De hier beschreven protocol is primair voor het invertebrate modelsysteem C. elegans, en volgt de ethische richtlijnen uiteengezet door de instelling.
1. Dierlijke Onderhoud
- Handhaaf C. elegans werkvoorraad culturen Nematoden groeimedium 20,21 (NGM, zie Materialen Table) agar geënt met E. coli OP50.
- Handhaaf worm voorraden bij temperaturen tussen 16 ° C en 25 ° C.
LET OP: Het kweken van wormen bij hogere temperaturen leidt tot een snellere groei, vaak afwijkende kiembaan ontwikkeling en lagere broed maten. Daarnaast zal temperatuurgevoelige genotypes verschillende fenotypen bij verschillende temperaturen weergegeven. - Transfer wormen nieuwe NGM platen elke 2-3 dagen afhankelijk van de groeisnelheid teneinde een constante toevoer van weldoorvoede wormen handhaven.
LET OP: Voor elk experiment met dpERK niveaus, wormen mag NIET worden verkregen van een uitgehongerd of menigteed plaat. Verdringing of verhongering gevolgen van insuline signalering in wormen 22, en de insuline signalering reguleert ERK 12 activiteit. Zo wormen uit uitgehongerd of overvol platen zal resulteren in variabele en moeilijk te reproduceren kleurpatronen.
2. Dissectie van volwassen wormen voor het verkrijgen van Gonads
- Pick 100-150 WT (N2) of gewenste genotype wormen op de gewenste en specifieke ontwikkelingsfase (L1, L2, L3, L4, volwassen, enz.) In 100 pl M9 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Vul het microcentrifugebuis met 900 ul van M9 buffer (zie Materials tabel). Centrifugeer de buizen bij 1000 xg in een microcentrifuge gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig 900 pi van de M9 buffer en gooi. Verwijder de buffer onder een dissectie microscoop zodat de wormen niet per ongeluk verwijderd.
- Herhaal stap 2,2-2,3 nog tweemaal met verse buffer M9 telkens.Dit zorgt ervoor dat alle bacteriën die over met de wormen werden uitgevoerd effectief weg te worden gewassen.
- Na de laatste wasbeurt te verwijderen 900 pi van M9 buffer uit de tube en gooi.
- Breng de resterende 100 pi M9 buffer die de 100-150 wormen met een 200 ul-micropipet tip om een vlakke bodem glazen horloge schotel. Zorg ervoor dat de micropipet tip aan de 10 pi markering wordt gesneden voor gebruik. Niet snijden van de tip zal resulteren in afschuiving van de wormen.
- Voeg 1-3 pi van 0,1 M levamisool de glazen schaaltje met het horloge wormen in M9 buffer. Zwenk de levamisol en de M9 om zelfs in staat te mengen totdat de wormen stoppen met bewegen.
OPMERKING: Levamisole bestanden kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C voor langdurige opslag. Hier gebruikt de hogere concentratie van 1-3 mM dan wat in de literatuur 23 beschreven van 0,2 - 0,25 mM levamisool om snel verlies van mobiliteit in de dieren te verkrijgen. Als de dieren villen rond voor te long in de vloeibare suspensie, de resulterende patronen van dpERK in de gonaden kan variabel zijn (vanwege stress of gebrek aan voeding of beide). Meer reproduceerbare kleurpatronen zijn verkregen met 1-3 mM levamisol voor dissectie. - Bevestig twee 25 G naalden twee 1 ml spuiten (de grootte van de spuit niet uit de meter van de naald kritisch). Punt een spuit in elke hand (figuur 2).
- Onder een dissectiemicroscoop gepositioneerd, naald onder en over elkaar worm zoals weergegeven in figuur 2 en plaats een shag op de worm nabij de tweede pharyngeal lamp in een schaar-achtige beweging. Na een verlaging van de worm door naar het volgende dier totdat alle dieren in de schaal ten minste eenmaal gesneden.
LET OP: Wees bewust dat de stappen 2,8-2,9 zijn tijd gevoelig. Ontleden alle wormen in de schaal in minder dan vijf minuten voor een reproduceerbare dpERK patroon. Langere tijden dissectie resulteert in een uitschakel functie van de dpERK signaal, zeker in Zéén 1. Stel het aantal wormen per ronde van dissectie (dat wil zeggen, 50 wormen versus 150), indien nodig om te verblijven in het toegewezen tijdsbestek.- In het geval dat een geëxtrudeerde gonade niet zichtbaar is tijdens de dissectie, niet proberen een andere gesneden in hetzelfde dier. Meestal dat alleen afschuiving het dier niet tot extrusie van de gonade. In plaats daarvan gaan naar het volgende dier. Worms, waar de geslachtsklieren niet extruderen zal verschijnen als zodanig op de dia's die zullen worden gemaakt in hoofdstuk 6 en kan worden genegeerd tijdens de beeldvorming
LET OP: Door alle van de dissectie en processtappen, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de gonaden om het lichaam / karkas bevestigd blijven. Laat de gonaden en het lichaam uit elkaar met de naald niet dwingen. Vaak een afwijkende scheur in de gonadale weefsel in een poging om de gonaden scheiden uit het lichaam kan leiden tot valse antilichaam signaal. Het lichaam / karkas kan worden genegeerd tijdens de beeldvormende stappen (hoofdstuk 6), en alleen de gonade afgebeeld. Daarnaast sometimes de darmcellen kan ook dienen als controles / somatische controles voor de antilichamen worden getest.
- In het geval dat een geëxtrudeerde gonade niet zichtbaar is tijdens de dissectie, niet proberen een andere gesneden in hetzelfde dier. Meestal dat alleen afschuiving het dier niet tot extrusie van de gonade. In plaats daarvan gaan naar het volgende dier. Worms, waar de geslachtsklieren niet extruderen zal verschijnen als zodanig op de dia's die zullen worden gemaakt in hoofdstuk 6 en kan worden genegeerd tijdens de beeldvorming
3. Gonade Fixatie
- Na de dissectie is voltooid, voeg 2 ml 3% paraformaldehyde (PFA) rechtstreeks op het glazen schaaltje met het horloge 100 pi van M9 en de dieren ontleed en bedek met Parafilm. Leg de overdekte horlogeglas gerecht in een chemische dampkap.
Let op: PFA is een gevaarlijk chemisch. Daarom moet het fixeren worden uitgevoerd in de zuurkast. - Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Met behulp van een wegwerp 9 "glas Pasteur pipet voeg 3 ml 1x PBS-T (zie Materialen Table) om het horloge glazen schaal met daarin de ontleed dieren. Mix van het tekenen van de PFA-oplossing en het 1x PBS-T met de ontleed dieren in het Pasteur pipet en het vrijgeven van voorzichtig terug in het horlogeglas gerecht. niet de buizen vortex tijdens de wasbeurten.
- Met een fresh glas Pasteur pipet trekken de 5 ml vloeistof (die ontleed wormen, PFA en 1x PBS-T) van het horloge glazen schaal in de Pasteur pipet en breng de inhoud in een frisse 5 ml glazen conische buis.
- Centrifugeer de conische buizen van 30 seconden in een klinische centrifuge bij 1000 x g. Gebruik glas Pasteur pipetten en conische buizen als ontleed geslachtsklieren vasthouden aan plastic.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof zorg om te voorkomen dat de ontleed dieren verstoren. Verwijder de vloeistof na elke wasbeurt van de conische buis onder een stereomicroscoop om te voorkomen dat de gonaden ontleed beïnvloeden en hun minimaliseren.
- Met eenzelfde Pasteur pipet 5 ml 1x PBS-T om de conische buizen. Centrifugeer de conische buizen in een klinische centrifuge gedurende 30 seconden bij 1000 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof zorg om te voorkomen dat de ontleed dieren verstoren.
- Herhaal stap 3,7 voor een totaal van drie keer.
- Met behulp van een verse Pasteur pipet, voeg 2 ml van 100%methanol aan de buizen en meng de gonaden met methanol door het opstellen in de Pasteur pipet. Incubeer de buis bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
OPMERKING: ontlede gonaden kan worden opgeslagen in methanol tot 2 dagen dpERK kleuring. Opslaan ervan gedurende 2 dagen tot 2 weken is compatibel met andere antilichaamkleuring toepassingen, zoals anti-Lamin antilichaam, maar niet met de dpERK antilichaam. - Na de gewenste incubatietijd Herhaal stap 3,7 voor een totaal van drie keer teneinde de gonaden wassen. Laat de buizen niet vortex tijdens de wasbeurten. Na de laatste wasbeurt te verlaten 500 ul van 1x PBS-T in de 5 ml conische buis.
- Met eenzelfde Pasteur pipet breng de inhoud van de conische glazen buis in een vers 1 mL glazen buis (6 mm x 50 mm). Laat de ontleed dieren om zich te vestigen door de zwaartekracht voor 5-10 min.
- Met eenzelfde pasteurpipet en onder een stereomicroscoop, verwijder zoveel van de was mogelijk van de 1 ml glasbuizen without verstoren van de ontleed geslachtsklieren.
4. blokkeren en Primary Antibody Treatment
- Voeg 100 ul van 30% Normaal Geit Serum (NGS) verdund in 1 x PBS-T (zie Materialen tabel) aan de dieren ontleed in 1 ml glazen buizen. 30% NGS dient als blokkerende buffer. Bedek de buis met Parafilm om verdamping van de vloeistof te voorkomen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C overnacht.
- Na de gewenste incubatietijd, verwijder de blokkerende buffer met eenzelfde Pasteur pipet verwijderd zoveel vloeistof mogelijk. Gebruik een dissectiemicroscoop zodat gonaden niet in de Pasteur pipet getrokken.
- Verdun de MAPKYT antilichaam (zie Materialen Table, in deze methode aangeduid als dpERK) op 1: 400 in 30% NGS. Bereid genoeg antilichaam verdunning tot 100 ul gebruiken per buis. Ongebruikte verdund antilichaam kan een week bewaard bij 4 ° C.
- Voeg 100 ul van de verdunde anti-dpERK antilichaam zolutie tot 1 ml glazen buisjes die de dieren ontleed. Sluit de buizen met Parafilm. Incubeer de buizen bij 4 ° C overnacht.
- Na overnacht incubatie voeg 800 ul PBST 1x aan de buizen bij kamertemperatuur.
- Neem het monster in vers glazen Pasteur pipet en laat langzaam zodat de gonaden gelijkmatig gesuspendeerd in 1 x PBS-T. Laat de gonaden naar de bodem met de zwaartekracht. Verwijder het supernatant. Dit zorgt ervoor dat de gonaden ontleed worden gewassen maar tijdens het proces niet beschadigd.
- Herhaal stap 4,5-4,6 voor een totaal van drie wassingen. Laat de buizen niet vortex tijdens de wasbeurten. Na de derde wasbeurt er zeker van te verwijderen en gooi zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de ontleed dieren. Zorg ervoor dat een nieuwe Pasteur pipet wordt gebruikt per keer.
5. secundair antilichaam Behandeling
- Tijdens het primaire antilichaam wast bereiden verdunning van het secundaire antilichaam. Verdun de anti-muis secondary antilichaam bij 1: 500 in 30% NGS. Zoals met het primaire antilichaam, gebruikt 100 pi per buis. Ongebruikte antilichaam kan een week bewaard bij 4 ° C.
- Voeg 100 ul secundair antilichaamoplossing de 1 ml glazen buisjes die de dieren ontleed. Bedek elke buis met Parafilm en wikkel de tubes in aluminiumfolie om de inhoud van de buis in het donker houden. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, of alternatief bij 4 ° C overnacht.
- Na de gewenste incubatietijd, voeg 800 ul van 1 x PBS-T om de buizen en herhaal de stappen 4,5-4,6 voor een totaal van drie keer. Na de laatste wasbeurt, verwijdert en weggooit zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk onder een dissectiemicroscoop met eenzelfde Pasteur pipet.
- Bereid de DAPI oplossing tijdens het wassen voor het secundaire antilichaam. Verdun 1 ui DAPI (1000x uit een voorraad van 1 mg / ml bewaard bij -20 ° C) in- 1 ml 1x PBST.
- Voeg 800 ul van de verdunde DAPI oplossing van de buizen die deontleed dieren. Bedek de mond van de buis met Parafilm, en wikkel elke buis in aluminiumfolie. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Na de incubatie met DAPI, verwijder zoveel van de DAPI oplossing mogelijk met een verse Pasteur pipet, onder een stereomicroscoop om te voorkomen dat de dieren ontleed verstoren.
- Voeg 1 druppel bevestigingsoplossing op de buizen. Wikkel elke buis in aluminiumfolie.
LET OP: Voor het visualiseren dpERK kleuring, gekleurd geslachtsklieren onmiddellijk te worden gemonteerd voor microscopie. Voor andere toepassingen antilichaam zoals gefosforyleerde serine 10 histon H3, kan gonaden in fixeermiddelen voor maximaal 2 weken bij 4 ° C in het donker bewaard.
6. Montage Slides en Imaging
- Leg een laag lab tape lengte bovenop, twee glazen microscoopglaasjes (25 mm x 75 mm x 1 mm) zoals getoond in figuur 3. Zet een nieuwe schone microscoopglaasje tussen de twee schuiven geplakt.
LET OP: De diktevan de tape helpt bij het genereren van een agarose pad op de middelste dia. Dikte van de agarose pad is bijna gelijk aan die van de band, de band dient als een afstandhouder voor het maken van de agarose pad. - Drop ~ 200 pi van gesmolten 2% agarose (gemaakt in gedestilleerd water) op de microscoop dia in het midden. Plaats snel een frisse schone glijbaan, loodrecht op en op de top, van de agar.
- Laat de agarose stollen (1-2 min).
- Verwijder de bovenste microscoopglaasje zeer zacht, zodat de agarose pad niet wordt vernietigd. De agarose pad kan bevestigd blijven ofwel naar boven of naar beneden glijden. Het maakt niet uit welke schuif de agarose pad blijft verbonden, zolang het een glad oppervlak van agarose.
- Met behulp van een Pasteur pipet overdracht van de ontleed dieren op de agarose pad. Verwijder de overtollige vloeistof uit de dia met behulp van een Pasteur pipet onder een dissectie microscoop.
- Met behulp van een wimper haren of fijn getrokken capillaire, duw de geslachtsklieren en darmen eenweg van elkaar om de gonaden spreiden op de dia.
- Bedek de microscoop dia met een 24 mm x 50 mm groot dekglaasje. Let erop dat het dekglaasje langzaam wordt neergelaten op de dia met minimale luchtbellen gevormd tussen het dekglaasje en de dia.
- Bewaren bij 4 ° C overnacht in een schuifkast (een ondoorzichtige schuifkast de glijbanen plat, tot dekglaasje) zodat overtollige vloeistof verdampen en gonaden enigszins afgevlakt worden (door het gewicht van het dekglaasje op de gonaden). De lichte afvlakking van de gonaden maakt een betere beeldvorming van een anders door gonadale buis.
- Zodra het dekglaasje aangebracht, niet te druk op de bovenkant van het dekglaasje met vingers. Vaak leidt dit tot verstoring van de geslachtsklieren en het verlies van de dpERK signaal.
- Vlak de geslachtsklieren alleen nacht voor een effectievere beeldvorming. De dia's zijn klaar om zodra ze worden geassembleerd worden bekeken. Als u afbeeldingen onmiddellijk voorzichtig te absorberende overtollige vloeistof tussen het dekglaasje en de dia uit de hoeken met een schone lab weefsel.
- Na de nachtelijke periode, verzegeling van de glijbaan en dekglaasje met transparante nagellak topcoat op de vier hoeken van het dekglaasje en de dia grens. De nagellak / dekglaasje afdichting zorgt ervoor dat het dekglaasje niet beweegt tijdens beeldvorming en beschermt tegen beschadiging van de monsters.
- Beeld de gonaden met een samengestelde microscoop bij 63x. Maar de objectieflens en microscoop kunnen worden gevarieerd op basis van de beschikbaarheid van microscopen en gebruikerstoepassing. Vanwege de grootte van het gehele gonade van de proliferatieve regio oöcyten groter dan kan worden opgevangen in een beeld, worden de beelden die als montage met overlappende grenzen zoals getoond in figuur 4. 11-14, 18.
- In veel gevallen, bewerk het karkas na de laatste imaging en assemblage, zolang er geen grote wijzigingen zijn aangebracht in de kiemlijn afbeelding. Store tHij ruwe beelden langs de samengestelde afbeelding om vergelijking van de 'voor' montage / editing en 'na' montage / bewerken van de foto's in te schakelen.
NB: De microscopie beelden mogen niet worden gewijzigd voor de signaalsterkte of verzadiging tijdens de montage van de montage.
- In veel gevallen, bewerk het karkas na de laatste imaging en assemblage, zolang er geen grote wijzigingen zijn aangebracht in de kiemlijn afbeelding. Store tHij ruwe beelden langs de samengestelde afbeelding om vergelijking van de 'voor' montage / editing en 'na' montage / bewerken van de foto's in te schakelen.
Representative Results
In WT volwassen hermafrodiete dieren, wordt dpERK meestal gevisualiseerd in mid-pachytene regio, Zone 1, en in de meest volwassen eicellen van -1 tot -4 of -5 (Zone 2). Verstoringen in deze activering patroon reflect wijzigingen in de signaalroute. Vrouw germlines niet sperma te geven, en dus de activering van ERK niet weergegeven in Zone 2, met slechts zwakke activering in Zone 1. Deze worden weergegeven in figuur 5.
Figuur 1: C. elegans kiembaan morfologie. image Differentieel interferentie contrast (DIC) van een volwassen hermafrodiet met een U-vormige gonaden arm geschetst met de witte lijn. De volwassen hermafrodiete gonade bevat mitotische cellen bij de distale tip. De mitotische cellen in te voeren meiose en vooruitgang door meiotische profase (pachytene) ontwikkelt zich tot mature eicellen in het proximale gonade. Zone 1 en Zone 2 mark stereotiepe lokalisatie van dpERK in een volwassen hermafrodiete gonade. Schaal:. 20 urn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Demonstratie van Needle Posities tijdens dissecties. Links: Foto van een dissectie in het proces. Rechts:. Naald posities aan de hand van de worm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Demonstratie van Agarose Slide Voorbereiding. (A) Plaats een tape lengthwise over 2 schoon microscoopglaasjes. Leg een frisse schone microscoopglaasje tussen de twee dia's met de band, zoals aangegeven. De drie glijbanen zijn naast elkaar lengterichting. (B) gesmolten agarose aan de dia in het center. (C) Plaats een nieuwe microscoopglaasje loodrecht op en boven de middelste schuif, die de druppel agarose. ( D) Laat de agarose te stollen. (E) Verwijder de bovenste schuif met achterlating van de gestolde agarose pad. Gebruik de bodem dia met de agarose pad voor montage ontleed en gekleurd germlines. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: beeld brengen van de dia's als een Montage Montage van een wild-type kiemlijn met DAPI (t.op) en dpERK (onder) kanaal. Beelden genomen op 63x met overlappende grenzen, werden witte dozen voor paneel A en B en groene dozen voor paneel B en C. De DAPI en dpERK afbeeldingen voor elk paneel gelijktijdig in twee verschillende kanalen genomen. De samengestelde afbeelding wordt getoond in figuur 5A. Schaal bar:. 20 urn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Dynamic Temporal / Ruimtelijke Activering van ERK. (AC) WT (N2) volwassene (24 uur afgelopen mid-L4 stadium van ontwikkeling) hermafrodiet germlines gekleurd voor DNA (B, DAPI, wit) en dpERK (C, red). De dpERK signaal in Zone 1, de pachytene regio, en Zone 2, de rijpe eicellen is gemarkeerd. (DF)fog-2 (oz40) vrouwelijke germlines (8 h verleden mid-L4 stadium van ontwikkeling) gekleurd voor DNA (E, DAPI) en dpERK (F). Jonge vrouwelijke germlines weer zwak dpERK in Zone 1, en in één eicel in een zaadcel onafhankelijke wijze. Zone 2 is sperma afhankelijk, en dus aanwezig in de vrouwelijke kiemlijn. Schaal bar:. 20 urn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Actieve ERK (dpERK) volgt op een stereotiepe ruimtelijke en dynamische lokalisatie patroon in de C. elegans kiembaan. Dit stereotype dpERK ruimtelijk patroon (figuur 5), en amplitude in een volwassen C. elegans gonaden, effectief kan worden gecorreleerd met de vele biologische processen die ERK reguleert. Bijvoorbeeld, een onvermogen om ERK te activeren in Zone 2 leidt tot een arrestatie in oöcyten in profase van meiose, een fenotype waargenomen bij vrouwelijke germlines die geen sperma opgeeft, en dus ERK volgroeide eicellen niet activeren (Figuur 5). Paring met de resultaten mannetjes in effectieve accumulatie van dpERK in Zone 2 in de vrouwelijke germlines 11,13, in combinatie met het begin van de eicel rijping en ovulatie. Waardoor analyse van de ruimtelijke en temporele patronen van activatie dpERK aan bepaalde genetische storingen (bijvoorbeeld RNA interferentie gemedieerde gen inactivatie) of chemische behandelingen kunnen worden vastgesteld factoren die verlaat ERK signalering en dus ERK-afhankelijke biologische processen. Dergelijke analyses maken ook ontdekking van nieuwe genetische interacties tussen signaleringsroutes.
Een kritische bottleneck voor beeldvorming gebaseerde analyse is de beschikbaarheid van functionele reagentia zoals antilichamen die specifiek zijn voor de toepassing. Indien deze testsera bestaat dan werkwijzen zoals hierboven beschreven, kunnen gemakkelijk aangepast worden voor de analyse van de lokalisatie patroon voor een eiwit van interesse. De toepassing is derhalve beperkt door de beschikbaarheid van een functionerende antilichaam. Bovendien, omdat de methode beschrijft dissectie en vlekken op een gegeven ontwikkelingstijd, het stelt alleen het vastleggen van gegevens in een tijdsbestek, en geen licht werpen op de dynamiek of eiwit regelgeving in real time of de snelheid van de omzet eiwit.
De hierboven beschreven methode is een bewerking van Francis et al. 23, dat verschilt van de Seydoux en Dunn methode 24 voor gonade extrusie en antilichaamkleuring. De methode op basis van Francis et al., Zal de 'schorsing methode "en de Seydoux en Dunn methode genaamd het" bevriezen kraken methode "voor de vergelijking worden genoemd. De suspensie methode is zeer effectief in handen voor het verkrijgen van reproduceerbare lokalisatie patronen signaalmoleculen zoals dpERK, die inherent gevoeliger voor zware gebruiksomstandigheden. In het geval van dpERK lokalisatie, in onze ervaring, het signaal in Zone 1 is vrijwel niet op te sporen met de bevriezing kraken methode. Bovendien monster drogen, die vaak optreden bij de bevriezing kraakmethode, leidt tot valse signalen antilichaam. De suspensie methode kunnen monster drogen, aangezien de gonaden in vloeistof tijdens het proces worden onderbroken. We zien dat de suspensie werkwijze bruikbaar voor het afbeelden van meerdere verschillende genotypes op één dia. Als bijvoorbeeld twee genotypen, zoals hermafrodieten vsvrouwtjes worden direct vergeleken dpERK lokalisatie, de twee genotypen worden gemengd en verwerkt. Dit is mogelijk omdat de verschillende fenotypes kan worden onderscheiden via DAPI morfologieën. Kleuring in dezelfde buis gevolgd door beeldvorming op hetzelfde glas maakt directe vergelijking tussen de gonaden van verschillende genotypen. Een defect DAPI morfologie niet te onderscheiden dan een tweestaps antilichaamkleuring kan worden vastgesteld. Eerst elke individuele genotype wordt behandeld met twee verschillende antilichamen, antilichaam een antilichaam voor WT en mutant B (beide antilichamen nodig samen onderscheiden van de dpERK antilichaam worden verhoogd). Wanneer de twee genotypen werden gekleurd met het primaire antilichaam, en gewassen, kunnen zij worden samen in één buis gemengd en nu gekleurd met de dpERK antilichaam, gevolgd door een secundair antilichaam behandeling alle antilichamen in de buis zichtbaar. Het vermogen om verschillende genotypen te vergelijken op een enkele dia, vooral wanneer deductions van de activering patronen worden gemaakt zorgt voor een accurate interpretaties niet beïnvloed door verschillende kleuring omstandigheden.
Hoewel voordelig er meerdere stappen gehele suspensie methode die zorgvuldige manipulatie vereisen. Het is essentieel dat de dissecties optreden in een tijd efficiënte wijze; belangrijkste is dat de secties niet meer dan 5 minuten duren. Langere tijden dissectie resulteren in variabele dpERK signaal, die vaak worden geïnterpreteerd als geregeld veranderingen in ERK activatie en niet als technische storingen. Het is cruciaal om te beginnen dan 100-150 dieren van elke dissectie omdat in de verschillende wasstappen de geslachtsklieren gemakkelijk verloren uit de buizen door pipetteren fouten. Verlies van gonaden kan worden verminderd of door ontleden in meerdere kleine batches (zoals drie groepen van 50 dieren elk) die kunnen worden gecombineerd, of door ontleden van een grote partij 150. Een andere uitdaging is het verkrijgen van de geslachtsklieren te liggen in een goed gespreid vormingop de slede zodat de gehele distale gonade kan worden afgebeeld. Om dit mogelijk te maken, gebruik dan een wimper op een lucifer of een getrokken pipet om de ruimte van de geslachtsklieren. Toch moet erop worden genomen om te voorkomen dat de gonaden beschadigen tijdens dit proces. Vaak met deze technieken het duurt meerdere pogingen om de dissecties beheersen alsook de regelingen van de geslachtsklieren op de dia's.
Zodra deze techniek beheerst, dient het als een krachtige methode voor uiteenlopende biologische analyses, en kan worden gebruikt om meer dan dpERK niveaus bestuderen. Bijvoorbeeld kan deze methode worden gebruikt om een actieve p38 niveaus of actief CDK niveaus of elk eiwit waarvoor een antilichaam reagens bestaat visualiseren. Bovendien kan de werkwijze worden gecombineerd met een chemische remming scherm gehele dieren om te testen op nieuwe remmers of activatoren van de weg, via testen op dpERK niveaus. Dit zal zorgen voor een in vivo uitlezen van zowel reactie en gevoeligheid voor eventuele remmers die kunnen interact met de RTK-RAS-ERK signaleringsroute. Bovendien kan deze methode worden gebruikt in combinatie met meerdere antilichamen signaaluitgangen die allemaal kunnen worden gebruikt en gevisualiseerd tegelijkertijd. Meerdere antilichamen maakt correlatie tussen meerdere wegen hun activeringsstatus en uitkomsten allemaal binnen hetzelfde weefsel, waardoor beter begrip van deze interacties. Dit zijn slechts enkele voorbeelden van verdere toepassingen van deze werkwijze, maar dit systeem kan worden aangepast om meerdere onderzoeksinteresses bestuderen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma Inc. | A9539 | Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution |
| Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass because dissected gonads often stick to plastic |
| 25 G needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| Syringes (could be 1 or 5 mL) | BD Syringes | 1 mL: BD 309659 | |
| Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
| Coverslips (24 x 50 mm) | Corning | 2935-245 | |
| 5 mL glass conical tube | Corning | 8060-5 | |
| 9" disposable Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Clinical bench top centrifuge | |||
| Glass tubes (6 x 50 mm) | Fisherbrand | 14-958-A | |
| *M9 solution | |||
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Electron microscopy services | 17500 | Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer |
| 1x PBS-T | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Methanol | Electron microscopy services | 18510 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signaling | 5425 | Diluted to 30% in 1x PBS-T |
| MAPKYT (dpERK) antibody | Sigma Inc. | M9692 | Dilution 1:400 in 30% NGS |
| Secondary antibody | Invitrogen | A-11005 | Dilution 1:500 in 30% NGS |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| *M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. | ||
| **PBS (1x) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L | ||
| Nematode Growth Medium (NGM) | 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. |
References
- Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
- McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
- Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
- Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
- Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
- Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
- Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).
- Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
- Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
- Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
- Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
- Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
- Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
- Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
- Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
- Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
- Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
- Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
- Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
- Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).
