Summary
我々は、解剖CのアクティブなERKの空間的および時間的局在化のための免疫蛍光イメージングベースの方法を提示しますエレガンス生殖腺。ここで説明するプロトコルは、Cの任意のシグナルまたは構造タンパク質の可視化のために適合させることができますエレガンス生殖腺は、適切な抗体試薬は入手可能です提供しました。
Abstract
RTK-RAS-ERK経路を伝達する進化的に保存された細胞外シグナルは、主にERK、経路の末端キナーゼの活性化を介して複数の細胞と発生過程を制御する重要なキナーゼシグナル伝達カスケードです。 ERK活性の厳しい規制は、正常な発達と恒常性に不可欠です。過剰な細胞増殖における過度に積極的なERKの結果、不活発ERKは、細胞死を引き起こすながら。C.エレガンスは、開発中にRTK-RAS-ERKシグナル伝達経路の機能および調節を特徴づける助けた強力なモデル系です。具体的には、RTK-RAS-ERK経路は、Cのために不可欠ですこの方法の焦点である生殖系列発達をエレガンス 。ERK（dpERK）の活性、二リン酸化形態に特異的な抗体を使用して、ステレオタイプの局在パターンは、生殖細胞系内で可視化することができます。このパターンは、空間的及び時間的にcontrollあるのでedは、再現性dpERKを分析する能力はdpERK信号継続時間と振幅ので、生殖系列発達に影響を与える経路の調節因子を同定するために有用です。ここでは、Cの範囲内に成功し、汚れを分析する方法を示し、および画像dpERK エレガンス生殖腺。この方法は、Cの任意のシグナルまたは構造タンパク質の空間的局在性に適合させることができますエレガンス生殖腺は、免疫蛍光との互換性抗体が入手可能です提供しました。
Introduction
受容体チロシンキナーゼ（RTK）-RAt肉腫（RAS）-Extracellular信号調節キナーゼ（ERK）経路は、ERK 1-3のリン酸化および活性化をもたらす保存されたキナーゼカスケードを介して細胞外の信号を中継します。 ERKタンパク質は、保存されたプロリン指向性セリン/スレオニンMAP（マイトジェン活性化タンパク質）キナーゼファミリーのメンバーであり、直接保存さTEYモチーフのトレオニン（T）及びチロシン（Y）上の二重リン酸化を介して、MEKによって活性化されます。 （二リン酸化ERK、またはdpERKとも呼ばれる）アクティブERKは、その後、下流基質1-3の電池のそのリン酸化を介して、多くの細胞や発達過程を調節します。このように異常なERK活性は、多くの細胞や発達障害4-7につながります。
ERK活性の厳しい規制は正常な発達のために重要である：哺乳動物系であまりにも多くのERKの活性が過剰な細胞増殖リーディングにつながります発癌性成長へ。過少活性は細胞死4,6に至ります。さらに、ERK活性の持続時間の変化はまた、異なる結果をもたらすことができる：PC12細胞で、30分以下誘導する細胞増殖のためのERKの活性化が、60分以上ERKの活性化は、神経分化8,9を誘導します 。 ERK活性の厳しい規制は、このように正常な発達と恒常性のために明らかに必須です。
C.エレガンスは、RTK-RAS-ERKシグナル伝達経路3,10-15の機能と規制を分析するための強力な、そして遺伝的に可鍛性モデル系です。 RASおよびERK、Cの複数の遺伝子が含まれている哺乳動物系への相対この経路3,10-14の機能を分析するには、遺伝的に、より容易なシステムを、それをレンダリング、 - エレガンスは、1 RAS遺伝子（ せ-60）と1つのERK遺伝子（1 MPK）が含まれています。 C.エレガンスの生殖細胞系は、本質的に、有糸分裂で構成されてい管でありますその近位端部（ 図1）16にその遠位端部での細胞および成熟した卵母細胞を生じます。生殖細胞は、彼らが最終的に、近位領域16に卵成熟を受けて、ループ領域に卵母細胞を形成し始める後、遠位分裂ゾーンのすぐ近位減数分裂を開始し、拡張減数分裂前期（太糸期）を経て進行。
私たち自身を含む複数の研究室からの遺伝学的研究は、RTK-RAS-ERK経路は、Cの生殖系列発達に不可欠であることを示していますエレガンス 12,13,15,17-19。具体的には、そのERKコントロールを発見し、そのような卵母細胞の成長11,18のような生物学的プロセスをセルにこのような生殖細胞のアポトーシスなどの発達のスイッチに至るまで、生殖細胞系の開発中に、少なくとも9の異なる生物学的プロセスを調整します。多くの哺乳動物系、Cであまりにも多くのERK活性のようなあまりにも李ながら、複数の小さな卵母細胞の生産に生殖細胞系列結果エレガンス一つの大きな卵母細胞11内ttle活動実績。したがってdpERKの厳しい規制は、通常の生殖系列発達に不可欠です。 dpERK半ば太糸期の間に高いです（ ゾーン1、図1）、ループ領域における低および高再び成熟中：ERKの活性型は、dpERKに特異的な抗体によって可視化されるように、ステレオタイプ、ダイナミック、二峰性の局在パターンを表示します卵母細胞（ ゾーン2、図1）。最近、我々は、栄養ゾーン1 12でERKを活性化するためにインスリン様成長因子受容体1（DAF-2）を介して作用することを見出しました。従来の研究は、（エフリン受容体チロシンキナーゼを介して ）精子信号はゾーン2 13でERKを活性化することが示されました。
卵母細胞の成長、空間的および時間的局在化、ならびにdpERKの振幅を調節するための生殖細胞系列における可変抵抗器のような活性ERK機能することを考えると、その正常なシグナル伝達の結果を理解する鍵です。の変化をここで記載された方法を用いてdpERKのステレオタイプの局在化が容易に監視することができ、予測はERK活性て、関数への環境や遺伝的摂動の影響に導出しました。したがって、dpERKについてのアッセイは、生殖系列発達の間の役割の包括的な理解を可能にします。
Protocol
ここで説明するプロトコルは、主に無脊椎動物モデル系Cでありますエレガンス 、そして機関が定めるすべての倫理指針に従います。
1.動物のメンテナンス
- C.を維持E.を接種した寒天線虫成長培地20,21（NGM、参照材料表 ）上のストック培養作業エレガンス 大腸菌 OP50。
- 16℃と25℃の間の温度でワームストックを維持します。
注：より速い成長速度、多くの場合、異常な生殖系列発達と下ひなサイズで、より高い温度の結果でワームを培養します。また、温度感受性遺伝子型が異なる温度で異なる表現型を表示します。 - よく供給されたワームの一定の供給を維持するように、その成長率に応じて3日 - すべての2新NGMプレートにワームを転送します。
注：dpERKレベルを含む任意の実験のために、虫が飢餓や群衆の中から得られるべきではありませんエドプレート。混雑や飢餓の影響インスリンは、ワーム22におけるシグナリング、およびインスリンシグナル伝達は、ERK 12活性を調節します。したがって、飢餓や超満員のプレートからワームは、変数と困難な再現染色パターンになります。
生殖腺を得るための成虫の2解剖
- 150 WT（N2）または所望の特定の発達段階でのワームの所望の遺伝子型のM9緩衝液100μL中に1.5 mLのマイクロ遠心チューブに- 100ピック（L1、L2、L3、L4、大人、 など 。）。
- M9バッファー900μLでマイクロチューブを埋める（ 材料表を参照してください）。周囲温度で1分間微量1,000×gでチューブを遠心。
- 静かにM9バッファー900μLを除去し、廃棄します。ワームが誤って削除されないことを保証するために解剖顕微鏡下でバッファを削除してください。
- 各バッファ時間新鮮なM9と2.3 2回以上 - を繰り返して、2.2を繰り返します。これはワームに持ち越された任意の細菌を効果的に洗い流されることを保証します。
- 最終洗浄後、チューブからM9バッファー900μLを除去し、廃棄します。
- 平底ガラス製時計皿に200μL、マイクロピペットチップで150ワーム - 100を含む残りの100μLM9のバッファを転送します。マイクロピペットチップは、使用前に10μLマークで切断されていることを確認してください。先端を切断しないと、ワームのせん断になります。
- M9バッファーでワームを含むガラスの時計皿に0.1 Mレバミゾールの3μL - 1を追加します。ゆっくりワームは移動を停止するまで混合しても有効にするためにレバミゾールとM9を旋回。
注：レバミゾールストックを長期保存のために-20℃で保存することができます。動物における移動度の急速な損失を得るために、レバミゾールの0.25mMの- 0.2の文献23に記載されているものよりも3mMの-ここでは、1のより高い濃度を使用します。動物はあまりにリットルの周りフレイ場合オング液体懸濁液に、生殖腺におけるdpERKの結果として得られるパターンは、（応力または栄養または両方の不足のために）変数にすることができます。解剖のために3mmのレバミゾール - より再現性の染色パターンは、1で達成されています。 - 2 1 mLのシリンジに2 25 G針を取り付け（注射器の大きさは重要ではありません、針のゲージは非常に重要です）。それぞれの手で1位のシリンジ（ 図2）。
- 図2に示すように、解剖顕微鏡下で、下で各ワーム上で各針を置き、はさみのような動きで二咽頭電球の近くにワームに細かいカットを配置します。シャーレ内のすべての動物が少なくとも1回切断されるまで、ワームで1カットした後、次の動物に移動します。
注：手順2.8ことを注意して - 2.9時間に敏感です。再現性のdpERKパターンのための5分の下に皿の中のすべてのワームを解剖。長い解剖時間が特にZで、dpERK信号のオフにすることになります1 1.割り当てられた時間枠内にとどまることを解剖（ すなわち 、50ワーム対 150）、必要に応じてのラウンドあたりのワームの数を調整します。- 場合に押し出された生殖腺は、解剖時に表示されていない、同じ動物内の別のカットを行わないでください。通常、それは唯一の動物を剪断し、生殖腺の押し出しにはなりません。代わりに、次の動物に移動します。生殖腺が押し出していないワームは、セクション6に説明すると、撮影時に無視することができ、スライド上のような表示されます。
注：解剖および処理工程の全てを通じ、それは生殖腺が体/カーカスに付着したままになります念頭に置くことが重要です。生殖腺と離れて針で体を強制しないでください。体から生殖腺を切断しようとする試みで、しばしば生殖腺組織における異常な涙は、スプリアス抗体シグナルをもたらすことができます。ボディ/カーカスは、撮像ステップ（セクション6）の間に無視することができ、かつ唯一の生殖腺を画像化しました。さらに、ソム腸の細胞は、抗体のための内部統制/体細胞のコントロールがアッセイされるとしての役割を果たすことができるetimes。
- 場合に押し出された生殖腺は、解剖時に表示されていない、同じ動物内の別のカットを行わないでください。通常、それは唯一の動物を剪断し、生殖腺の押し出しにはなりません。代わりに、次の動物に移動します。生殖腺が押し出していないワームは、セクション6に説明すると、撮影時に無視することができ、スライド上のような表示されます。
3.生殖腺固定
- 解剖が完了した後、M9の100μLを含むガラス時計皿や解剖動物に直接、3％パラホルムアルデヒド（PFA）の2ミリリットルを追加し、パラフィルムでカバーしています。化学ヒュームフードで覆われた時計ガラス皿を置きます。
注意：PFAは、危険な化学物質です。従って、固定は、化学ヒュームフード内で行われるべきです。 - 室温で10分間インキュベートします。
- 使い捨て9「ガラスパスツールピペットを使用して、解剖した動物を含む時計ガラス皿に3 mLの1×PBS-T（参照材料表 ）を追加します。ミックスをパスツールに解剖動物とPFA溶液および1×PBS-Tを描くことによってピペットとバック時計ガラス皿に静かに放出される。洗浄の間にチューブをボルテックスしないでください。
- FREを使用しましたshのガラスパスツールピペットは、パスツールピペットに時計ガラス皿から液体の5mLの（解剖ワームを含む、PFAおよび1×PBS-T）を描画し、新鮮な5mLのガラス製コニカルチューブに内容を転送します。
- 遠心分離機千×gでの臨床遠心分離機で30秒間コニカルチューブ。解剖生殖腺がプラスチックに固執するように、ガラスパスツールピペットとコニカルチューブを使用してください。
- 解剖の動物を邪魔しないように注意しながら、上清を除去し、廃棄します。解剖生殖腺に影響を与えないように、解剖顕微鏡下での円錐管から各洗浄後に液体を削除し、その損失を最小限に抑えます。
- 新鮮なパスツールピペットを使用して、コニカルチューブに1×PBS-Tの5 mLを加え。遠心分離機千x gで30秒のための臨床遠心分離機で円錐管。解剖の動物を邪魔しないように注意しながら、上清を除去し、廃棄します。
- 3回の合計を繰り返し手順3.7。
- 新たなパスツールピペットを使用して、100％の2 mLを加えチューブにメタノール、ゆっくりパスツールピペットに引き上げることにより、メタノールで生殖腺を混ぜます。最低1時間-20℃でチューブをインキュベートします。
注：解剖生殖腺はdpERK染色の場合は最大2日間メタノール中で保存することができます。以上の2日間、2週間までのストレージはなく、dpERK抗体と、抗ラミン抗体などの他の抗体染色のアプリケーションと互換性があります。 - 希望のインキュベーション時間の後、生殖腺を洗浄するために3回の合計のためのステップ3.7を繰り返します。洗浄液中にチューブをボルテックスしないでください。最終洗浄後5 mLコニカルチューブに1×PBS-Tの500μLを残します。
- 新たなパスツールピペットを使用して新鮮な1mLのガラス管（×50から6mm mm）の中に円錐形のガラス管の内容物を移します。 10分 - 解剖動物は5のために、重力によって解決することができます。
- 新鮮なパスツールピペットを使用し、解剖顕微鏡下で、1 mLのガラス管のウィットから可能な洗浄の限りを削除解剖生殖腺を乱すハウト。
4.ブロッキングと一次抗体治療
- 1 mLのガラスチューブ内の解剖動物に1×PBS-Tで希釈した30％正常ヤギ血清（NGS）（ 材料表を参照）の100μLを加えます。 30％NGSは、ブロッキングバッファーとして機能します。液体の蒸発を回避するために、パラフィルムでチューブをカバーしています。 1時間または4℃で一晩室温でインキュベートします。
- インキュベーションの所望の期間が経過した後、できるだけ多くの液体を除去、新鮮なパスツールピペットを用いてブロッキング緩衝液を除去します。生殖腺をパスツールピペットでアップ描かれていないことを確認するために解剖顕微鏡を使用してください。
- 30％NGSで400：1で（dpERKとして、この方法で参照される材料の表を参照してください）MAPKYT抗体を希釈します。チューブあたり100μLを使用するのに十分な抗体希釈を準備します。未使用の、希釈した抗体は、週に4℃で保存することができます。
- そのように希釈した抗dpERK抗体の100μLを追加解剖した動物を含む1mLのガラス管にリューション。パラフィルムでチューブを密封します。 4°Cで一晩チューブをインキュベートします。
- 一晩インキュベーションした後、室温で試験管に1×PBSTの800μLを追加します。
- 新鮮なガラスパスツールピペットでサンプルを描画し、生殖腺が均等に1×PBS-T中に懸濁されることを保証するためにそっと放し。生殖腺が重力で底に沈殿してみましょう。上清を取り除きます。これは、解剖生殖腺を洗浄したが、プロセス中に損傷されないようにします。
- 合計3回の洗浄のための4.6 - を繰り返して、4.5を繰り返します。洗浄液中にチューブをボルテックスしないでください。 3回目の洗浄後解剖動物を乱すことなく、できるだけ多くの上清を除去し、廃棄してください。新鮮なパスツールピペットを毎回使用されていることを確認してください。
5.二次抗体治療
- 一次抗体の間、洗浄は二次抗体のための希釈液を準備します。抗マウスSEを希釈1でcondary抗体：30％NGSで500。一次抗体と同様に、チューブあたり100μLを使用します。未使用の抗体は、週に4℃で保存することができます。
- 解剖の動物を含む1 mLのガラス管に100μLの二次抗体溶液を追加します。パラフィルムで各チューブをカバーし、その後、暗闇の中で、管の内容物を維持するためにアルミホイルでチューブを包みます。 2時間、室温で管をインキュベートし、あるいは4℃で一晩。
- インキュベーションの所望の期間が経過した後、チューブに1×PBS-Tの800μLを追加し、繰り返しは4.5手順 - 3回の合計4.6。最終洗浄後、新鮮なパスツールピペットを用いて、解剖顕微鏡下で可能な限り上清をできるだけ多く除去し、廃棄します。
- 二次抗体のための洗浄中にDAPI溶液を調製します。 1×PBST 1mLのIN-（-20℃で保存の1mg / mLのの1,000倍ストックから）DAPIの1μLに希釈します。
- 含有するチューブに希釈したDAPI溶液を800μLを追加解剖した動物。パラフィルムでチューブの口を覆い、アルミ箔で各チューブを包みます。 RTで20分間インキュベートします。
- 解剖の動物を邪魔しないように、DAPIとのインキュベーションの後、解剖顕微鏡下で、新鮮なパスツールピペットでできるだけDAPIソリューションの多くを削除します。
- チューブに取り付け、溶液の1滴を追加します。アルミ箔で各チューブを包みます。
注：dpERK染色を可視化するために、染色された生殖腺は直ちに顕微鏡検査のためにマウントする必要があります。このようなリン酸化セリン10ヒストンH3などの他の抗体の用途については、生殖腺は、暗所で4℃で最大2週間、培地を取り付けるに保つことができます。
6.スライドとイメージングの組み立て
- 図3に見られるように、2つのガラス顕微鏡スライド（25ミリメートル×75ミリメートル×1ミリメートル）の、上に、長さ方向ラボテープの層を配置します。2テーピングスライド間で新鮮なクリーンなガラス顕微鏡スライドを置きます。
注：厚さテープの真ん中のスライド上のアガロースパッドを生成するのに役立ちます。テープは、アガロースパッドを作成するためのスペーサとして機能するようにアガロースパッドの厚さは、テープとほぼ同等です。 - 途中で顕微鏡スライド上にドロップ溶融した2％アガロースの〜200μL（蒸留水で作られました）。迅速アガロース、に垂直な上に、新鮮なきれいなスライドを配置します。
- （ - 2分1）アガロースが固化してみましょう。
- アガロースパッドが破壊されないように、非常に軽くトップ顕微鏡スライドを削除します。アガロースパッドは、上下どちらのスライドに付着したまますることができます。アガロースパッドは限りそれはアガロースの滑らかな表面であるように付着したままスライドしている問題ではありません。
- パスツールピペットを使用してアガロースのパッド上に解剖した動物を移します。解剖顕微鏡下でパスツールピペットを用いてスライドから余分な液体を除去します。
- まつげの毛または細かく描かれたキャピラリーを用いて、生殖腺と腸Aをプッシュスライド上に生殖腺を広げるために、互いに方法。
- 24ミリメートル×50mmのサイズのカバーガラスと顕微鏡スライドをカバーしています。カバースリップをカバースリップとスライドの間に形成されている最小の気泡でスライド上に静かに下げられることを保証するために注意してください。
- 過剰な液体が蒸発すると、生殖腺が（による生殖腺に対するカバーガラスの重量に）やや偏平になることを可能にするスライドボックス中で一晩4℃で保存（平らにスライドを使って、不透明なスライドボックス、アップカバースリップ）。生殖腺のわずかな平坦化は、そうでなければ、ラウンド性腺管の優れたイメージングを可能にします。
- カバーガラスがマウントされると、指でカバースリップの上部に圧力を適用しません。多くの場合、これは生殖腺とdpERK信号の損失の歪みが生じます。
- 唯一のより効果的なイメージングのために一晩生殖腺を平らに。スライドは、すぐに彼らが組み立てられていると見ることができる状態になります。すぐに画像を撮るために、穏やかに吸収カバーガラスとクリーンラボ組織を使用して、コーナーからのスライドの間に過剰な液体。
- 一晩の期間の後、カバースリップとスライド境界の四隅に透明なマニキュアトップコート付きスライドとカバーガラスをシール。マニキュア/カバースリップシールはカバーガラスは、撮像しながら移動していないことを保証し、サンプルの破壊から保護します。
- 画像63Xでの化合物の顕微鏡による生殖腺。しかし、対物レンズと顕微鏡は顕微鏡やユーザアプリケーションの可用性に基づいて変化させることができます。卵母細胞の増殖領域から全体の生殖腺の大きさが一つの画像内に捕捉することができるよりも大きいので、 図4。11-14、18に示すように 、画像が重複する境界とモンタージュとして取られます。
- 多くの場合、限りは大きな変化は、生殖細胞系列の画像に行われないように、最終的なイメージングおよび組立後に死体を編集します。ストアトン「前」組立/編集や画像の組立/編集」の後」の比較を可能にするために組み立てられた画像に沿って彼の生の画像。
注：顕微鏡画像は、モンタージュの組み立て中に信号強度または飽和に変更することはできません。
- 多くの場合、限りは大きな変化は、生殖細胞系列の画像に行われないように、最終的なイメージングおよび組立後に死体を編集します。ストアトン「前」組立/編集や画像の組立/編集」の後」の比較を可能にするために組み立てられた画像に沿って彼の生の画像。
Representative Results
WT成体雌雄同体の動物では、dpERKは、典型的には、中間太糸期領域で、ゾーン1、最も成熟したから-1を介し卵母-4 -5（ゾーン2）で可視化されます。この活性化パターンにおける摂動は、シグナル伝達経路の変更を反映します。女性の生殖系列は精子を指定していない、したがって、これらの図5に表されているゾーン1内の唯一の弱い活性化と、ゾーン2にERKの活性化は表示されません。
図1：C.エレガンス生殖細胞系形態。白線で概説1つのU字型の生殖腺アームを持つ大人の雌雄同体の微分干渉コントラスト（DIC）画像。大人雌雄同体生殖腺は、遠位先端部に有糸分裂細胞が含まれています。有糸分裂細胞が減数分裂前期（太糸期）maturに発展を通じて減数分裂と進捗状況を入力してください近位の生殖腺の電子卵母細胞。大人の雌雄同体生殖腺におけるdpERKのゾーン1とゾーン2マークステレオタイプのローカライズ。スケール：20μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：解剖時の針位置の実証左 ：プロセスにおける解剖の写真。右：ワームを参照して、針位置この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：アガローススライド準備のデモンストレーション。 （A）テープlengthwisを配置2清潔な顕微鏡スライドを横切って電子。示すようにテープで2つのスライドの間に新鮮なきれいな顕微鏡スライドを配置します。 3スライドを縦に隣接している。（B）センター内のスライドにアガロース溶融追加します。（C）は 、アガロースの低下を運ぶ、へ、および中間スライドの上に垂直に新鮮な顕微鏡スライドを配置します。（ D）アガロースが固化することを許可する。（E）固化したアガロースパッドを残してトップのスライドを削除します。解剖し、染色された生殖系列を実装するためのアガロースパッドと底面のスライドを使用してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：DAPI（ トンと野生型の生殖細胞系列のモンタージュモンタージュとしてスライドをイメージングオペアンプ）とdpERK（ 下 ）チャンネル。各パネルのためのパネルBおよびCザDAPIとdpERK画像用パネルAとBと緑のボックスの境界、白い箱を重ねて63Xで撮影された画像は、二つの異なるチャネルで同時に採取しました。組み立てられた画像は図5Aに示されています。スケールバー：20μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：ERKの動的空間的/時間的活性化。 DNA（白B、DAPI、）とdpERKについて染色（AC）WT（N2）成人（開発の24時間過去の中期L4ステージ）両性の生殖系列（C、赤）。ゾーン1、太糸期領域、およびゾーン2、成熟した卵母細胞におけるdpERK信号がハイライト表示されます。（DF）を霧-2（oz40）女性の生殖系列DNA（E、DAPI）とdpERK（F）について染色した（8時間発展の過去の中期L4段階で）。若い女性の生殖系列は、ゾーン1内、および精子に依存しない方法で、単一の卵母細胞に弱いdpERKを表示します。ゾーン2は、精子に依存する、と女性の生殖細胞系列でこのように存在しません。スケールバー：20μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
アクティブERK（dpERK）はCのステレオタイプの空間的および動的局在パターンを次のエレガンス生殖細胞系列。大人C.で、このステレオタイプdpERK空間パターン（ 図5）、および振幅エレガンスの性腺には、効果的にERKの調整多くの生物学的プロセスと相関させることができます。ゾーンで減数分裂の前期における卵母細胞で逮捕中2の結果、精子を指定していない、したがって、成熟した卵母細胞（ 図5）におけるERKを活性化しない女性の生殖系列で観察された表現型をERKを活性化させる。例えば、できないこと。卵成熟と排卵の発症に結合された女性の生殖系列11,13、中ゾーン2でdpERKの効果的な蓄積の男性」の結果と交配。したがって、空間パターンと（例えば、RNA干渉を介した遺伝子不活性化など）特定の遺伝的摂動または化学的処理の際にdpERKの一時的な活性化の分析はのRegu因子の同定を可能にします後半ERKシグナル、したがってERK依存する生物学的プロセス。このような分析はまた、シグナル伝達経路間の小説の遺伝的相互作用の発見を可能にします。
任意の画像ベースの分析のための重要なボトルネックは、アプリケーションに特異的な抗体等の機能性試薬の可用性です。そのような試薬は、次に存在する場合、このような上記のものなどの方法を容易に目的の任意のタンパク質のための局在化パターンの分析のために適合させることができます。アプリケーションは、このような機能抗体の利用可能性によって制限されます。この方法は、所定の発生時に解剖し、染色を記述しているのでさらに、それだけで1時間枠内の情報の取り込みを可能にし、リアルタイムまたはタンパク質の代謝回転率のダイナミクスやタンパク質調節に光を当てるしません。
上記の方法は、フランシスらから適応される。23、Seydouxとダンメートルとは区別されます生殖腺の押出および抗体染色のために24を ethod。フランシスらに基づく方法は 、「懸濁法」と呼ぶことにするとSeydouxとダンの方法は、比較のための"メソッドをクラッキング凍結」と呼ばれます。懸濁法は、本質的に過酷な取り扱い条件に対してより敏感であるようなdpERKなどのシグナル伝達分子の再現性の局在パターンを得るために私たちの手で非常に有効でした。 dpERKローカリゼーションの場合には、私たちの経験では、ゾーン1内の信号は、凍結割れの方法と実質検出不可能です。さらに、多くの場合、凍結割れの方法で発生する可能性がある試料乾燥、スプリアス抗体シグナルの結果。生殖腺は、プロセス全体を通して、液体中に懸濁されているので、懸濁法は、試料の乾燥を最小限に抑えます。我々は、懸濁法は、単一のスライド上に複数の異なる遺伝子型を撮像するために有用であることも見つけます。例えば、雌雄同体のような場合は2つの遺伝子型、 対女性は直接dpERKのローカライズのために比較される、2つの遺伝子型を混合して処理することができます。表現型は別個であり、DAPIの形態を介して識別することができるので、これは可能です。同じスライド上のイメージングに続いて同じチューブ内染色は、異なる遺伝子型から生殖腺間の直接比較を可能にします。 DAPIの形態が識別可能でない場合あるいは、2つの段階の抗体染色を採用することができます。まず、各個々の遺伝子型は、二つの異なる抗体、変異体について、WTおよび抗体Bのための抗体A（両方の抗体がdpERKの抗体とは異なるホストに上昇させる必要がある）で処理されています。 2つの遺伝子型は、一次抗体で染色し、洗浄された後、それらは、1つのチューブ中で一緒に混合することができ、現在チューブ内の全ての抗体を可視化するために二次抗体を処理することにより、dpERK抗体で染色しました。単一のスライド上の異なる遺伝子型を比較する能力、特にときD活性化パターンのeductionsは、明確な染色条件の影響を受けない正確な解釈を確実に行われています。
有利な一方で、慎重な操作を必要と懸濁法全体の複数のステップがあります。解剖は時間効率的な方法で発生することが重要です。重要なのは、切開は、5分間にわたって服用してはいけません。長い解剖時間は、多くの場合、ERKの活性化における規制の変化、としてではなく、技術的な障害と誤解されることができる可変dpERK信号をもたらします。様々な洗浄を通じて生殖腺が簡単に分注誤差による管から失われる可能性がステップため、各解剖のための150の動物 - 100以上で開始することが重要です。生殖腺の損失がいずれかの複数の小さなバッチで解剖することによって低減することが可能に組み合わせることができる（例えば50匹ずつの3つのバッチとして）、または150の一つの大きなバッチを解剖することにより、別の課題は、十分に間隔をあけにあると生殖腺を得ています形成スライド上全体遠位生殖腺を画像化することができるようになっています。これを有効にするには、マッチ棒上まつげや性腺外空間へ引っ張らピペットを使用しています。このプロセスの間に生殖腺を損傷しないようにしかし、注意が必要です。多くの場合、これらの技術では、スライド上に複数の解剖を習得しようとする試みと同様に生殖腺の配置をとります。
この技術は、習得された後、それは多様な生物学的分析のための強力な方法として機能し、単にdpERKレベル以上を研究するために使用することができます。例えば、この方法は、活性p38のレベル、または活性なCDKレベル、または抗体試薬が存在する任意のタンパク質を可視化するために使用することができます。さらに、この方法は、dpERKレベルについてのアッセイを経由して 、経路の新規阻害剤または活性化をアッセイするために動物全体での化学阻害画面と結合することができます。これは、int型があり、任意の阻害剤に対する反応性と感度の両方の生体内における読み出しを可能にしますRTK-RAS-ERKシグナル伝達経路とeract。また、この方法は、すべての使用と同時に可視化することができる複数の信号出力を持つ抗体を組み合わせて使用することができます。複数の抗体を使用して、複数の経路との間の相関を可能にするそれらの活性化状態、およびすべて同じ組織内の成果、これらの相互作用のより良い理解を可能にします。これらはこの方法の更なる用途のほんの一例であるが、このシステムは、複数の研究対象を研究するために修飾することができます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma Inc. | A9539 | Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution |
| Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass because dissected gonads often stick to plastic |
| 25 G needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| Syringes (could be 1 or 5 mL) | BD Syringes | 1 mL: BD 309659 | |
| Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
| Coverslips (24 x 50 mm) | Corning | 2935-245 | |
| 5 mL glass conical tube | Corning | 8060-5 | |
| 9" disposable Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Clinical bench top centrifuge | |||
| Glass tubes (6 x 50 mm) | Fisherbrand | 14-958-A | |
| *M9 solution | |||
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Electron microscopy services | 17500 | Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer |
| 1x PBS-T | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Methanol | Electron microscopy services | 18510 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signaling | 5425 | Diluted to 30% in 1x PBS-T |
| MAPKYT (dpERK) antibody | Sigma Inc. | M9692 | Dilution 1:400 in 30% NGS |
| Secondary antibody | Invitrogen | A-11005 | Dilution 1:500 in 30% NGS |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| *M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. | ||
| **PBS (1x) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L | ||
| Nematode Growth Medium (NGM) | 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. |
References
- Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
- McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
- Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
- Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
- Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
- Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
- Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).
- Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
- Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
- Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
- Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
- Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
- Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
- Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
- Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
- Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
- Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
- Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
- Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
- Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).
