Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi Published: November 29, 2016 doi: 10.3791/54901
Automatic Translation
1, 1,2
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center

Summary

Biz disseke C. aktif ERK mekansal ve zamansal lokalizasyonu için immünofloresan görüntüleme bazlı yöntem mevcut elegans gonad. Burada açıklanan protokol C herhangi bir sinyal görüntülenmesi veya yapısal protein için uyarlanabilir elegans yumurtalık, uygun bir antikor reaktifi kullanılabilir sağladı.

Abstract

RTK-RAS-ERK yolu transducing evrimsel olarak korunmuş ekstraselüler sinyal esas ERK, yolun terminal kinaz aktivasyonu yoluyla çoklu hücresel ve gelişimsel süreçleri kontrol eden önemli bir kinaz-sinyal kaskad olduğunu. ERK aktivitesi sıkı regülasyonu, normal gelişim ve homeostazis için gereklidir; Aşırı hücre çoğalmasında aşırı aktif ERK sonuçları, iken underactive ERK hücre ölümüne neden olmaktadır. C elegans gelişimi sırasında RTK-RAS-ERK sinyal yolunun işlevini ve düzenlenmesini karakterize yardımcı olan güçlü bir model sistemidir. Özellikle, RTK-RAS-ERK yolu C için önemlidir Bu yöntemin odak noktası tohum çizgisi geliştirme elegans. ERK (dpERK) aktif, fosfordan formuna özgü antikorları kullanarak, basmakalıp lokalizasyon desen germline içinde görselleştirilebilir. Bu model hem mekansal ve zamansal controll ÇünküEd, tekrarlanabilir dpERK tahlil yeteneği dpERK sinyal süresini ve genliğini ve dolayısıyla tohum çizgisi gelişimini etkileyen yolunun regülatörleri tanımlamak için faydalıdır. Burada başarılı C. içinde, leke ve görüntü dpERK teşrih nasıl gösterilmektedir elegans gonad. Bu yöntem, C herhangi bir sinyal uzamsal lokalizasyonu veya yapısal protein için uyarlanabilir elegans gonad, immünofloresan ile uyumlu bir antikor kullanılabilir sağladı.

Introduction

Reseptör tirozin kinaz (RTK) -RAt sarkomu (RAS) -Extracellular sinyal Düzenlemeli kinazın (ERK) yolunun ERK 1-3 fosforilasyonu ve aktivasyonu ile sonuçlanır korunmuş bir kinaz grubuyla hücre dışı sinyalleri iletir. ERK protein korunmuş prolin yönelimli bir serin / treonin MAP (Mitojen Aktive Protein) kinaz ailesinin üyeleri, ve doğrudan korunmuş TEY motifinin treonin (T) ve tirosin (Y), ikili fosforilasyon yoluyla MEK ile aktive edilir. (Fosfordan ERK veya dpERK olarak da adlandırılır) etkin bir ERK daha sonra aşağı akışlı substratlann 1-3 bir pilinin fosforilasyonu yoluyla, birçok hücresel ve gelişim prosesleri düzenler. Böylece anormal ERK aktivitesi birçok hücre ve gelişim kusurları 4-7 yol açar.

ERK aktivitesinin sıkı düzenlemeler normal gelişimi için kritik öneme sahiptir: memeli sistemlerinde çok ERK aktivite aşırı hücresel çoğalması lider yol açaronkojenik büyüme; çok az aktivite hücre ölümüne 4,6 yol açar. Buna ek olarak, ERK aktivite süresi değişiklikleri ayrıca ayrı sonuçlara yol açabilir: PC12 hücrelerinde ERK aktivasyonunu 60 dakika ya da daha fazla indükler nöronal farklılaşma 8,9 için 30 dakika ya da daha az indükler hücre proliferasyonu ama ERK aktivasyonu. ERK aktivitesi sıkı regülasyonu bu nedenle normal gelişim ve homeostazis için açık bir şekilde gereklidir.

C. elegans RTK-RAS-ERK sinyal yolunun 3,10-15 işlevini ve düzenlenmesini incelemek için güçlü ve genetik dövülebilir bir model sistemidir. RAS ve ERK, C. için birden genleri içeren memeli sistemlerinde, göreli Bu yolun 3,10-14 işlevini incelemek için bir genetik olarak daha kolay bir sistem render, - elegans bir ras geni (izin-60) ve bir ERK geni (1 MPK) içerir. C. elegans tohum çizgisi esas mitotik oluşan bir borudurproksimal ucunda (Şekil 1) 16 en uzak ucunda hücreleri ve olgun oosit kaynaklanıyor. Germ hücreleri nihayet proksimal bölgede 16 oosit olgunlaşmasını geçiren, döngü bölgedeki oosit oluşmaya başlar ve bundan sonra uzun bir mayoz profaz (pachytene) aracılığıyla sadece uzak mitotik bölgesine yakın ve ilerleme mayoz başlatırlar.

Kendi dahil olmak üzere birçok laboratuarları, genetik çalışmalar, RTK-RAS-ERK yolu C'de germ gelişimi için gerekli olduğunu göstermiştir elegans 12,13,15,17-19. Özellikle, biz bu ERK kontrollerini bulundu ve örneğin oosit büyüme 11,18 olarak biyolojik süreçleri hücre germ hücre apoptosis olarak gelişim anahtarları arasında değişen germ gelişimi sırasında en az dokuz farklı biyolojik süreçleri koordine eder. Çok memeli sistemlerinde, C. çok ERK aktivitesi gibi Çok li iken, birden çok küçük oosit üretiminde germline sonuçlarını elegansbüyük bir oosit 11 ttle aktivitesi ile sonuçlanır. Böylece dpERK sıkı düzenleme, normal germ gelişimi için çok önemlidir. Olgun yeniden çevrim bölgesinde düşük ve yüksek dpERK orta pachytene sırasında yüksek olan (Bölge 1, Şekil 1),: ERK aktif formu, dpERK özgü bir antikor ile görselleştirildiği gibi, basmakalıp bir dinamik bimodal lokalizasyon desenini gösterir oosit (Bölge 2, Şekil 1). Son zamanlarda, beslenme Zone 1 12 ERK etkinleştirmek için İnsülin benzeri Büyüme Faktörü reseptör-1 (Daf-2) ile hareket ettiğini buldum; önce iş (efrin reseptör tirozin kinaz aracılığıyla) sperm sinyali Zone 2 13 ERK aktive olduğunu gösterdi.

germline bir reosta olarak aktif ERK fonksiyonlar dpERK ve oosit büyümesini, mekansal ve zamansal lokalizasyonu yanı sıra genlik düzenleyen göz önüne alındığında, normal sinyal sonuçlarını anlamak için anahtardır. Burada tarif edilen yöntem kullanılarak değişiklikleridpERK basmakalıp lokalizasyonu kolaylıkla izlenebilir ve tahminler ERK aktivitesi ve dolayısıyla fonksiyonu, çevresel veya genetik tedirginlikler etkisi üzerine türetilen. Böylece, dpERK için tahlil germline gelişimi sırasında rolünü kapsamlı bir anlayış sağlar.

Protocol

Burada açıklanan protokol omurgasız bir model sistem C için öncelikle elegans ve kurum tarafından belirlenen tüm etik kuralları takip eder.

1. Hayvan Bakım

  1. C koruyun E. ile tohumlanan agar nematodu Büyüme Ortamı 20,21 (NGM, bkz Malzeme Tablosu) hisse senedi kültürleri çalışan elegans E. coli OP50.
  2. 16 ° C ve 25 ° C arası bir sıcaklıkta solucan stokları koruyun.
    NOT: genellikle hızlı büyüme oranı, anormal germ geliştirme ve alt kuluçka boyutlarda yüksek sıcaklıklar sonuçlara solucanlar kültüre. Ayrıca, ısıya duyarlı genotip farklı sıcaklıklarda farklı fenotipleri gösterecektir.
  3. besili solucanlar sabit bir kaynağı sağlamak amacıyla büyüme oranına bağlı 3 gün - her 2 yeni NGM plakalar solucanlar aktarın.
    NOT: dpERK seviyelerini kapsayan herhangi bir deney için, solucanlar bir hasret veya kalabalık elde olmaMAlıdıred plaka. Kalabalık ya da açlık etkileri insülin solucanlar 22 sinyalizasyon ve insülin sinyal ERK 12 aktivitesini düzenler. Böylece açlıktan veya kalabalık plakalardan solucanlar değişken ve zor Yeniden boyanma neden olacaktır.

Gonadlar Elde Yetişkin Worms 2. Diseksiyon

  1. 150 WT (N2) ya da bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde M9 tampon 100 uL arzu edilen ve belirli bir gelişim aşamasında (L1, L2, L3, L4, yetişkin vb.) Solucanlar istenen genotip - 100 al.
  2. M9 tampon 900 mcL ependorf tüp doldurun (Malzeme Tablo). çevre sıcaklığında 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 1000 x g'de santrifüjleyin tüpler.
  3. Yavaşça M9 tampon 900 mcL çıkarın ve atın. solucanlar kazara kaldırılmaz emin olmak için bir mikroskop altında tamponu çıkarın.
  4. Taze M9 ile 2.3 iki kez daha her zaman tampon - yineleyin 2.2 adımları.Bu solucanlar üzerinde gerçekleştirilmiştir bir bakteri için etkili yıkanır sağlar.
  5. Son yıkamadan sonra tüp ve ıskarta gelen M9 tampon 900 mcL çıkarın.
  6. düz dipli cam izle çanak 200 ul-mikropipet ucu ile 150 solucanlar - 100 içeren kalan 100 uL M9 tampon aktarın. Mikropipet ucu kullanılmadan önce 10 uL işaretine kesilmiş olduğundan emin olun. ucu solucanlar makaslama neden olur kesme değil.
  7. M9 tampon solucanları içeren cam izle çanak 0.1 M levamisolün 3 mcL - 1 ekleyin. Yavaşça solucanlar hareketli durdurana kadar karıştırma bile etkinleştirmek için levamizol ve M9 girdap.
    NOT: Levamisole stokları, uzun süreli depolama için -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Hayvanlarda hareket hızla kaybolmasına elde etmek amacıyla levamizol 0.25 mM - 0.2 arasında, literatürde 23'te tarif edilmiştir ne 3 mm'den - Al, 1 daha yüksek konsantrasyonda kullanmak. Hayvanlar da l etrafında soymak halindeOng sıvı süspansiyon olarak, yumurtalıklarda dpERK elde edilen desenler (stres veya beslenme ya da her ikisi olmaması) değişken olabilir. diseksiyon için 3 mM levamizol - Daha tekrarlanabilir boyanma 1 ile elde edilmiştir.
  8. İki 1 ml şırınga (iğne göstergesi kritik önemi yoktur şırınga boyutu) iki 25 G iğne takın. Her el pozisyonu bir şırınga (Şekil 2).
  9. Şekil 2'de görüldüğü gibi bir mikroskop altında altında ve her solucan üzerinde her iğne yerleştirin ve bir makas hareketi ikinci faringeal ampul yakın solucan ince bir kesim yerleştirin. çanak tüm hayvanlar en az bir kez kesilmiş kadar solucan bir kesintisinden sonra bir sonraki hayvana hareket.
    NOT: - 2.9 Zaman duyarlı 2.8 adımları dikkatli olun. tekrarlanabilir dpERK desen için beş dakika altında çanak tüm solucanları teşrih. Daha uzun diseksiyon süreleri özellikle Z, dpERK sinyalinin kapalı bir dönüm neden olacaktırbir 1. ayrılan zaman dilimi içinde kalmak diseksiyon (yani, 50 solucanlar vs 150) gerekirse tur başına solucan sayısını ayarlayın.
    1. durumunda bir ekstrüde gonad diseksiyonu sırasında, aynı hayvanda başka kesim girişimi yok görünür değil. Genellikle sadece hayvan kesme ve gonad ekstrüzyon neden olmaz. Bunun yerine, bir sonraki hayvana geçmek. a'ya yok gonadlar 6. bölümde yapılacak ve görüntüleme sırasında göz ardı edilebilir slaytlar üzerinde gibi görünecektir solucanlar
      NOT: Diseksiyon ve işleme tüm adımları sayesinde, gonad beden / karkas bağlı kalacaktır akılda tutmak önemlidir. gonad ve dışında iğne ile vücuda zorlamayın. vücuttan gonad ayırmak için bir girişim Genellikle gonadal dokuda anormal bir gözyaşı sahte antikor sinyali neden olabilir. beden / karkas görüntüleme adımları (bölüm 6) sırasında göz ardı edilebilir, ve sadece gonad görüntülenmiş. Buna ek olarak, SOmbağırsak hücreleri de antikor tahlil için de olsa iç kontroller / somatik kontrolleri hizmet edebilir etimes.

3. Gonad Fixation

  1. Diseksiyon tamamlandıktan sonra, M9, 100 uL içeren cam takip çanak ve çıkartılan hayvanlara doğrudan% 3 paraformaldehit (PFA) 2 ml ilave edilir ve Parafilm ile kaplayın. Kimyasal bir davlumbaz kaplı izle cam tabak yerleştirin.
    Dikkat: PFA tehlikeli bir kimyasaldır. Bu durumda, sabitleme kimyasal davlumbaz yapılmalıdır.
  2. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. Tek kullanımlık 9 "cam Pasteur pipeti kullanarak disseke hayvanların bulunduğu izle cam tabak 3 ml 1x PBS-T (bkz Malzeme Tablo) ekleyin. Mix Pasteur içine disseke hayvanlarla PFA çözüm ve 1x PBS-T çizerek pipet ve yavaşça izle cam tabak içine serbest. yıkama sırasında vorteks tüpleri etmeyin.
  4. Bir frekansları kullanansh cam Pasteur pipeti Pasteur pipeti içine izle cam tabak 5 (disseke solucanları içeren, PFA ve 1x PBS-T) sıvı ml çizin ve taze bir 5 ml cam konik tüp içine içeriğini aktarmak.
  5. Santrifüj 1,000 x g'de bir klinik santrifüj cihazında 30 saniye boyunca konik boru. cam Pasteur pipetler ve konik tüpler kullanın olarak disseke gonadlar plastik sopa.
  6. Çıkarın ve disseke hayvanların rahatsız etmeyecek şekilde özen süpernatant atın. parçalara gonadlar etkiler olmayacak şekilde bir mikroskop altında konik tüp, her bir yıkamadan sonra sıvı çıkarın ve bunların kaybını en aza indirir.
  7. taze Pasteur pipeti kullanarak, konik tüplere 5 ml 1x PBS-T ekleyin. Santrifüj 1,000 x g'de 30 saniye boyunca bir klinik santrifüj konik tüp. Çıkarın ve disseke hayvanların rahatsız etmeyecek şekilde özen süpernatant atın.
  8. üç kez olmak üzere toplam için yineleyin 3.7.
  9. taze bir Pasteur pipeti kullanılarak,% 100 2 mL ekleyintüplere metanol ve yavaşça Pasteur pipeti içine çizerek metanol ile gonadlar karıştırın. 1 saat en az 20 ° C 'de tüp inkübe edin.
    Not: Dissected gonadlar dpERK boyama için en fazla 2 gün boyunca metanol içinde saklanabilir. en fazla 2 gün 2 hafta kadar depolama ancak dpERK antikoru ile anti-Lamin antikoru gibi antikor boyama uygulamalar ile uyumludur.
  10. İstenilen kuluçka süresinden sonra, gonadlar yıkamak için üç kez olmak üzere toplam adım 3.7 tekrarlayın. yıkama sırasında vorteks tüpleri yok. Son yıkamadan sonra 5 ml konik bir tüp içinde 1 x PBS-T 500 uL bırakın.
  11. Taze Pasteur pipeti taze bir 1 ml cam tüp (6 mm x 50 mm) içine konik cam tüp içeriğini aktarmak kullanma. 10 dakika - disseke hayvanların 5 için yerçekimi ile yerleşmek için izin verin.
  12. taze bir Pasteur pipeti kullanılarak ve mikroskop altında, 1 ml cam borular WIT mümkün yıkama kadar kaldırmahout disseke gonadlar rahatsız.

4. Bloklama ve birincil antikor tedavisi

  1. % 30 100 uL 1x PBS-T ile inceltilmiş normal keçi serumu (NGS); 1 ml cam tüplerde parçalara hayvanlara (Malzeme Tablo). % 30 NGS engelleme tampon görevi görür. sıvının buharlaşmasını önlemek için Parafilm ile tüp örtün. 1 saat ya da gece boyunca 4 ° C'de oda sıcaklığında inkübe edin.
  2. inkübasyon istenen süreden sonra, mümkün olduğu kadar çok sıvıyı, taze bir Pasteur pipeti kullanılarak Bloklama tamponunu çıkarın. gonadlar Pasteur pipeti olarak hazırlanan emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
  3. % 30 NGS 400: 1'de (dpERK olarak bu yöntemde anılan malzemeler Tablo, bakınız) MAPKYT antikor sulandırmak. tüp başına 100 uL kullanmak için yeterli antikor seyreltme hazırlayın. Kullanılmayan seyreltilmiş antikor, bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
  4. seyreltilmiş anti-dpERK antikoru 100 mcL yüzdendisseke hayvanların bulunduğu 1 mL cam tüplere dökülmesinden. Parafilm ile tüpler mühür. 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin.
  5. Gece boyunca inkübasyondan sonra, oda sıcaklığında tüplere 1x PBST 800 uL ekleyin.
  6. taze cam Pasteur pipeti numune çizin ve gonadlar eşit 1x PBS-T içinde süspanse olmasını sağlamak için hafifçe bırakın. gonadlar yerçekimi ile dibe edelim. süpernatantı. Bu disseke gonadlar yıkanmış ancak işlem sırasında hasar görmemesi sağlar.
  7. Üç yıkar toplam 4.6 - Tekrar 4.5 adımları. yıkama sırasında vorteks tüpleri yok. Üçüncü yıkamadan sonra çıkarın ve disseke hayvanların bozmadan mümkün olduğunca süpernatant atın emin olun. Taze Pasteur pipeti her zaman kullanıldığından emin olun.

5. ikincil antikor tedavisi

  1. primer antikor sırasında yıkar ikincil antikor için seyreltme hazırlamak. Anti-fare sulandırmak se1 de condary antikor: 500% 30 NGS. Primer antikor gibi, tüp başına 100 uL kullanın. Kullanılmayan antikor, bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
  2. disseke hayvanların bulunduğu 1 mL cam tüplere 100 uL ikincil antikor çözüm ekleyin. Parafilm ile her tüp Kapak ve karanlıkta tüp içeriğini korumak için alüminyum folyo ile tüpler sarın. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, ya da seçenek olarak bir gece boyunca 4 ° C 'de.
  3. inkübasyon istenen süreden sonra, tüpler 1 x PBS-T 800 ul ekleyin ve tekrar 4.5 adım - üç kez olmak üzere toplam 4.6. Son yıkamadan sonra, kaldırma ve yeni bir Pasteur pipeti kullanılarak bir mikroskop altında mümkün olduğu süpernatant kadar atın.
  4. sekonder antikor için yıkama sırasında DAPI çözeltisi hazırlayın. 1x PBST 1 mL in (-20 ° C'de saklanan 1 mg / ml'lik bir 1,000x stoktan) DAPI 1 uL seyreltilir.
  5. içeren tüplere seyreltildi DAPI çözeltisinin 800 mcLDissected hayvanlar. Parafilm ile tüp ağız Kapak ve alüminyum folyo ile her tüp sarın. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  6. parçalara hayvanlar rahatsız etmemek için DAPI ile inkübe edildikten sonra, bir mikroskop altında, yeni bir Pasteur pipeti ile mümkün olduğu DAPI çözeltisinin kadar çıkarın.
  7. tüplere montaj çözümü 1 damla ekleyin. alüminyum folyo her tüp sarın.
    NOT: dpERK boyama görselleştirmek için, lekeli gonadlar hemen mikroskopi için monte edilmelidir. Bu fosforlu serin 10 Histon H3 gibi antikor uygulamalar için, gonadlar, karanlıkta 4 ° C'de en fazla 2 hafta içinde ortam montaj tutulabilir.

6. Montaj Slaytlar ve Görüntüleme

  1. . Şekil 3'te görüldüğü gibi iki cam mikroskop lamı (25 mm x 75 mm x 1 mm), üstünde, uzunlamasına laboratuvar bant katmanı yerleştirin iki bantlanmış slaytlar arasında taze bir temiz bir cam mikroskop lamı yerleştirin.
    NOT: kalınlıkbandın orta slaytta bir agaroz ped oluşturmanıza yardımcı olur. Bant agaroz ped oluşturmak için bir ara parçası olarak hizmet olarak agaroz pedin kalınlığı, bandın edilene hemen hemen eşittir.
  2. orta mikroskop lamı üzerine damla erimiş% 2 agaroz ~ 200 uL (damıtılmış su içinde yapılan). Hızla Agaroz, dik ve üstünde, bir taze, temiz bir slayt yerleştirin.
  3. (- 2 dk 1) agaroz katılaşmaya edelim.
  4. agaroz ped yok edilmez şekilde, çok yavaşça üst mikroskop lamı çıkarın. agaroz ped üst veya alt slayt ya bağlı kalabilir. Agaroz pedi sürece agaroz pürüzsüz bir yüzey olarak, bağlı kalır slayt önemi yoktur.
  5. Pasteur pipet agaroz ped üzerine disseke hayvanların aktarmak kullanma. bir mikroskop altında bir Pasteur pipeti kullanarak slayt herhangi bir aşırı sıvı çıkarın.
  6. gonadlar ve bağırsaklar a itmek, bir kirpik saç veya ince çekilmiş kılcal kullanarakslayt gonadlar yaymak amacıyla birbirinden yolu.
  7. 24 mm x 50 mm boyut lamel ile bir mikroskop lamı örtün. lamel minimum hava kabarcıkları lamel ve slayt arasında oluşmakta olan ile slayt üzerine hafifçe düşürdü olduğundan emin olmak için özen gösterin.
  8. Bir slayt kutusunda bir gecede 4 ° C (slaytlar kadar lamel, düz yatan bir opak slayt kutusu) saklayın fazla sıvı buharlaşmasına ve gonadlar (nedeniyle gonadlar üzerinde lamel ağırlığına) biraz basık olmasına izin. gonadlar hafif düzleşme bir başka yuvarlak gonadal tüpün daha iyi görüntüleme için izin verir.
    1. lamel monte edildikten sonra, parmaklarınızla lamel üstüne baskı uygulamak için yok. Genellikle bu gonadlar ve dpERK sinyal kaybı bozulmasına neden olur.
    2. Sadece daha etkili görüntüleme için bir gecede gonadlar dümdüz. slaytlar kısa sürede de monte edilir olarak görülebilir hazırdır. Hemen fotoğraf çekmek için, yavaşça absorbelamel ve temiz bir laboratuar dokusu kullanılarak köşelerinden slayt arasındaki aşırı sıvı.
  9. Gecede bir süre sonra, slayt mühür ve lamel ve slayt sınır dört köşesinde şeffaf oje pardesü ile lamel. oje / lamel mühür lamel görüntüleme sırasında hareket etmez sağlar ve numunelerin yıkımına karşı korur.
  10. Görüntü 63x bir bileşik mikroskop ile gonadlar. Ancak objektif lens ve mikroskop mikroskop ve kullanıcı uygulamanın durumuna göre değiştirilebilir. Oosit proliferatif bölgeden tüm gonad büyüklüğü bir görüntüde yakalanabilir daha büyük olduğundan, Şekil 4. 11-14, 18 gösterildiği gibi, görüntüler örtüşen sınırları olan bir montaj olarak alınır.
    1. Birçok durumda, sürece hiçbir büyük değişiklikler germlin görüntüye yapılır olarak, son görüntüleme ve montajdan sonra karkas düzenleyin. Mağaza tmonte görüntünün boyunca o ham görüntüleri 'önce' montaj / düzenleme karşılaştırma ve görüntülerin montaj 'sonra' / düzenleme sağlamaktır.
      NOT: mikroskobu görüntüleri montaj montajı sırasında sinyal gücüne veya doygunluk için değiştirilmemelidir.

Representative Results

WT yetişkin Hermaphroditic hayvanlarda, dpERK genellikle (Bölge 2) -4 veya -5 yoluyla orta pachytene bölgesi, Zone 1, ve -1 en olgun oosit görüntülenmiştir. Bu aktivasyon desen tedirginlikler sinyal yolunun değişiklikleri yansıtır. Kadın tohum çizgileri Bunlar Şekil 5'de temsil edilmektedir Bölgesinde 1'de sadece zayıf aktivasyon ile, Bölge 2 ERK aktivasyonu göstermez dolayısıyla sperm belirtin ve yoktur.

Şekil 1
Şekil 1: C. elegans germline Morfoloji. beyaz çizgi ile özetlenen bir U-şekilli gonad kolu olan yetişkin bir hermafrodit Diferansiyel Girişim kontrast (DIC) görüntü. yetişkin Hermaphroditic gonad uzak ucunda mitoz hücre içerir. mitotik hücreler mayoz profaz (pachytene) Matur içine geliştirerek mayoz ve ilerleme girmekProksimal gonad e oosit. Bir yetişkin Hermaphroditic gonad dpERK Zone 1 ve Bölge 2 işareti basmakalıp yerelleştirme. Ölçek:. 20 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: diseksiyonlar sırasında İğne Pozisyonlar gösterilmesi Sol:. Sürecinde diseksiyon Fotoğraf. Sağ:. Solucan atıfla İğne pozisyonları bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Agaroz Slayt Hazırlama gösterilmesi. (A) Bir şerit lengthwis yerleştirin2 temiz mikroskop lamı üzerinde e. gösterildiği gibi bant ile iki slaytlar arasında taze, temiz bir mikroskop lamı yerleştirin. Üç slaytlar merkezinde slayt agaroz erimiş Ekle birbirlerine uzunlamasına. (B) yanındadır. (C) agaroz damla taşıyan, dik taze bir mikroskop lamı yerleştirin ve orta slayt, üstüne. ( D) agaroz katılaşmaya bekleyin. (E) katılaşmış agaroz pad geride bırakarak üst slayt çıkarın. Disseke ve lekeli montaj tohum çizgileri için agaroz pad ile alt slayt kullanın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. DAPI ile vahşi bir germline bir Montaj Montage olarak Slaytlar (t Görüntülemeop) ve dpERK (alt) kanal. Görüntüler sınırları örtüşen 63x alındığı panel A ve B her panel için panel B ve C. DAPI ve dpERK görüntüler için yeşil kutuları için beyaz kutular iki farklı kanallarda aynı anda alındı. Birleştirilmiş görüntü Şekil 5A'da gösterilmiştir. Ölçek çubuğu:. 20 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: Dinamik Temporal ERK / Mekansal aktivasyonu. DNA (beyaz B, DAPI) ve dpERK için lekeli (AC) WT (N2) yetişkin (gelişme 24 saat geçmiş orta-L4 sahne) hermafrodit tohum çizgileri (C, kırmızı). Zone 1, pachytene bölge ve Zone 2, olgun oosit içinde dpERK sinyali vurgulanır. (DF)sis-2 (oz40) dişi tohum çizgileri DNA (E DAPI) ve dpERK (F) için boyandı (8 saat gelişim geçmiş orta-L4 aşamada). Genç kadın tohum çizgileri Zone 1 zayıf dpERK görüntülemek ve sperm bağımsız bir şekilde tek bir oosit içinde. Bölge 2 sperm bağımlı ve kadın germline böylece yoktur. Ölçek çubuğu:. 20 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Aktif ERK (dpERK) C. klişeleşmiş mekansal ve dinamik yerelleştirme yol izler elegans germline. Bir yetişkin C. Bu kalıplaşmış dpERK mekansal desen (Şekil 5) ve genlik elegans gonad etkili ERK düzenleyen birçok biyolojik süreçleri ile ilişkili olabilir. Örneğin, bir yetersizlik mayoz olgun oosit içinde ERK aktive yok böylece (Şekil 5) sperm belirtin ve yok dişi tohum çizgileri gözlenen bir fenotip profaz Bölgesinde oosit bir tutuklama 2 sonuç ERK etkinleştirmek için. Oosit olgunlaşması ve ovulasyon başlangıcı ile birleştiğinde kadın tohum çizgileri 11,13 yılında Bölge 2 dpERK etkin birikimi, içinde erkeklerin sonuçları ile çiftleşme. Böylece uzamsal desen ve (örneğin, RNA interferans aracılı gen inaktivasyonu gibi) bazı genetik pertürbasyonlar veya kimyasal muamelelerine dpERK zamansal aktivasyonunun analizi REGU faktörlerin tanımlanması için izin verirGeç ERK sinyal ve böylece ERK bağımlı biyolojik süreçler. Bu tür analizler de sinyal yolları arasındaki yeni genetik etkileşimler keşfini sağlar.

Herhangi bir görüntüleme bazlı analiz için kritik bir darboğaz gibi uygulamaya özgü antikorlar gibi fonksiyonel reaktifler mevcudiyetidir. Böyle bir ajan bu mevcutsa, yukarıda tarif edilen gibi yöntemler istenilen herhangi bir protein için yeri modeli analizi için adapte edilebilir. Uygulama böylece işleyen bir antikorun mevcudiyeti ile sınırlıdır. yöntem, belirli bir gelişimsel anda diseksiyon ve boyama açıklar çünkü Ayrıca, sadece bir zaman diliminde bilgi yakalanmasını mümkün kılar, ve gerçek zamanlı ya da protein ciro oranı dinamikleri veya protein düzenleme ışık tutmamaktadır.

Yukarıda tarif edilen yöntem, Francis ve arkadaşları uyarlanmıştır. 23, Seydoux Dunn m ayrıdıryumurtalık ekstrüzyon ve antikor boyama için 24 METOT. Francis ve ark dayalı yöntem. "Süspansiyon metodu" ve "çatlama dondurmak yöntemi" karşılaştırma için çağırdı Seydoux ve Dunn yöntemi çağrılır. Süspansiyon yöntemi doğal olarak sert taşıma koşullarına daha duyarlı gibi dpERK olarak sinyal molekülleri, tekrarlanabilir yerelleştirme kalıplarını elde etmek için elimizde çok etkili olmuştur. dpERK lokalizasyonu durumunda, bizim deneyim, Zone 1 sinyal dondurma çatlama yöntemi ile neredeyse mümkün değildir. Ayrıca, sık sık donma çatlama yöntemi ile oluşabilir örnek kurutma, sahte antikor sinyaller sonuçlanır. gonadlar işlem boyunca sıvı içinde süspansiyon haline getirilmiş çünkü süspansiyon yöntemi, örnek kurutma en aza indirir. Ayrıca süspansiyon yöntemi, tek bir sürgü üzerinde birden fazla farklı genotipleri enezin bulmak. Örneğin, çift cinsiyetli olarak eğer iki genotipleri, vskadın doğrudan dpERK lokalizasyonu için karşılaştırıldığında, önemli farklılıklar karıştırılır ve işlenebilir edilecektir. Fenotipleri farklıdır ve DAPI morfolojileri yoluyla ayırt edilebilir, çünkü bu mümkündür. Aynı slaytta görüntüleme ile takip aynı tüp boyama farklı genotip gelen gonadlar arasında doğrudan karşılaştırma için izin verir. DAPI morfolojileri ayırt edilemez, alternatif olarak, daha sonra iki aşamalı bir antikor boyama benimsenebilir. İlk olarak, her bir genotip, iki farklı antikor ile muamele edilir, mutant için WT ve antikor B ANTİKOR A (her iki antikorun dpERK antikordan farklı bir konakçıda yükseltilmiş olması gerekir). İki genotipleri birincil antikor ile boyanmış ve yıkanmış sonra, tek bir tüp içinde bir araya karıştırılabilir ve artık borunun tüm antikorlar görselleştirmek için bir ikincil antikor tedavisi, ardından dpERK antikor ile boyandı. d zaman bir yetenek özellikle tek bir slayt üzerinde farklı genotipleri karşılaştırmak içinaktivasyon desenleri eductions farklı boyama koşullarından etkilenmeyen doğru yorumlarda sağlar yapılıyor.

avantajlı olsa da, dikkatli manipülasyon gerektiren süspansiyon yönteminin boyunca birden fazla adımlar vardır. Diseksiyonları bir anda verimli şekilde meydana kritik olduğunu; Daha da önemlisi, diseksiyonlar üzerinde 5 dakika almamalıdır. Daha uzun diseksiyon süreleri genellikle ERK aktivasyon düzenlenen değişikliklerin yerine teknik arızalar olarak yanlış olabilir değişken dpERK sinyali, sonuçlanır. Çünkü çeşitli yıkama gonadlar kolayca pipetleme hataları nedeniyle tüplerden kaybetmiş olabilir adımlar boyunca her diseksiyon için 150 hayvanlar - 100 aşkın ile başlamak çok önemlidir. gonadlar kaybı ya birden fazla küçük gruplar halinde diseksiyon azaltılabilir kombine edilebilir (örneğin 50 hayvanların her üç seri olarak), ya da 150 bir büyük toplu diseksiyon ile diğer zorluk iyi aralıklı yalan gonadlar oluyor oluşumslayt böylece tüm uzak gonad görüntülü olabilir. Bunu sağlamak için, bir kibrit çöpü ya da gonadlar dışarı alana çekti pipet üzerinde bir kirpik kullanırlar. Bu işlem sırasında gonadlar zarar vermemek için Bununla birlikte, dikkat edilmesi gerekir. Genellikle bu teknikler ile bu Slaytlarınıza birden diseksiyonu master girişimleri yanı sıra gonad düzenlemeleri alır.

Bu teknik, hakim olmuştur sonra, çeşitli biyolojik analizler için güçlü bir yöntem sunar ve sadece dpERK seviyeleri daha çalışma için kullanılabilir. Örneğin bu yöntem, aktif p38 seviyeleri, ya da aktif CDK seviyeleri, ya da bir antikor reaktifi mevcut olduğu herhangi bir protein görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Buna ek olarak, yöntem dpERK seviyeleri açısından tahlil ile, yeni inhibitörleri veya yolunun aktivatörler için tahlil bütün hayvanlarda kimyasal inhibisyon ekran ile akuple edilebilir. Bu int herhangi inhibitörleri her iki reaksiyon ve duyarlılık in vivo okuma sağlayacaktırRTK-RAS-ERK sinyal yolağı ile eract. Dahası, bu yöntem, kullanılan tüm ve bir anda görselleştirilebilir çoklu sinyal çıkışları ile antikor kombinasyon halinde kullanılabilir. Birden antikorları kullanarak birden yollar, onların aktivasyon durumu arasındaki ilişkiyi sağlar ve bu etkileşimlerin daha iyi anlaşılmasını sağlayan, aynı doku içinde sonuçlarının. Bunlar, bu yöntemin bundan başka uygulamalar sadece birkaç örnektir ancak bu sistem çok araştırma alanları incelemek için modifiye edilebilir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Inc. A9539 Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution
Flat bottom glass watch dish Agar Scientific AGL4161 We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles BD PrecisionGlide 305122
Syringes (could be 1 or 5 mL) BD Syringes 1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisherbrand 12-550-343
Coverslips (24 x 50 mm) Corning 2935-245
5 mL glass conical tube Corning 8060-5
9" disposable Pasteur pipette Fisherbrand 13-678-20D
Clinical bench top centrifuge
Glass  tubes (6 x 50 mm) Fisherbrand 14-958-A
*M9 solution
Levamisole Sigma L9756
3% Paraformaldehyde (PFA) Electron microscopy services 17500 Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer
1x PBS-T 1x PBS with 0.1% Tween 20
Methanol Electron microscopy services 18510
Normal goat serum (NGS) Cell Signaling 5425 Diluted to 30% in 1x PBS-T
MAPKYT (dpERK) antibody  Sigma Inc. M9692 Dilution 1:400 in 30% NGS
Secondary antibody Invitrogen A-11005 Dilution 1:500 in 30% NGS
DAPI Sigma D9542
Vectashield Vector Labs H-1000
*M9 Buffer Recipe 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. 
**PBS (1x) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L
Nematode Growth Medium (NGM) 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
  2. McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
  3. Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
  4. Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
  5. Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
  6. Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
  7. Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).
  8. Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
  10. Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
  11. Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
  12. Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
  13. Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
  14. Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
  15. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
  16. Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
  17. Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
  18. Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
  19. Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
  20. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
  23. Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
  24. Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 117 RAS-ERK, Tohum çizgisi, immünofloresan sinyal proteinleri
Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial… More

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter