Introduction
力敏感，遗传编码的FRET传感器最近出现的用于在活细胞中测量基于拉伸力，提供深入了解的机械力跨蛋白1，2，3，4施加的重要工具。有了这些工具，研究人员能够以非侵入性图像内的力量在使用传统的荧光显微镜的活细胞。这些传感器由通过弹性肽3分离的FRET对（供体和受体荧光蛋白，最频繁蓝色供体和黄色受体）的。在对比C-或N-末端标记，该传感器被插入到测量跨蛋白质传递的机械力的蛋白质的内部位点，表现为一个分子应变计。增加跨越传感器的结果的机械张力在FRET-P之间的距离增加空气，导致降低FRET 3。其结果是，该FRET是负相关的拉伸力。
这些基于荧光的传感器已被用于粘着斑蛋白（纽蛋白3和踝蛋白4），细胞骨架蛋白（α辅肌动蛋白5），和细胞-细胞连接蛋白显影（E-钙粘蛋白6，7，VE-钙粘蛋白8，和PECAM 8）。在这些生物传感器中最常用的和充分表征的弹性连接体被称为TSmod和由40个氨基酸，（GPGGA）8，其从所述蜘蛛丝蛋白衍生鞭的重复序列组成。 TSmod已经显示出表现为线性弹性纳米弹簧，与FRET响应要求1至拉伸力3 5对-N。鞭状的不同长度可以被用于改变所述动态řTSmod FRET力灵敏度9的安格。除了鞭状，血影蛋白重复5和绒毛头戴受话器肽（称为HP35）4已被用作在类似力的生物传感器4 FRET对之间的弹性的肽。最后，最近的一份报告显示，TSmod也可用于检测压缩力10。
我们最近开发了用于细胞核-细胞骨架（LINC）复合蛋白Nesprin2G的接头的力传感器，通过使用TSmod插入称为迷你Nesprin2G（ 图2C），其行为类似于内源性一个先前开发的截短的蛋白Nesprin2G Nesprin-2G 11。在LINC复杂包含了从外面导致细胞核内，连接细胞质细胞骨架的核纤层的多种蛋白质。 Nesprin-2G是结构蛋白结合到两个肌动蛋白骨架在细胞质和核周空间SUN蛋白质。使用我们的生物传感器，我们能够证明Nesprin-2G是受制于NIH3T3成纤维细胞肌动球蛋白2依赖紧张。这是第一次力在核LINC复杂的跨蛋白直接测量，它很可能成为了解力在力学生物学的核心作用的重要工具。
下面的协议提供的如何使用Nesprin-2G力传感器，包括在哺乳动物细胞中Nesprin张力传感器（Nesprin-TS）的表达Nesprin-细胞的FRET图像的表达，以及采集和分析了详细的方法TS。使用配备有光谱检测器的倒共焦显微镜，如何测量敏化发射的描述使用FRET光谱分离，并设置比例FRET成像。输出比率的图像可以被用来制造相对QUAntitative力比较。虽然该协议的重点是Nesprin-TS的成纤维细胞中的表达，这是很容易适应其它哺乳动物细胞，包括细胞系和原代细胞。此外，该协议，因为它涉及到图像采集和分析FRET可以容易地适用于已经被用于其它蛋白开发了其他基于FRET的力生物传感器。
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Protocol
1.获取Nesprin-2G传感器DNA和其它质粒DNA
- 从商业来源获得Nesprin-2G TS（张力传感器），Nesprin-2G HL（无头）控制，mTFP1，金星和TSmod。传播的所有DNA的质粒，并使用标准的大肠杆菌菌株，如DH5-α，净化他们如先前12,13说明。
2.转染细胞与Nesprin-2G和其它质粒DNA
- 生长NIH 3T3成纤维细胞的细胞至70-90％铺满在6孔细胞培养皿中在标准的细胞培养培养箱中温（37℃）和CO 2（5％）调节。对于细胞生长培养基，用Dulbecco氏补充有10％胎牛血清的改良的Eagle培养基（DMEM）。
- 在细胞培养罩，除去培养基并用约1mL降低血清细胞培养基冲洗每一个孔。添加降低血清细胞培养基中的800μL到每个孔并放置在培养箱中在6孔腔。
- 吸移管700降低血清细胞培养基到1.5mL管中的脂质载体溶液35μL的μL以形成“lipomix”。通过移液混合。标记管具有“L”。
- 收集6个的1.5mL管中并标记它们1到6吸取100μL的降低血清细胞培养基到每个管中。
- 从步骤1中，移液管2 Nesprin 2G-TS的微克使用质粒DNA的浓度成管1和2。移液器2 Nesprin-HL的微克到管中3和4移取1 MTFP的微克到管5移液器1微克mVenus的入管6吹打不同类型的DNA时，不要再使用移液管尖端。
- 移液管将100μL从“L”管到每个标记的管（1-6）的lipomix的，并通过反复吹打混匀。使用干净的吸管每个管。孵育10-20分钟。
- 从每个标记的管加入200微升到井在6孔室具有70-90％汇合的细胞。标签的每个井的顶部与相应的DNA溶液。放置6孔室在4-6 h的培养箱中。
- 吸出介质，并添加减少的血清细胞培养基中的1-2毫升冲洗。吸出降低血清细胞培养基，加入胰蛋白酶的2 mL至每个孔中，并将其放置在6孔培养皿在培养箱（5-15分钟）。
- 虽然细胞在培养箱中分离，涂层6玻璃底在溶解于磷酸盐缓冲盐水（PBS）20微克/毫升的浓度与纤连蛋白的一个层观看菜肴。允许的菜涂覆在细胞培养罩（约20分钟）的表面上。
- 加入2毫升的DMEM一旦细胞被分离中和胰蛋白酶。
- 传送每个孔中的物质与标记的15-mL离心管中，并在摇摆转子离心机降速在90×g离心5分钟。吸出上清液并重新悬浮用移液管混合在DMEM 1000微升的各细胞沉淀。
- 抽吸从纤连蛋白混合物玻璃菜肴和吸管每个细胞悬浮液的1000μL到玻璃培养皿。
- 后的细胞沉淀到的玻璃盘的底部（〜15分钟），在细胞培养箱中添加另外1毫升的DMEM + 10％FBS + 1％青霉素 - 链霉素向每个孔和地点。允许细胞附着并表达传感器，用于至少18-24小时。
注：电池使用商用阳离子脂质转染试剂（见材料的表 ）转。可替代地，稳定的细胞系可以通过使用质粒与基因赋予对毒素进行选择（所述的pcDNA质粒为Nesprin-TS和-HL上可用的DNA库网站（参见材料的表 ）提供表达遗传霉素抗性细胞）。此外，病毒感染的方法（慢病毒，逆转录病毒，或腺病毒）可用于表达在，是很难转染细胞的传感器。 - 除了Nesprin-TS，转染的细胞附加与Nesprin HL零为CE控制，如在以下步骤中描述2.1-2.12; TSmod也可以用作零力控制并且应当表现出相似的FRET到Nesprin-HL。
- 转染细胞用mTFP1和金星，以产生频谱指纹（参见步骤4）。
注：mTFP1和金星通常表达水平高于Nesprin-TS，并且同样地，低量的DNA可能需要被转染的，以实现相似的表达水平。
3.确认转染效率
- 大致完成转染后18-24小时，使用倒置荧光显微镜通过荧光细胞的数目相比较，以在视图细胞（通常为5-30％）的总数来检查转染的效率。
- 使用配备有接近462纳米（mTFP1）或525纳米（金星）和近492纳米（mTFP1）或525纳米（金星）为中心的发射滤波器的激励频率的荧光显微镜。
注：另外，GFP过滤器组将捕获mTFP1的组合，并且已经NUS排放和允许的转染效率的确认。
- 使用配备有接近462纳米（mTFP1）或525纳米（金星）和近492纳米（mTFP1）或525纳米（金星）为中心的发射滤波器的激励频率的荧光显微镜。
- 转染后48个小时内的图像的活细胞。
- 可替代地，在固定的4％多聚甲醛（与钙和镁的PBS中）5分钟，储存于PBS中，视图细胞48小时后8。
注意：超过48小时，信号质量和强度衰减。固定细胞保持它们的状态，其中包括FRET中表达8;然而，细胞只应在PBS成像，如固定介质可能影响FRET 14。固定的细胞仅可相对于其他固定的细胞，因为有可能在表达的变化。
注意：多聚甲醛是有毒的。穿戴合适的个人防护装备（PPE）。
- 可替代地，在固定的4％多聚甲醛（与钙和镁的PBS中）5分钟，储存于PBS中，视图细胞48小时后8。
mTFP1和金星荧光基团的4捕捉光谱指纹光谱分离
- 在细胞培养罩，更换成像mediu细胞培养基米（HEPES缓冲的），补充有10％胎牛血清。
- 放置观看碗碟的温度受控（37℃）共聚焦显微镜阶段。
- 将带有mTFP1转染的细胞在油物镜的玻璃的观看菜在60X放大倍数为1.4的数值孔径。
注：此油经激光扫描显微镜中使用的60X物镜到接近于玻璃基板的折射率。油放置在物镜的顶部并且与玻璃盖玻片直接接触。 - 定位mTFP1表达细胞与458 nm激发源，并在500纳米为中心的发射带通滤波器。
- 随着视场荧光细胞，选择（在这里所使用的软件“LAMBDA模式”）的光谱检测模式和捕获分光图像（ 图3-1）;包括除了使用10度纳米的增量（ 图3-3）458nm处的所有频率。选择明亮fluoresc在电池（20像素的半径）ENT区域（ROI）。
注意：mTFP1表达ROI的频谱形状应保持在单元相对恒定。如果该形状变化很大，重新调整激光和增益的设置，以改善信噪比。 - 通过单击添加荧光ROI的意思是，归一化强度的光谱数据库“光谱保存到数据库中。”
- 优化激光功率和增益，使得良好的信噪比得以实现。设定适用于不同的设备而有所不同。使用非荧光，未转染细胞作为背景参考，提高增益和功率，直到所述细胞是明亮的，但不超过检测器（饱和点）的动态范围。背景细胞不应该在平均后检测的荧光。
- 重复此过程，金星转染的细胞，但下列情况除外：
- 确保激励频率是在515纳米和该带通滤波器是CE定位金星表达细胞时接近530纳米ntered。
- 在“光谱模式”，使用的515nm的，而不是458纳米的激发频率。
5.捕获未混合的图像
- 切换拍摄模式为“光谱分离。”
- 添加金星和mTFP1的光谱指纹到解混信道（ 图3中 ，箭头-2）。
- 设置的激发激光回458纳米氩源。
- 放置60X油浸物镜上面的Nesprin-TS观看菜。
- 聚焦在荧光细胞与足够亮表达后，调整增益和激光功率来优化信噪比。
注意：由于Nesprin-TS的FRET效率接近20％，未混合的金星图像应比未混合mTFP1图像基本上调光器。一旦可接受的功率和增益设置已被迭代地确定，这些参数必须保持所有的图像恒定上校ured。 - 捕捉的最小Nesprin-TS细胞的15-20图像具有相对类似的亮度和避免过度像素饱和（饱和的所有像素的图像处理过程中被除去）。
- 重复使用相同的成像参数Nesprin-HL细胞的图像捕获处理。
6.图像处理和比率的图像分析
- 使用开源的ImageJ（斐济）软件（http://fiji.sc/），使用BioFormats Reader中打开本机格式的图像。
- 前处理的图像，并计算使用先前建立的方案15的比率的图像。
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Representative Results
按照上述协议，质粒DNA从DNA库中获取并转化入大肠杆菌细胞中。表达该传感器DNA 的大肠杆菌从LB /氨苄青霉素平板上选择并在液体LB肉汤扩增。以下载体的扩增，DNA质粒使用标准，市售的DNA提取试剂盒纯化为TRIS-EDTA缓冲液中。使用分光光度计，纯化的DNA被量化为微克/毫升（ 图1A，1-2天）的标准浓度。
使用NIH3T3成纤维细胞，将细胞在6孔塑料细胞培养皿中生长至70-90％铺满。要插入的质粒DNA到NIH3T3细胞，进行脂质介导的转染质粒。可商购转染试剂（参见材料的表 ）被用作脂质容器DNA。两个重复所述Nesprin-TS和Nesprin-HL传感器转染到4个细胞孔（ 图1B）。在用于FRET摄像准备，mTFP1和金星单荧光团构建体转染到NIH3T3细胞（ 图1B）。转染后，将细胞转移到玻璃底查看与高倍率，倒共焦显微镜兼容菜肴。
在继续共焦成像，一个简单的倒宽视场荧光显微镜被用于验证转染效率。使用10X物镜0.25，许多细胞在典型的场的视图的数值孔径表示的Nesprin-TS（ 图2）。一般情况下，传感器周围的局部核膜，与Nesprin-2G 2的内源性的定位是一致的。无力控制传感器，Nesprin-HL，遵循类似的表达模式2。
最后，光谱分辨图像堆栈被导入到ImageJ的开源软件进行处理。对图像进行预处理，并利用既定的程序15进行了计算比率的图像。
图1： 基于时间的实验流程图。 （A）与获得SENS开始或质粒DNA， 大肠杆菌载体转化用DNA，选择和扩增（1-2天）。从浓缩大肠杆菌 LB肉汤，质粒DNA分离和定量（第3天）。使用纯化的DNA质粒，NIH3T3成纤维细胞转染在六孔格式（B），并转移到玻璃底培养皿是用倒置共聚焦显微镜（第3天）不兼容。为了验证转染的成功，细胞都配备有适当的过滤器集（第4天）一个宽视场荧光显微镜下观察。在成功转染队伍，将细胞成像在配备有光谱检测器共焦显微镜。使用光谱分离，mTFP1和金星通道在采集过程中分离，并且保存为光谱分辨图像栈（天数4-5）。最后，图像被预处理ImageJ中，并且比率图像被计算的。 PLEASE点击此处查看该图的放大版本。
图2： 转染的NIH3T3成纤维细胞的代表性图像。 （A）转染的NIH3T3成纤维细胞用GFP表达filterset Nesprin-TS的放大10倍。 （B）的边界框的部分从传感器A.表达的分解图如下核膜和经常延伸到细胞质中。 （C）Nesprin-TS和-HL控制以及它们如何结合到肌动蛋白和SUN结合结构域。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：Spectral指纹教程利用共聚焦软件。从20像素的半径在该高亮显示的区域的感兴趣有色十字线划定获得的归发射光谱。 （箭头-1）光谱检测模式以捕获图像。 （箭头-2）“光谱分离”设置为归一化谱添加到光谱数据库。 （箭头-3）的激励频率。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 实时光谱分离和共聚焦软件的输出。 （A）临界成像参数来再现实时，未混合的图像。 （箭头-1）的激励频率。 （箭头-2）活光谱分离模式。在未混合的金星信道（B）核图像。 （
图5： 在图案化和未图案化的马-达氏犬肾（MDCK）细胞Nesprin-TS FRET比率的图像。 MDCK细胞稳定表达Nesprin-TS进行成像于10微米范围内的纤连蛋白线（A）或非图案化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜（B）。核膜目视掩蔽并加工成FRET比率。着色比例尺代表用于未图案化的图案化和核中FRET比率振幅。e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg”目标=‘_空白’>点击此处查看该图的放大版本。
图6： 从加工成比例FRET图像Nesprin-TS表达细胞和聚集数据的直方图分析。 （A）的代表性，与肌球蛋白ML7抑制剂，由个体细胞核的颜色编码处理Nesprin-TS的FRET比率图像的归一化叠加柱状图。 （B）代表，用海绵诱癌素A，细胞收缩的活化剂处理过的Nesprin-TS的FRET比率图像的归一化叠加柱状图。传说把每一个分析，核其对直方图的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
一种方法和跨Nesprin-2G，在核LINC复合体的蛋白质的机械张力的活细胞成像演示，在上面概述的。在此之前的工作，各种技术，如微吸管，磁珠术和显微激光烧蚀，已经被用于对细胞核申请应变，并测量它的体积的材料特性16，17，18。 然而，直到我们最近的工作，还没有研究已经直接表明拉力在活细胞中2直接转移到一个LINC复杂的蛋白质。
先前，我们的实验室证明Nesprin2G，被称为迷你Nesprin2G，的修改版本可以被工程化以表达称为TSmod（ 图2C）2 FRET力探针。 TSmod先前显示动态测定拉伸为CES在活细胞和在不同的承重蛋白3，4，6，8。它进一步表明，迷你Nesprin-2G是从内源性Nesprin-2G区分相对于其定位，对细胞骨架，和能力的已知作用营救核定位11,19。使用与TSmod（Nesprin-TS）的迷你Nesprin-2G蛋白，已表明表达传感器NIH3T3成纤维细胞有不能结合到肌动蛋白2相对于Nesprin-HL，张力的基线水平。此外，蜂窝式收缩的使用抑制剂或肌球蛋白的活化剂的调制可以通过Nesprin-TS 2来检测。
有许多在本协议的关键步骤。混淆Nesprin-TS与Nesprin-HL（DNA或表达细胞）不readiLY检测，因为两者同样定位于核膜，并会导致混乱的结果。由于Nesprin-HL是一个没有力控制，测量FRET应该比Nesprin-TS上的平均水平。谨慎，测序分离的DNA构建体，并仔细标记细胞被劝告。第二，要仔细优化的共焦显微镜检测器的增益和激光功率，以改善信噪比和减少漂白是重要的。为了恰当地测量FRET，这些参数必须在图像采集过程中保持不变。此外，优化检测器增益或功率为暗淡或非常明亮的表达细胞是次优的，因为中值表达细胞将倾向于掉出检测器的动态范围的。表达的传感器的高浓度的某些细胞倾向于在核质和内质网发荧光，从而使得难以解决核膜，这大概是与问候FO更有趣的区域RCE。选择单元格略低的表达水平趋于解决传感器定位这个问题。
虽然比例光谱成像是测量FRET相对简单和快速的方式，但它确实的FRET效率，因为受体信号渗出至20不输出单元。没有的FRET效率单位，这是不可能的FRET比率索引转换成校准力测量。由于这个限制，只有相对定量力可以比较出来。 FRET效率可以通过更复杂的方法，例如荧光寿命成像显微术（FLIM）或受体漂白来确定。绝对力（在PN级）可以从FRET效率来估计，如先前所描述3,8。
相较于以前的方法来测量核的机械性质或基于核0的位移N个外部施加的力，测量FRET从Nesprin-TS具有核膜16，17，18的一个组件上非侵入性地探测张力的优点。该传感器输出与个别Nesprin-2G分子的应变相关的荧光信号。相比之下，微吸管需要使用的工具细腻活细胞工作时。共聚焦激光烧蚀导致局部细胞损伤，并且需要一个脉冲激光源。磁性扭转术转移力到经由细胞骨架核膜，不能用于测量特定蛋白质的力，除非将被加上Nesprin-2G张力传感器。
虽然已经证明，基于肌动蛋白的拉力被传递到Nesprin-2G中，LINC复合物的组分，它仍然是未知的拉伸或压缩力多少被施加到其它结构LINC蛋白，例如SUN-1或SUN-2。未来的工作将在克隆FRET力探讨了这些推定的承重LINC蛋白进一步阐明与蛋白质级别分辨率核力学被引导。这提出了自己的另一个问题是，在FRET变化可能是无关的张力变化的，而是反映了Nesprin-2G齐聚或Nesprin-2G的构象变化或者变化。在细胞pH的变化可以影响所述传感器的荧光并改变测得的FRET。所述Nesprin-2G HL传感器代表了一些变化的良好控制（与该传感器观察到的FRET的变化最有可能无关的力），和分子间FRET对照构建体可以被开发以评估低聚（见下文）。此外，nesprin-2G TS的表达受CMV启动子，这导致过度驱动，并且表达的这种高水平的可能潜在地诱导生物的伪像。用C最新进展上光定期间隔开短回文重复序列（CRISPR）已经允许同源定向修复（HDR）接近插入较大的DNA序列插入基因组中21。这种方法可被用来修改内源性Nesprin-2G（或其他蛋白质），以包括TSmod。这将使用适当的内源性启动子，从而减少了过表达伪影的电位提供的力传感器的表达。
TSmod和其它弹性FRET探针也可以用于开发其他蛋白质，这可能随后在类似的协议作为本文中描述的可以使用新的传感器。任何新的力传感器的发展的一个主要问题是确定的FRET传感器内部的插入位点。首先，插入的位点必须在经受机械负荷的蛋白质的区域。这些区域可以通过检查其中骨架连接蛋白与蛋白相互作用来鉴定。其次，插入大的（〜50 kDa）的TSmod必须不会破坏所研究的蛋白的生物学功能。一个以前开发的“迷你”形式Nesprin-2G的显示，桥接到SUN结合KASH结构域肌动蛋白结合CH域足以在受伤的单层11，19 Nesprin-2G核运动，这表明TSmod的插入可能不会破坏蛋白质的功能。传感器的生物学功能的确认需要用于蛋白质功能的功能测定法（其中所述力传感器可以示于耗尽内源蛋白的细胞以拯救的特定功能）。第三，在蛋白质低聚的变化可以改变蛋白质之间的FRET（称为分子间FRET 22），这将导致在没有强制相关FRET变化。这方面的一个仔细的分析往往需要专门的分子间FRET结构是特别报告齐聚。
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Acknowledgments
由托马斯·F.和凯特·米勒·杰弗里斯MEMORIA信托（以DEC）和美国国立卫生研究院授予R35GM119617（以DEC）这项工作是支持的。共焦显微镜成像在所述纳米材料VCU表征核心（NCC）设施执行。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
