Introduction
Kraft-følsom, har genetisk indkodede FRET sensorer nylig opstået som et vigtigt værktøj til måling trækkræfter-baserede kræfter i levende celler, hvilket giver indsigt i, hvordan mekaniske kræfter påføres tværs proteiner 1, 2, 3, 4. Med disse værktøjer, forskere kan ikke-invasivt billede intracellulære kræfter i levende celler ved hjælp af konventionelle fluorescerende mikroskoper. Disse sensorer består af et FRET-par (donor og acceptor fluorescerende proteiner, hyppigst en blå donor og gul acceptor) adskilt af et elastisk peptid 3. I modsætning til C- eller N-terminale tagging, denne sensor indsættes i et internt sted i et protein for at måle den mekaniske kraft, der overføres på tværs af proteinet, opfører sig som en molekylær strain-gauge. Øget mekanisk spænding tværs resultaterne sensor i en forøget afstand mellem FRET-pluft, hvilket resulterer i nedsat FRET 3. Som et resultat heraf FRET omvendt relateret til trækkraft.
Disse fluorescerende-baserede sensorer er blevet udviklet til fokale adhæsionsproteiner (vinculin 3 og talin 4), cytoskeletale proteiner (α-actinin 5), og celle-celle-junction-proteiner (E-Cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, og PECAM 8). Den hyppigst anvendte og velkarakteriserede elastisk linker i disse biosensorer er kendt som TSmod og består af en repetitiv sekvens af 40 aminosyrer, (GPGGA) 8, som blev afledt fra edderkoppesilkeproteinet piskeformede. TSmod har vist sig at opføre sig som et lineært elastisk nano-fjeder, med FRET respons på 1 til 5 pN af trækkraft 3. Forskellige længder af piskeformede kan anvendes til at ændre den dynamiske range af TSmod FRET-force følsomhed 9. Foruden piskeformede, spektrin gentager 5 og villin headpiece peptid (kendt som HP35) 4 er blevet anvendt som de elastiske peptider mellem FRET-par i lignende kraft biosensorer 4. Endelig viste en nylig rapport, at TSmod også kan anvendes til at detektere trykkræfter 10.
Vi har for nylig udviklet en kraftsensor til linker med nucleo-cytoskelettet (LINC) kompleks protein Nesprin2G ved hjælp TSmod indsat i en tidligere udviklet trunkeret Nesprin2G protein kendt som mini-Nesprin2G (figur 2C), som opfører sig på lignende måde som endogent Nesprin-2G 11. Den LINC Komplekset indeholder multiple proteiner, der fører fra ydersiden til indersiden af kernen, der forbinder den cytoplasmiske cytoskelet til den nukleare lag. Nesprin-2G er et strukturelt protein binding til bådeaktincytoskelettet i cytoplasmaet og SUN proteiner i perinukleære rum. Ved hjælp af vores biosensor, kunne vi vise, at Nesprin-2G er underlagt actomyosin-afhængig spænding i NIH3T3 fibroblaster 2. Dette var første gang, at styrke blev målt direkte på tværs et protein i den nukleare LINC kompleks, og det er sandsynligt, at blive et vigtigt redskab til at forstå betydningen af kraft på kernen i mechanobiology.
Protokollen nedenfor giver en detaljeret metode til, hvordan man bruger Nesprin-2G kraftsensor, herunder ekspressionen af Nesprin spændingsføler (Nesprin-TS) i pattedyrsceller, samt erhvervelse og analyse af FRET billeder af celler, der udtrykker Nesprin- TS. Anvendelse af et omvendt konfokalt mikroskop udstyret med en spektral detektor, FRET en beskrivelse af hvordan man måler sensibiliserede emission under anvendelse af spektral unmixing og ratiometrisk FRET billeddannelse er tilvejebragt. Udgangen ratiometriske billeder kan bruges til at lave relativ quantitative kraft sammenligninger. Mens denne protokol er fokuseret på ekspressionen af Nesprin-TS i fibroblaster, er det let at tilpasse til andre mammale celler, herunder begge cellelinier og primære celler. Endvidere kan denne protokol som den vedrører billederhvervelse og FRET-analyse let tilpasses til andre FRET-baserede kraft biosensorer, der er blevet udviklet til andre proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Få Nesprin-2G Sensor DNA og andre PlasmidDNA
- Opnå Nesprin-2G TS (spænding sensor), Nesprin-2G HL (hovedløs) kontrol, mTFP1, Venus, og TSmod fra en kommerciel kilde. Udbrede alle DNA-plasmider og rense dem ved anvendelse af standard E. coli stammer, såsom DH5-α, som tidligere 12, 13 beskrevet.
2. transfektion af celler med Nesprin-2G og andre Plasmid-DNA
- Grow NIH 3T3 fibroblastceller til 70-90% konfluens i en 6-brønds celledyrkningsskål i en standard cellekultur inkubator med temperatur (37 ° C) og CO2 (5%) regulering. For cellevækstmediet, bruge Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum.
- I en cellekultur hætte, fjern medium og skyl hver brønd med ca. 1 ml af en reduceret serum cellemedium. Tilføj 800 pi af reduceret serum cellemedium til hver brøndog placer 6-brønds kammer i inkubatoren.
- Pipetter 700 pi reduceret serum cellemedium i et 1,5 ml rør med 35 pi lipid bæreropløsning til dannelse af den "lipomix". Bland ved pipettering. Mærk røret med en "L"
- Samle seks 1,5 ml rør og mærke dem 1 til 6. Tilsæt 100 pi reduceret serum cellemedium i hvert rør.
- Anvendelse af plasmidet DNA-koncentration fra trin 1, pipette 2 ug Nesprin 2G-TS i rør 1 og 2. Pipetter 2 ug Nesprin-HL i rør 3 og 4. Pipetter 1 ug mTFP ind i røret 5. Pipetter 1 ug mVenus i røret 6. Må ikke genbruges pipettespidser når pipettering forskellige typer af DNA.
- Tilsæt 100 pi af lipomix fra "L" rør i hver mærket rør (1-6) og blandes ved gentagen pipettering. Brug en ren pipette til hvert rør. Inkuber i 10-20 min.
- Tilsæt 200 pi fra hver mærket rør til en brønd i 6-brønds kammer med 70-90% konfluenteceller. Mærk toppen af hver brønd med den tilsvarende DNA tilsættes. Placer 6-brønds kammer i en inkubator i 4-6 timer.
- Aspirer mediet og tilsæt 1-2 ml reduceret serum cellemedium at skylle. Aspireres reduceret serum cellemedium, der tilsættes 2 ml trypsin til hver brønd, og anbring skål med 6 brønde i inkubatoren (5-15 min).
- Medens cellerne løsnes i inkubatoren, frakke 6 glasbund visning retter med et lag af fibronectin i en koncentration på 20 ug / ml opløst i phosphatbufret saltvand (PBS). Tillad retterne at belægge overfladen i cellekulturen hætte (ca. 20 min).
- Neutralisere trypsin ved tilsætning af 2 ml DMEM, når cellerne er frigjort.
- Overfør indholdet af hver brønd til en mærket 15-ml centrifugerør og spin ned ved 90 xg i 5 minutter i en svingende rotor centrifuge. Aspirere supernatanten og resuspendere hver cellepellet i 1000 pi DMEM med pipette blanding.
- Aspirer fibronectin blandingen fraglas retter og pipette 1.000 pi af hver cellesuspension på glasset retter.
- Efter at cellerne sedimentere til bunden af glas retter (~ 15 min), der tilsættes yderligere 1 ml DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep til hver brønd og sted i cellen inkubator. Lade cellerne vedhæfte og udtrykke sensor i mindst 18-24 timer.
BEMÆRK: Celler transficeres under anvendelse af kommercielle kationiske lipid transfektionsreagenser (se tabel of Materials). Alternativt kan stabile cellelinjer udvælges ved anvendelse af et plasmid med et gen, der giver resistens over for et toksin (pcDNA plasmider til Nesprin-TS og -HL er tilgængelige på en DNA repository hjemmeside (se tabellen of Materials) tilvejebringelse af celler, der udtrykker geneticinresistens ). Derudover kan virale infektion metoder (lentivirus, retrovirus eller adenovirus) anvendes til at udtrykke sensoren i celler, der er svære at transficere. - Foruden Nesprin-TS, transficere yderligere celler med Nesprin HL nul-force kontrol, som beskrevet i trin 2.1-2.12; TSmod kan også anvendes som et nul-force kontrol og bør udvise lignende FRET til Nesprin-HL.
- Transficere celler med mTFP1 og Venus at generere spektrale fingeraftryk (se trin 4).
BEMÆRK: mTFP1 og venus udtrykker typisk i højere niveauer end Nesprin-TS, og som sådan kan være nødvendigt at transficeres at opnå lignende ekspressionsniveauer lavere mængder af DNA.
3. Kontroller transfektionseffektiviteten
- Groft 18-24 timer efter endt transfektion anvende et inverteret fluorescensmikroskop for at undersøge effektiviteten af transfektion ved at sammenligne antallet af fluorescerende celler til det totale antal celler i betragtning (sædvanligvis 5-30%).
- Anvende et fluorescerende mikroskop forsynet med en excitationsfrekvens nær 462 nm (mTFP1) eller 525 nm (Venus) og et emissionsfilter centreret nær 492 nm (mTFP1) eller 525 nm (Venus).
BEMÆRK: Alternativt vil GFP filtersæt fange en kombination af mTFP1 og veNus emissioner og vil tillade bekræftelse af transfektion effektivitet.
- Anvende et fluorescerende mikroskop forsynet med en excitationsfrekvens nær 462 nm (mTFP1) eller 525 nm (Venus) og et emissionsfilter centreret nær 492 nm (mTFP1) eller 525 nm (Venus).
- Dette billede er levende celler inden for 48 timer efter transfektion.
- Alternativt fix celler i 4% paraformaldehyd (i PBS med calcium og magnesium) i 5 minutter, opbevares i PBS, og visning efter 48 timer 8.
BEMÆRK: Beyond 48 h, signalkvaliteten og styrke henfalder. Fiksering af cellerne bevarer deres tilstand, herunder FRET udtrykkes 8; dog bør celler kun afbildes i PBS, som monteringsmedium kan påvirke FRET 14. Fikserede celler kan kun sammenlignes med andre fikserede celler, da der kan være en ændring i ekspression.
Forsigtig: Paraformaldehyd er toksisk. Bær egnede personlige værnemidler (PPE).
- Alternativt fix celler i 4% paraformaldehyd (i PBS med calcium og magnesium) i 5 minutter, opbevares i PBS, og visning efter 48 timer 8.
4. Capture Spectral Fingeraftryk af mTFP1 og Venus Fluorophorer for Spectral Unmixing
- I en cellekultur hætte, udskifte cellemediet med imaging medium (HEPES-bufret) suppleret med 10% føtalt bovint serum.
- Placer set retter i en temperaturreguleret (37 ° C) konfokalmikroskop fase.
- Anbring glas visning fad med mTFP1-transficerede celler over olieobjektiv ved 60X forstørrelse med en numerisk apertur på 1,4.
BEMÆRK: Olien bruges på en laserscanningmikroskop på 60X mål at ligne brydningsindekset for glasunderlaget. Olien er placeret på toppen af den objektive linse og kommer i direkte kontakt med dækglas. - Lokalisere mTFP1 udtrykkende celler med en 458 nm excitation kilde og en emission båndpasfilter centreret ved 500 nm.
- Med en fluorescerende celle i synsfeltet, skal du vælge den spektrale afsløring mode ( "Lambda Mode" i den anvendte software her) og fange den spektrale billede (Figur 3-1); omfatter alle frekvenser ud over 458 nm under anvendelse af 10 nm intervaller (Figur 3-3). Vælg en lys fluorescerent region (ROI) på cellen (20-pixel radius).
BEMÆRK: spektrale form mTFP1-udtrykkende ROI bør forblive relativt konstant over cellen. Hvis formen varierer betydeligt, re-justere laseren og få indstillinger for at forbedre signal-støj-forholdet. - Tilsæt fluorescerende ROI betyder, normaliseret intensitet til den spektrale database ved at klikke på "gem spektre til databasen."
- Optimer laser magt og få sådan at der opnås et godt signal-til-støj-forholdet. Indstillinger vil variere for forskelligt udstyr. Anvendelse af ikke-fluorescerende, utransficerede celler som baggrund henvises, øge forstærkningen og kraft, indtil cellerne er lyse, men ikke ud over det dynamiske område for detektoren (mætningspunktet). Baggrund celler bør ikke have påviselig fluorescens efter midling.
- Gentag processen for venus-transficerede celler med følgende undtagelser:
- Sikre, at excitationsfrekvensen er ved 515 nm, og at båndpasfilteret er centered nær 530 nm ved lokalisering venus-udtrykkende celler.
- I "Spectral Mode" bruge en excitationsfrekvens på 515 nm i stedet for 458 nm.
5. Capture ublandede billeder
- Skift fanger til "Spectral Unmixing."
- Tilføje de spektrale fingeraftryk af Venus og mTFP1 ind i unmixing kanaler (figur 3, Arrow-2).
- Indstil excitation laser tilbage til en 458 nm argon kilde.
- Placer Nesprin-TS visning fad over 60X olie mål.
- Efter fokusering på et fluorescerende celle med tilstrækkeligt lys udtryk, justere forstærkningen og lasereffekten for at optimere signal-støj-forholdet.
BEMÆRK: Da FRET effektivitet Nesprin-TS er nær 20%, bør den ublandede venus billedet være væsentligt svagere end den ublandede mTFP1 billedet. Når en acceptabel magt og vinding indstilling er bestemt iterativt, skal disse parametre er konstante for alle billeder captres. - Indfange mindst 15-20 billeder af Nesprin-TS celler med forholdsvis ens lysstyrke og undgå overdreven pixel mætning (alle mættede pixels fjernes under billedbehandling).
- Gentag billedfangstmidler processen med Nesprin-HL-celler under anvendelse identiske imaging parametre.
6. Billedbehandling og Ratio billedanalyse
- Ved hjælp af open source ImageJ (Fiji) software (http://fiji.sc/), åbne oprindelige format billeder ved hjælp BioFormats Reader.
- Pre-proces billederne og beregne forholdet billeder ved hjælp tidligere etablerede protokoller 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følge protokollen ovenfor blev plasmid-DNA erhvervet fra DNA repository og transformeret i E. coli-celler. E. coli, der udtrykker sensoren DNA blev udvalgt fra LB / ampicillin-plader og amplificeret i en flydende LB-medium. Efter amplifikationen af vektorerne, blev DNA-plasmider oprenset i TRIS-EDTA-puffer under anvendelse af en standard, kommercielt tilgængelig DNA-isolering kit. Anvendelse af et spektrofotometer, blev oprenset DNA kvantificeret i en standard koncentration af pg / ml (figur 1A, Days 1-2).
Anvendelse NIH3T3 fibroblaster blev celler dyrket til 70-90% konfluens i en 6-brønds plast celledyrkningsskål. At indsætte plasmid DNA i NIH3T3-celler, blev en lipidmedieret plasmidtransfektion udført. Kommercielt tilgængeligt transfektionsreagens (se tabellen of Materials) blev anvendt som lipid fartøj til DNA. To gentagelser afDe Nesprin-TS og Nesprin-HL sensorer blev transficeret i 4 cellebrønde (figur 1B). Som forberedelse til FRET billeddannelse blev enkelte fluorofor konstruktioner af mTFP1 og Venus transficeret ind NIH3T3-celler (Figur 1B). Efter transfektion blev cellerne overført til glasbund visning retter forenelige med høj forstørrelse, inverterede konfokale mikroskoper.
Inden vi går videre til konfokal billeddannelse, blev en simpel omvendt bredt felt fluorescerende mikroskop bruges til at kontrollere transfektionseffektiviteten. Ved anvendelse af en 10X objektiv med en numerisk apertur på 0,25, mange celler i en typisk field-of-view udtrykte Nesprin-TS (figur 2). Generelt sensoren lokaliseret omkring kernekappen, konsistent med det endogene lokalisering af Nesprin-2G 2. No-force kontrol sensor, Nesprin-HL, fulgte et lignende ekspressionsmønster 2.
Endelig blev spektralt løst billedstakke importeres til ImageJ open source-software til forarbejdning. Billederne blev præ-behandlet, og forholdet billeder blev beregnet ved hjælp af etablerede procedurer 15.
Figur 1: Eksperimentel Tidsbaseret Flow Chart. (A) Fra erhvervede senseller plasmid-DNA, er E. coli-vektorer transformeret med DNA, valgt, og amplificeret (Days 1-2). Fra koncentreret E. coli LB-bouillon, er plasmid-DNA isoleret og kvantificeret (Dag 3). Anvendelse af oprensede DNA-plasmider, er NIH3T3-fibroblaster transficeret i en seks-brønds format (B) og overført til glas-bottom retter, der er forenelige med en omvendt konfokalt mikroskop (dag 3). At verificere succes transfektion celler ses under et Vidvinklet fluorescensmikroskop udstyret med de passende filtersæt (dag 4). Betinget af en vellykket transfektion cellerne afbildes på et konfokalt mikroskop forsynet med en spektral detektor. Ved hjælp af spektral unmixing, er mTFP1 og venus kanaler adskilt under erhvervelse og gemmes som spektralt løst billedstakke (Dage 4-5). Endelig er billederne forbehandlet i ImageJ, og forholdet-billeder er beregnet. please klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: En repræsentant Billede af transficerede NIH3T3 fibroblaster. (A) 10X forstørrelse af transficerede NIH3T3-fibroblaster, der udtrykker Nesprin-TS ved anvendelse af en GFP filterset. (B) En eksploderet billede af afgrænsningsområdet fra del A. Sensor ekspression følger kernekappen og ofte strækker sig ind i cytoplasmaet. (C) Nesprin-TS og -HL Kontrol og hvordan de binder til actin og SUN bindende domæner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: SRelativ spektralfordeling Fingeraftryk Tutorial Brug Konfokal Software. Normaliserede emissionsspektre opnået fra 20-pixel radier i de fremhævede områder af interesse afgrænset af farvede trådkors. (Pil-1) Spectral afsløring tilstand til at tage billedet. (Arrow-2) "Spectral Unmixing" indstilling at tilføje normaliserede spektre til den spektrale database. (Arrow-3) ekscitationsfrekvens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Levende Spectral Unmixing og output af Konfokal Software. (A) Kritiske billeddiagnostiske parametre til at gengive levende, ublandede billeder. (Arrow-1) ekscitationsfrekvens. (Pil-2) Levende spektral unmixing tilstand. (B) Kerner billede i ublandet Venus kanal. (
Figur 5: Nesprin-TS FRET forholdet billeder i mønstret og ustrukturerede Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler. MDCK-celler, som stabilt udtrykker Nesprin-TS blev afbildet på 10 um-dækkende fibronectin linier (A) eller ustrukturerede polydimethylsiloxan (PDMS) membraner (B). Kernemembraner blev visuelt maskeret og forarbejdes til FRET-forhold. Skalalinjen farvede repræsenterer FRET forholdet amplitude for ustrukturerede og mønstrede kerner.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Forarbejdet Ratiometrisk FRET Billeder fra Nesprin-TS-udtrykkende celler og Histogram Analyse af aggregerede data. (A) En repræsentant, normaliseret stablet histogram af FRET forholdet billeder af Nesprin-TS behandlet med ML7 myosin inhibitor, farvekodet af individuelle cellekerner. (B) En repræsentant, normaliseret stablet histogram af FRET forholdet billeder af Nesprin-TS behandlet med calyculin A, en aktivator af cellesammentrækningsevne. Legenden korrelerer hver analyseret kerne af sin placering på histogrammet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En fremgangsmåde og demonstration af levende celler af mekanisk spænding tværs Nesprin-2G, et protein i den nukleare LINC komplekset, blev skitseret ovenfor. Forud for dette arbejde, forskellige teknikker, såsom mikropipetteaspirationsteknik, magnetisk-perle cytometri, og mikroskopisk laser-ablation, er blevet anvendt til at anvende pres på cellekernen og måle dens bulk-materialeegenskaber 16, 17, 18. Men indtil vores nylige arbejde, ingen undersøgelser havde direkte vist, at trækkræfter overføres direkte på en LINC kompleks protein i levende celler 2.
Tidligere vores laboratorium viste, at en modificeret version af Nesprin2G, kendt som mini-Nesprin2G, kunne konstrueres til at udtrykke et FRET-force probe kendt som TSmod (figur 2C) 2. TSmod tidligere vist til dynamisk måle trækstyrke forces i levende celler og i forskellige bærende proteiner 3, 4, 6, 8. Det blev endvidere vist, at mini-Nesprin-2G var skelnes fra endogen Nesprin-2G med hensyn til dets lokalisering, til kendte virkninger på cytoskelettet og evne redde nuklear positionering 11, 19. Ved hjælp af mini Nesprin-2G-proteinet med TSmod (Nesprin-TS) blev det vist, at NIH3T3-fibroblaster, der udtrykker sensoren har et udgangsniveau for spænding i forhold til Nesprin-HL, som ikke kan binde til actin 2. Endvidere kan modulering af cellulær kontraktilitet anvendelse inhibitorer eller aktivatorer af myosin detekteres ved Nesprin-TS2.
Der er en række kritiske trin i denne protokol. Forvirrende Nesprin-TS med Nesprin-HL (DNA eller udtrykkende celler) er ikke Readily detekteres, da begge ligeledes lokalisere til kernemembranen, og vil føre til forvirrende resultater. Eftersom Nesprin-HL er en no-force kontrol bør den målte FRET være højere end Nesprin-TS i gennemsnit. At være forsigtig, er sekventeringsreaktioner isoleret DNA-konstruktioner og omhyggeligt mærkning celler tilrådes. For det andet er det vigtigt nøje at optimere detektorforstærkningen og lasereffekt på det konfokale mikroskop for at forbedre signal-til-støj-forhold og for at minimere blegning. For at kunne måle FRET, skal disse parametre er konstante under billedet købet. Endvidere optimering detektorforstærkningen eller kraft til dim eller meget lyse udtrykkende celler er suboptimal, fordi median udtrykkende celler vil være tilbøjelige til at falde ud af det dynamiske område for detektoren. Visse celler, som udtrykker en høj koncentration af føler tendens til at fluorescere i nukleoplasmaet og endoplasmatiske reticulum, hvilket gør det vanskeligt at løse kernemembranen, der er formentlig mere interessant region med hensyn til at foRCE. Valg af celler med lidt lavere ekspressionsniveauer tendens til at løse dette problem sensor lokalisering.
Mens ratiometrisk spektral billeddannelse er en relativ enkel og hurtig måde at måle FRET, det ikke udlæseenheder FRET effektivitet skyldes acceptorsignal gennemblødning 20. Uden enheder af FRET effektivitet, er det ikke muligt at konvertere FRET forholdet indeks i en kalibreret kraft måling. På grund af denne begrænsning, kan kun relative kvantitative kraft der foretages sammenligninger. FRET effektivitet kan bestemmes ved mere komplicerede metoder, såsom fluorescens-levetid imaging mikroskopi (FLIM) eller acceptor fotoblegning. Absolut kraft (på pN niveau) kan estimeres ud fra FRET effektivitet, som beskrevet tidligere 3, 8.
I modsætning til tidligere metoder til at måle de mekaniske egenskaber af kernen eller forskydningen af kernen baseret on eksternt påførte kræfter, måling af FRET fra Nesprin-TS har den fordel, ikke-invasiv sondering spænding på en komponent af kernemembranen 16, 17, 18. Sensoren afgiver et fluorescerende signal, der er korreleret med stammen på individuelle Nesprin-2G-molekyler. I modsætning hertil mikropipetteaspirationsteknik kræver brug af sarte værktøjer når der arbejdes med levende celler. Konfokal laser ablation forårsager lokal cellulær skade og kræver en pulserende laser kilde. Magnetisk snoning cytometri overfører kræfter på kernemembranen via cytoskelettet og kan ikke anvendes til at måle kræfter på specifikke proteiner, medmindre det skulle kobles med Nesprin-2G spænding sensor.
Mens det er blevet påvist, at actin-baserede trækkræfter overføres til Nesprin-2G, en komponent i LINC kompleks, forbliver ukendt, hvor meget træk- eller trykkræfter udøvespå andre strukturelle LINC proteiner, såsom SUN-1 eller SUN-2. Fremtidige arbejde vil blive rettet mod kloning FRET-force prober i disse formodede bærende LINC proteiner til yderligere at belyse nukleare mekanik med protein-niveau opløsning. Et andet spørgsmål, der præsenterer sig selv, er, at ændringer i FRET kan være relateret til ændringer i spænding, men snarere afspejler enten ændringer i Nesprin-2G oligomerisering eller konformationsændringer af Nesprin-2G. Ændringer i cellulær pH kan påvirke fluorescensen af sensoren og ændre den målte FRET. Den Nesprin-2G HL-sensoren er en god kontrol for nogle af disse ændringer (som FRET ændringer observeret med denne sensor er mest sandsynligt relateret til at tvinge), og intermolekylære FRET kontrol konstruktioner kan udvikles til at vurdere oligomerisering (se nedenfor). Derudover er ekspression af nesprin-2G TS drevet af en CMV-promotor, hvilket resulterer i overekspression, og dette høje niveau af ekspression kan muligvis inducere biologiske artefakter. Nylige fremskridt med clustered regelmæssigt indbyrdes afstand korte palindrome repeats (CRISPR) har givet mulighed for homologi-dirigeret reparation (HDR) nærmer at indsætte større DNA-sekvenser i genomet 21. Denne fremgangsmåde kunne anvendes til at modificere endogen Nesprin-2G (eller andre proteiner) til at omfatte TSmod. Dette ville tilvejebringe ekspression af kraftføleren anvendelse af det passende endogene promotor, hvilket reducerer potentialet for overekspression artefakter.
TSmod og andre elastiske FRET prober kan også anvendes til at udvikle nye sensorer til andre proteiner, som derefter kunne anvendes i en lignende protokol som den beskrevet i denne artikel. Et stort problem med udviklingen af en ny kraft sensor er bestemmelse af den interne indsættelse site for FRET sensoren. Det første skal insertionsstedet være i en region af proteinet udsættes for mekanisk belastning. Disse regioner kan identificeres ved at undersøge hvor cytoskeletale-forbundet proteiner interagerer med proteinet. Sekund, indsættelsenaf det store (~ 50 kDa) TSmod må ikke forstyrre den biologiske funktion af proteinet blev undersøgt. En tidligere udviklet "mini" form for Nesprin-2G viste, at actinbindende CH domæner bro til SUN-bindende Kash domæne var tilstrækkelige til Nesprin-2G nukleare bevægelse i sårede monolag 11, 19, hvilket tyder på, at indsættelsen af TSmod ville sandsynligvis ikke forstyrre proteinfunktion. Bekræftelse af den biologiske funktion af sensoren kræver et funktionelt assay for proteinfunktion (hvor kraftføleren kan vises at redde en bestemt funktion i celler udtømt for endogent protein). For det tredje kan ændringer i protein oligomerisering ændre FRET mellem proteiner (betegnet intermolekylær FRET 22), hvilket ville resultere i FRET ændringer, der ikke er relateret til at tvinge. En grundig analyse af dette kræver ofte specialiserede intermolekylære FRET konstruktioner, der specifikt rapportere oligomerisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memoria Trust (til DEC) og NIH give R35GM119617 (til DEC). Det konfokale mikroskop billeddannelse blev udført ved VCU nanomaterialer Karakterisering Core (NCC) Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
