Introduction
Sensible à la force, des capteurs de FRET codés génétiquement ont récemment émergé comme un outil important pour mesurer des forces de traction à base de cellules vivantes, donnant un aperçu de la manière dont les forces mécaniques sont appliquées sur les protéines 1, 2, 3, 4. Avec ces outils, les chercheurs peuvent acquérir des images non effractive forces intracellulaires dans les cellules vivantes en utilisant des microscopes fluorescents classiques. Ces capteurs sont constitués d'une paire FRET (donneur et accepteur protéines fluorescentes, le plus souvent un donneur et accepteur bleu jaune) séparées par un peptide élastique 3. Contrairement à C- ou le marquage N-terminal, ce capteur est inséré dans un site interne d'une protéine pour mesurer la force mécanique transmise à travers la protéine, se comportant comme une jauge de contrainte moléculaire. Augmentation de la tension mécanique sur les résultats de détection à une distance accrue entre le FRET-pair, entraînant une diminution de FRET 3. En conséquence, le FRET est inversement proportionnelle à la force de traction.
Ces capteurs à base de fluorescence ont été développés pour des protéines d'adhésion focale (de vinculine 3 et Talin 4), les protéines du cytosquelette (α-actinine 5), et des protéines de jonction cellule-cellule (E-cadhérine 6, 7, VE-cadhérine 8, et PECAM 8). Le segment de liaison élastique le plus fréquemment utilisé et bien caractérisés dans ces biocapteurs est connu comme TSmod et se compose d'une séquence répétitive de 40 acides aminés, (GPGGA) 8, qui a été dérivée de la protéine de soie d'araignée flagelliforme. TSmod a été montré pour se comporter comme un ressort élastique nano-linéaire, avec une réactivité de FRET à 1 à 5 pN de la force de traction 3. Différentes longueurs de flagelliformes peuvent être utilisés pour modifier la dynamique range de la sensibilité de la force de FRET TSmod 9. En plus de flagelliformes, spectrine répète 5 et villine peptide de tête (connu sous le nom HP35) 4 ont été utilisés comme peptides élastiques entre les paires de FRET dans des biocapteurs de force similaire 4. Enfin, un récent rapport a montré que TSmod peut également être utilisé pour détecter les forces de compression 10.
Nous avons récemment développé un capteur de force pour la liaison de la nucléo-cytosquelette (CLIC) complexe de protéines en utilisant Nesprin2G TSmod inséré dans une protéine tronquée Nesprin2G développé précédemment connu sous le mini-Nesprin2G (figure 2C), qui se comporte de manière similaire à endogène Nesprin-2G 11. Le complexe CLIC contient plusieurs protéines qui mènent de l'extérieur vers l'intérieur du noyau, reliant le cytosquelette cytoplasmique de la lamina nucléaire. Nesprin-2G est une protéine structurale lie à la fois à lacytosquelette d'actine dans le cytoplasme et aux protéines SUN dans l'espace périnucléaire. En utilisant notre biocapteur, nous avons pu montrer que Nesprin-2G est soumis à une tension dépendant de actomyosine dans les fibroblastes NIH3T3 2. Ce fut la première fois que la force a été mesurée directement sur une protéine dans le complexe nucléaire LINC, et il est susceptible de devenir un outil important pour comprendre le rôle de la force sur le noyau en mécanobiologie.
Le protocole ci-dessous fournit une méthodologie détaillée de la façon d'utiliser le capteur de force Nesprin-2G, y compris l'expression du capteur de tension Nesprin (Nesprin-TS) dans des cellules de mammifères, ainsi que l'acquisition et l'analyse des images de FRET de cellules exprimant Nesprin- TS. En utilisant un microscope confocal inversé équipé d'un détecteur spectral, une description de la façon de mesurer l'émission sensibilisée FRET utilisant déconvolution spectrale et l'imagerie ratiométrique de FRET est fourni. Les images de sortie ratiométrique peuvent être utilisés pour faire en tant que parentComparaisons des forces ntitative. Bien que ce protocole se concentre sur l'expression de Nesprin-TS dans des fibroblastes, il est facilement adaptable à d'autres cellules de mammifères, y compris les lignées cellulaires et les cellules primaires. En outre, ce protocole en ce qui concerne l'acquisition et l'analyse FRET image peut être facilement adaptée à d'autres biocapteurs de force sur la base de FRET qui ont été développés pour d'autres protéines.
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Protocol
1. Obtenir Nesprin-2G ADN capteur et autres ADN plasmidique
- Obtenir Nesprin-2G TS (capteur de tension), le contrôle Nesprin-2G HL (sans tête), mTFP1, venus, et TSmod à partir d'une source commerciale. Propager les plasmides d'ADN et les purifier en utilisant des souches standards de E. coli, tels que DH5-α, comme décrit précédemment 12, 13.
2. Les cellules transfecter avec Nesprin-2G et autres ADN plasmidique
- Cultiver des cellules de fibroblastes NIH 3T3 à confluence 70-90% dans une boîte de culture cellulaire à 6 puits dans un incubateur de culture cellulaire standard avec la température (37 ° C) et de régulation de CO 2 (5%). Pour le milieu de croissance cellulaire, utiliser Eagle modifié Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum de veau foetal.
- Dans une hotte de culture cellulaire, éliminer le milieu et rincer chaque puits avec environ 1 ml d'un milieu de cellules à teneur réduite en sérum. Ajouter 800 pi de milieu cellulaire sérum réduit à chaque puitset mettre la chambre à 6 puits dans l'incubateur.
- Pipeter 700 ul de milieu de sérum réduit cellulaire dans un tube de 1,5 ml avec 35 ul de solution de véhicule lipidique pour former le « lipomix ». Mélanger par pipetage. Etiqueter le tube avec un « L. »
- Recueillir six tubes de 1,5 ml et les étiqueter 1 à 6. Pipeter 100 ul de milieu de sérum réduit de cellule dans chaque tube.
- Utilisation de la concentration d'ADN plasmidique provenant de l'étape 1, la pipette 2 pg de Nesprin 2G-TS dans des tubes 1 et 2. Pipeter 2 pg de Nesprin-HL dans des tubes 3 et 4. Pipeter 1 ug de MTFP dans le tube 5. Pipeter 1 ug de mVenus dans le tube 6. ne pas réutiliser les embouts de pipette lors du pipetage différents types d'ADN.
- Pipeter 100 ul de la lipomix du tube en « L » dans chaque tube marqué (1-6) et mélanger par pipetage répété. Utiliser une pipette propre pour chaque tube. Incuber pendant 10-20 min.
- Ajouter 200 ul de chaque tube marqué à un puits dans la chambre 6 puits avec 70-90% de confluencecellules. Etiqueter le haut de chaque puits avec l'ADN correspondant ajouté. Placer la chambre à 6 puits dans un incubateur pendant 4-6 h.
- Aspirer le moyen et ajouter 1-2 ml de milieu cellulaire sérum réduit à rincer. Aspirer le milieu des cellules à teneur réduite en sérum, ajouter 2 ml de trypsine à chaque puits, et placer le plat à 6 puits dans l'incubateur (5-15 min).
- Bien que les cellules se détachent dans l'incubateur, le manteau 6 plats de visualisation à fond de verre avec une couche de fibronectine à une concentration de 20 ug / mL dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laisser la vaisselle à revêtir la surface dans la hotte de culture cellulaire (environ 20 min).
- Neutraliser la trypsine par addition de 2 ml de DMEM une fois que les cellules sont détachées.
- Transférer le contenu de chaque puits à un tube de centrifugation marqué 15 ml et centrifuger à 90 xg pendant 5 min dans une centrifugeuse à rotor oscillant. Aspirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 1 000 pi de DMEM par mélange de pipette.
- Aspirer le mélange de fibronectine à partir duplats à base de verre et de pipette de 1000 ul de chaque suspension cellulaire sur la vaisselle en verre.
- Après que les cellules se déposent au fond des plats en verre (~ 15 min), ajouter un autre 1 ml de DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep à chaque puits et dans l'incubateur de cellules. Permettre aux cellules de se fixer et d'un capteur pour exprimer au moins 18 à 24 h.
NOTE: Les cellules sont transfectées en utilisant des réactifs de transfection des lipides cationiques commerciaux (voir la table des matières). En variante, les lignées cellulaires stables peuvent être sélectionnés à l'aide d' un plasmide avec un gène conférant une résistance à une toxine (les plasmides pcDNA pour Nesprin-TS et -HL sont disponibles sur un site de dépôt de l' ADN (voir le tableau des matériaux) fournir des cellules exprimant la résistance à la généticine ). En outre, des procédés d'infection virale (lentivirus, retrovirus, ou adenovirus) peuvent être utilisés pour exprimer le capteur dans des cellules qui sont difficiles à transfecter. - En plus de Nesprin-TS, transfecter des cellules supplémentaires avec le Nesprin HL-zérole contrôle de conformité, tel que décrit dans les étapes 2.1-2.12; TSmod peut également être utilisé comme un contrôle zéro force et doit présenter FRET similaire à Nesprin-HL.
- transfecter des cellules avec mTFP1 et venus de générer des empreintes digitales spectrales (voir l'étape 4).
REMARQUE: mTFP1 et expriment généralement vénus à des niveaux plus élevés que Nesprin-TS, et en tant que tels, des quantités plus faibles d'ADN devront peut-être transfectées pour atteindre des niveaux d'expression similaires.
3. Vérifier l'efficacité Transfection
- Environ 18 à 24 h après la fin de la transfection, en utilisant un microscope à fluorescence inversée pour examiner l'efficacité de la transfection en comparant le nombre de cellules fluorescentes et le nombre total de cellules en vue (généralement 5-30%).
- Utiliser un microscope à fluorescence équipé d'une fréquence d'excitation proche de 462 nm (mTFP1) ou 525 nm (Venus), et un filtre d'émission centrée à proximité de 492 nm (mTFP1) ou 525 nm (VENUS).
REMARQUE: Sinon, jeux de filtres GFP capturera une combinaison de mTFP1 et veles émissions Nus et permettront la confirmation de l'efficacité de la transfection.
- Utiliser un microscope à fluorescence équipé d'une fréquence d'excitation proche de 462 nm (mTFP1) ou 525 nm (Venus), et un filtre d'émission centrée à proximité de 492 nm (mTFP1) ou 525 nm (VENUS).
- cellules vivantes de l'image dans les 48 h après la transfection.
- En variante, fixer les cellules dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS (avec du calcium et de magnésium) pendant 5 min, de stocker dans du PBS, et la vue après 48 h 8.
NOTE: Au-delà de 48 h, la qualité et la puissance du signal désintègre. La fixation des cellules préserve leur état, y compris le FRET étant exprimé 8; Cependant, les cellules ne devraient être imagés dans du PBS, en tant que moyen de montage peut affecter 14 FRET. Les cellules fixées ne peuvent être comparées à d'autres cellules fixes, comme il peut y avoir un changement dans l'expression.
Attention: paraformaldéhyde est toxique. Porter un équipement de protection individuelle (EPI).
- En variante, fixer les cellules dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS (avec du calcium et de magnésium) pendant 5 min, de stocker dans du PBS, et la vue après 48 h 8.
4. capture spectrale de Fingerprints mTFP1 et Vénus fluorophores pour Déconvolution spectrale
- Dans une hotte de culture cellulaire, remplacer le milieu cellulaire avec l'imagerie medium (tampon HEPES) complété avec 10% de sérum bovin foetal.
- Placer les plats de visualisation à une température contrôlée (37 ° C) platine du microscope confocal.
- Placer le plat de visualisation en verre avec des cellules transfectées mTFP1 plus de l'objectif de l'huile à un grossissement de 60X avec une ouverture numérique de 1,4.
NOTE: L'huile est utilisée sur un microscope à balayage laser sur l'objectif 60X pour ressembler étroitement l'indice de réfraction du substrat de verre. L'huile est placé sur le dessus de l'objectif et est en contact direct avec la lamelle de verre. - Localiser mTFP1 cellules exprimant avec une source d'excitation de 458 nm et un filtre passe-bande d'émission centrée à 500 nm.
- Avec une cellule fluorescente dans le champ de vision, sélectionner le mode de détection spectrale ( « Mode Lambda » dans le logiciel utilisé ici) et de capturer l'image spectrale (Figure 3-1); inclure toutes les fréquences au - delà de 458 nm en utilisant des incréments de 10 nm (Figure 3-3). Sélectionnez un Déess lumineuxrégion ent (ROI) sur la cellule (rayon de 20 pixels).
NOTE: La forme spectrale du ROI mTFP1 exprimant doit rester dans la cellule relativement constante. Si la forme varie considérablement, réajustez le laser et obtenir les paramètres pour améliorer le rapport signal-bruit. - Ajouter le retour sur investissement fluorescent moyenne, l'intensité normalisée à la base de données spectrale en cliquant sur « enregistrer des spectres à la base de données. »
- Optimiser la puissance du laser et gagner de telle sorte qu'un bon rapport signal-bruit est atteint. Les réglages varient pour différents équipements. Utilisation de cellules non fluorescentes, non transfectées en tant que référence d'arrière-plan, augmenter le gain et la puissance jusqu'à ce que les cellules sont lumineuses, mais pas au-delà de la plage dynamique du détecteur (point de saturation). les cellules d'arrière-plan ne devraient pas avoir une fluorescence détectable après une moyenne.
- Répétez le processus pour les cellules transfectées avec vénus les exceptions suivantes:
- Assurez-vous que la fréquence d'excitation est à 515 nm et que le filtre passe-bande est thisntered près de 530 nm lors de la localisation des cellules exprimant vénus.
- En "mode spectral," utiliser une fréquence d'excitation de 515 nm au lieu de 458 nm.
5. Images capture Unmixed
- Changez le mode de capture à « Déconvolution spectrale. »
- Ajouter les empreintes digitales spectrales des clovisses et mTFP1 dans les canaux de démixage (Figure 3, Sous-2).
- Réglez le laser d'excitation à une source d'argon 458 nm.
- Placez le plat de visualisation Nesprin-TS au-dessus de l'objectif de l'huile 60X.
- Après mise au point sur une cellule fluorescente avec une expression suffisamment lumineux, ajuster la puissance de gain et laser pour optimiser le rapport signal-sur-bruit.
REMARQUE: Étant donné que l'efficacité de FRET de Nesprin-TS est près de 20%, l'image doit être vénus sans mélange sensiblement plus faible que l'image mTFP1 sans mélange. Une fois un réglage de puissance et le gain acceptable ont été déterminées itérativement, ces paramètres doivent rester constant pour toutes les images captured. - Capturer un minimum de 15-20 images de cellules Nesprin-TS avec une luminosité relativement similaire et d'éviter la saturation du pixel excessive (tous les pixels saturés sont éliminés au cours du traitement de l'image).
- Répéter le processus de capture d'image avec des cellules HL-Nesprin en utilisant des paramètres de formation d'image identiques.
6. Traitement de l'image et analyse des ratios d'image
- En utilisant un logiciel open-source ImageJ (FIDJI) (http://fiji.sc/), ouvrez les images au format natif en utilisant BioFormats Reader.
- Pré-traiter les images et calculer les images de rapport en utilisant des protocoles établis précédemment 15.
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Representative Results
En suivant le protocole ci - dessus, l' ADN plasmidique a été acquis à partir du dépôt de l' ADN et transformé dans des cellules E. coli. E. coli exprimant l'ADN de la sonde ont été sélectionnés à partir des plaques de LB / ampicilline et amplifiés dans un bouillon LB liquide. Suite à l'amplification des vecteurs, des plasmides d'ADN ont été purifiés dans du tampon TRIS-EDTA en utilisant un étalon, le kit d'isolement d'ADN disponible dans le commerce. L' utilisation d' un spectrophotomètre, l' ADN purifié a été quantifié dans une concentration standard de ug / mL (figure 1A, Jours 1-2).
Utilisation de fibroblastes NIH3T3, les cellules ont été cultivées jusqu'à confluence de 70 à 90% dans une boîte de culture cellulaire en plastique à 6 puits. Pour insérer l'ADN de plasmide dans les cellules NIH3T3, une transfection à médiation plasmidique lipides a été effectuée. Disponible dans le commerce réactif de transfection (voir le tableau des matériaux) a été utilisé comme récipient de lipide pour l' ADN. Deux répliques deles capteurs Nesprin-TS et Nesprin-HL ont été transfectés dans 4 puits de cellules (figure 1B). En préparation pour l' imagerie FRET, des constructions simples fluorophores de mTFP1 et VENUS ont été transfectés dans des cellules NIH3T3 (figure 1B). Après la transfection, les cellules ont été transférées dans des boîtes de visualisation fond de verre compatible avec un fort grossissement, microscopes confocale inversés.
Avant de procéder à l'imagerie confocale, un simple microscope à fluorescence inversé grand champ a été utilisé pour vérifier l'efficacité de la transfection. L' utilisation d' un objectif 10X avec une ouverture numérique de 0,25, de nombreuses cellules dans un champ de vision typique exprimé les Nesprin-TS (Figure 2). En général, le capteur localisé autour de l'enveloppe nucléaire, conforme à la localisation endogène de Nesprin-2G 2. Le pas de force de capteur de commande, Nesprin-HL, a suivi un modèle d'expression similaire 2.
Enfin, les piles d'images ont été résolues spectralement importées dans ImageJ logiciel open source pour le traitement. Les images ont été pré-traitées et les images de rapport ont été calculées en utilisant des procédures établies 15.
Figure 1: Tableau des flux basé temps expérimental. (A) A partir de acquises sensou de l' ADN de plasmide, des vecteurs de E. coli sont transformées avec l' ADN, sélectionnés et amplifiés (jours 1-2). À partir du bouillon de E. coli LB concentré, l' ADN plasmidique est isolé et quantifié (jour 3). En utilisant des plasmides d'ADN purifiés, les fibroblastes NIH3T3 sont transfectées dans un format de six puits (B) et transférés sur des boîtes à fond de verre qui sont compatibles avec un microscope confocal inversé (jour 3). Pour vérifier le succès de la transfection, les cellules sont examinées sous microscope à fluorescence Widefield équipé des filtres appropriés (jour 4). Subordonnée à une transfection réussie, les cellules sont imagés sur un microscope confocal équipé d'un détecteur spectral. Utilisation de déconvolution spectrale, les canaux mTFP1 et Vénus sont séparées lors de l'acquisition et enregistrés sous forme de piles d'images résolues spectralement (jours 4-5). Enfin, les images sont prétraitées dans ImageJ, et le rapport-images sont calculées. Please cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: une image représentative de transfectés NIH3T3 fibroblaste. (A) un grossissement de 10X de fibroblastes NIH3T3 transfectées exprimant Nesprin-TS en utilisant un filterset GFP. (B) Une vue éclatée de la zone de délimitation de la partie A. expression du capteur suit l'enveloppe nucléaire et se prolonge souvent dans le cytoplasme. (C) Nesprin-TS et -HL contrôle et la façon dont ils se lient à l'actine et SUN domaines de liaison. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Spectral Tutoriel L'utilisation Fingerprinting confocale logiciel. Les spectres d'émission normalisée obtenue à partir des rayons de 20 pixels dans les régions d'intérêt en surbrillance délimités par ligne de mire de couleur. (Sous-1) mode de détection spectrale pour capturer l'image. (Arrow-2) paramètre « Déconvolution spectrale » pour ajouter spectres normalisés à la base de données spectrales. (Sous-3) La fréquence d'excitation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: direct Déconvolution spectrale et sortie de confocale Software. (A) les paramètres d'imagerie critiques pour reproduire des images en direct, non mélangés. (Sous-1) La fréquence d'excitation. (Sous-2) vis mode de déconvolution spectrale. (B) l' image des noyaux dans le canal VENUS sans mélange. (
Figure 5: Ratio Nesprin-TS FRET images dans des cellules à motifs et sans motif Madin-Darby Canine Kidney (MDCK). Des cellules MDCK qui expriment de manière stable Nesprin-TS ont été imagées sur 10 um à l' échelle des lignes de fibronectine (A) ou sans motif polydiméthylsiloxane membranes (PDMS) (B). membranes nucléaires ont été visuellement masquées et traitées dans les rapports FRET. La barre d'échelle de couleur représente l'amplitude du ratio FRET pour les noyaux et sans motif à motifs.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: Traité Ratiométrique FRET Images de Nesprin-TS-cellules exprimant et Histogramme L' analyse des données agrégées. (A) Un représentant, histogramme normalisé empilé des images de ratio FRET de Nesprin-TS traitées avec ML7 inhibiteur de myosine, un code de couleur par des noyaux de cellules individuelles. (B) Un représentant, histogramme normalisé empilé des images de ratio FRET de Nesprin-TS traitées avec calyculine A, un activateur de la contractilité des cellules. La légende est en corrélation chaque noyau analysé à son emplacement sur l'histogramme. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Un procédé et la démonstration d'imagerie des cellules vivantes de la tension mécanique dans Nesprin-2G, une protéine dans le complexe nucléaire CLIC, a été décrit ci-dessus. Avant ces travaux, diverses techniques, telles que l' aspiration par micropipette, cytométrie magnétique bourrelet, et l' ablation au laser au microscope, ont été utilisés pour appliquer de pression sur le noyau de la cellule et à mesurer les propriétés des matériaux en vrac 16, 17, 18. Cependant, jusqu'à ce que nos travaux récents, aucune étude ont directement montré que les forces de traction sont transférées directement sur une protéine complexe LINC dans les cellules vivantes 2.
Auparavant, notre laboratoire a montré qu'une version modifiée de Nesprin2G, connu sous le mini-Nesprin2G, peut être modifié pour exprimer une sonde de force de FRET connu sous le nom TSmod (figure 2C) 2. TSmod a été montré précédemment pour mesurer dynamiquement la traction pourbureaux dans les cellules vivantes et dans diverses protéines porteuses 3, 4, 6, 8. Il a en outre montré que les mini-Nesprin-2G était impossible de distinguer Nesprin-2G endogène par rapport à sa localisation, des effets connus sur le cytosquelette, et la capacité de sauvetage positionnement nucléaire 11, 19. Utilisation de la mini - protéine Nesprin-2G avec le TSmod (Nesprin-TS), il a été montré que les fibroblastes NIH3T3 exprimant le capteur ont un niveau de référence de tension par rapport à Nesprin-HL, qui ne peut pas se lier à l' actine 2. En outre, la modulation de la contractilité cellulaire en utilisant des inhibiteurs ou des activateurs de la myosine peut être détectée par Nesprin-TS 2.
Il y a un certain nombre d'étapes critiques dans ce protocole. Confusing Nesprin-TS avec Nesprin-HL (ADN ou des cellules exprimant) ne readiment détectée, à la fois localisent de façon similaire à la membrane nucléaire, et conduira à des résultats confus. Depuis Nesprin-HL est un contrôle sans force, la FRET mesurée doit être supérieure à Nesprin-TS en moyenne. Pour être prudent, des constructions d'ADN isolées de séquençage et les cellules soigneusement étiquetage est conseillé. En second lieu, il est important d'optimiser soigneusement le gain du détecteur et la puissance du laser sur le microscope confocal pour améliorer le rapport signal-bruit et de réduire au minimum le blanchiment. Pour mesurer correctement FRET, ces paramètres doivent rester constant lors de l'acquisition d'image. De plus, l'optimisation du gain du détecteur ou de puissance pour les cellules exprimant dim ou très lumineux est suboptimale, parce que les cellules exprimant la médiane auront tendance à tomber hors de la plage dynamique du détecteur. Certaines cellules qui expriment une forte concentration de la sonde ont tendance à émettre une fluorescence dans le nucléoplasme et réticulum endoplasmique, ce qui rend difficile de résoudre la membrane nucléaire, qui est sans doute la région plus intéressante en ce qui concerne Fõrce. Sélection de cellules avec des niveaux d'expression légèrement inférieurs tend à résoudre ce problème de la localisation du capteur.
Alors que l' imagerie spectrale ratiométrique est un moyen relativement simple et rapide pour mesurer le FRET, il n'a pas d' unités de sortie d'efficacité FRET en raison de purge à 20 signal d'accepteur. Sans unités d'efficacité de FRET, il est possible de convertir l'indice de rapport de FRET dans une mesure de la force calibrée. En raison de cette limitation, peuvent être des comparaisons de force quantitatives que relative. l'efficacité de FRET peut être déterminée par des procédés plus complexes, telles que la microscopie d'imagerie à durée de vie de fluorescence (FLIM) ou photoblanchiment de l'accepteur. Force absolue (au niveau des pN) peut être estimée à partir de l' efficacité de FRET, comme décrit précédemment 3, 8.
Contrairement aux méthodes précédentes pour mesurer les propriétés mécaniques du noyau ou le déplacement du noyau à base d'on forces appliquées extérieurement, à mesurer le FRET de Nesprin-TS a l'avantage de tension non invasive de sondage sur un composant de la membrane nucléaire 16, 17, 18. Le capteur émet un signal fluorescent qui est en corrélation avec la pression exercée sur les molécules individuelles Nesprin-2G. En revanche, l'aspiration de micropipette nécessite l'utilisation d'outils délicats lorsque vous travaillez avec des cellules vivantes. ablation laser confocale provoque des dommages cellulaires local et nécessite une source laser pulsé. torsion magnétique cytométrie forces transfère sur la membrane nucléaire par le cytosquelette et ne peut être utilisé pour mesurer les forces sur les protéines spécifiques, sauf à être couplé avec le capteur de tension Nesprin-2G.
Bien qu'il ait été démontré que les forces de traction à base actine sont transférées à Nesprin-2G, un composant du complexe LINC, on ne sait pas à quel point les forces de traction ou de compression sont exercéessur d'autres protéines structurales CLIC, par exemple SUN-1 ou SUN-2. Les travaux futurs seront dirigés au clonage des sondes FRET de force dans ces porteuses putatifs des protéines CLIC pour élucider la mécanique nucléaires avec une résolution au niveau des protéines. Une autre question qui présente lui-même est que les changements de FRET peuvent être sans rapport avec les changements de tension, mais plutôt en compte les variations dans oligomérisation Nesprin-2G ou des changements conformationnels de Nesprin-2G. Les variations de pH cellulaire peuvent influencer la fluorescence du capteur et changer le FRET mesuré. Le capteur HL Nesprin-2G représente un bon contrôle pour certains de ces changements (que les changements observés FRET avec ce capteur sont très probablement sans rapport avec la force), et intermoléculaires constructions de contrôle de FRET peut être mis au point pour évaluer oligomérisation (voir ci-dessous). En outre, l'expression de TS nesprin-2G est entraînée par un promoteur du CMV, ce qui conduit à la surexpression, et ce niveau élevé d'expression peut potentiellement induire des artefacts biologiques. Les progrès récents avec clustré courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées (CRISPR) ont permis pour la réparation dirigée par homologie (HDR) se rapproche d'insérer des séquences d'ADN plus grandes dans le génome 21. Cette approche pourrait être utilisée pour modifier Nesprin-2G endogène (ou d'autres protéines) pour inclure TSmod. Cela fournirait l'expression du capteur de force en utilisant le promoteur endogène appropriée, ce qui réduit le potentiel d'artefacts de surexpression.
TSmod et d'autres sondes FRET élastique peuvent également être utilisés pour développer de nouveaux capteurs pour d'autres protéines, qui peuvent ensuite être utilisés dans un protocole similaire à celui décrit dans cet article. Une préoccupation majeure avec le développement de tout nouveau capteur de force est de déterminer le site d'insertion interne pour le capteur de FRET. Tout d'abord, le site d'insertion doit être dans une région de la protéine soumise à une charge mécanique. Ces régions peuvent être identifiées en examinant où les protéines reliées cytosquelette interagissent avec la protéine. En second lieu, l'insertiondu grand (~ 50 kDa) TSmod ne doit pas perturber la fonction biologique de la protéine étudiée. A précédemment développé « mini » forme de Nesprin-2G a montré que les domaines CH de liaison à l' actine pontés au KASH SUN-domaine de liaison étaient suffisantes pour effectuer un mouvement nucléaire Nesprin-2G dans des monocouches blessés 11, 19, ce qui suggère que l'insertion de TSmod ne serait probablement pas perturber la fonction de la protéine. Confirmation de la fonction biologique de la sonde nécessite une analyse fonctionnelle pour la fonction de la protéine (dans lequel le capteur de force peut être établi pour délivrer une fonction spécifique dans des cellules déplétées en protéine endogène). Troisièmement, les changements dans oligomérisation des protéines peuvent modifier le FRET entre les protéines (appelées FRET intermoléculaires 22), ce qui entraînerait des changements FRET qui ne sont pas liés à la force. Une analyse minutieuse de cela nécessite souvent des constructions spécialisées FRET intermoléculaires qui rapportent spécifiquement oligomérisation.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Thomas F. Miller et Kate Jeffress Memoria Trust (à DEC) et des subventions du NIH R35GM119617 (à DEC). L'imagerie par microscopie confocale a été réalisée au Centre de VCU Caractérisation de base Nanomatériaux (CCN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
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