Introduction
Kraftempfindliche, genetisch kodierte FRET Sensoren sich in letzter Zeit als ein wichtiges Werkzeug für die in lebenden Zellen dehnbare basierenden Kräfte zu messen, einen Einblick in wie mechanischen Kräften über 1 Proteine angewandt werden, 2, 3, 4. Mit diesen Werkzeugen können die Forscher nicht-invasiv Bild intrazellulären Kräfte in lebenden Zellen konventionelle Fluoreszenzmikroskope. Diese Sensoren bestehen aus einem FRET-Paar (Donor und Akzeptor - Fluoreszenzproteinen, am häufigsten ein blauen und gelben Donator - Akzeptor) , getrennt durch ein elastisches Peptid 3. Im Gegensatz zu dem C- oder N-terminalen Tagging, ist dieser Sensor in eine interne Stelle eines Proteins eingeführt, um die mechanische Kraft auf das Protein übertragen zu messen, als Molekular Dehnmessstreifen verhält. Erhöhte mechanische Spannung über den Sensor führt zu einem erhöhten Abstand zwischen dem FRET-pLuft, was zu einer verminderten FRET 3. Als Ergebnis wird der FRET umgekehrt proportional zur Zugkraft bezogen.
Diese fluoreszenzbasierten Sensoren haben für Focal Adhäsionsproteine (Vinculin 3 und Talin 4), Cytoskelett - Proteine (α-Actinin 5) und Zell-Zell - junction - Proteine (E-Cadherin 6, 7, VE-Cadherin 8 und PECAM entwickelt 8). Das am häufigsten verwendete und gut charakterisierte elastischen Linkers in diesen Biosensoren als TSmod bekannt und besteht aus einer sich wiederholenden Sequenz von 40 Aminosäuren, (GPGGA) 8, die aus dem Spinnenseidenprotein flagelliform abgeleitet wurde. TSmod wurde als lineare elastische Nanofeder mit FRET Ansprechbarkeit auf 1 bis 5 der Zugkraft pN 3 verhalten gezeigt. Verschiedene Längen von flagelliform können verwendet werden, um die dynamische r zu verändernange von TSmod FRET-Kraftempfindlichkeit 9. Zusätzlich zu flagelliform wiederholt Spektrin 5 und Villin Kopfstück Peptid (als HP35 bezeichnet) 4 haben wie die elastischen Peptide zwischen FRET-Paare in ähnlicher Kraft Biosensoren 4 verwendet. Schließlich ist ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte , dass TSmod können auch Druckkräfte 10 zu detektieren.
Kürzlich entwickelten wir einen Kraftsensor für den Linker des Nucleo-Zytoskeletts (LINC) -Komplex Protein Nesprin2G durch Verwendung TSmod in eine zuvor entwickelte verkürztes Protein als Mini-Nesprin2G (2C) bekannt Nesprin2G eingesetzt, die endogene ähnlich verhält Nesprin-2G 11. Das LINC-Komplex enthält mehrere Proteine, die von außen in das Innere des Zellkerns führt, die Verknüpfung der zytoplasmatischen Zytoskelett zum Kernlamina. Nesprin-2G ist ein Strukturprotein-Bindung an sowohl derAktin-Zytoskelett im Zytoplasma und SUN-Proteine in dem perinukleären Raum. Mit unserem Biosensor, konnten wir zeigen , dass Nesprin-2G bis 2 Aktomyosin abhängige Spannung in NIH3T3 Fibroblasten unterliegt. Dies war das erste Mal, dass Kraft direkt über ein Protein, das in der Kern LINC-Komplex gemessen wurde, und es ist wahrscheinlich ein wichtiges Instrument worden, die Rolle der Kraft auf dem Kern in Mechanobiologie zu verstehen.
Das Protokoll unten ein detailliertes Methodik, wie der Sensor Nesprin-2G Kraft zu verwenden, einschließlich der Expression des Nesprin Spannungssensors (Nesprin-TS) in Säugetierzellen, sowie die Erfassung und Analyse von Bildern von FRET-exprimierenden Zellen Nesprin- TS. Unter Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop mit einem spektralen Detektor ausgestattet ist, eine Beschreibung, wie sensibilisierten Emission messen FRET unter Verwendung Entmischung und ratiometrisch FRET-Bildgebung bereitgestellt. Die Ausgangsratiometrisches Bilder können verwendet werden, relativ qua machenntitative Kraft Vergleiche. Während dieses Protokoll auf der Expression von Nesprin-TS in Fibroblasten fokussiert wird, ist es auf andere Säugetierzellen leicht anpassbar, einschließlich Zelllinien und Primärzellen. Außerdem ist dieses Protokoll, wie es auf die Bildaufnahme und FRET-Analyse bezieht sich ohne weiteres auf andere FRET-basierten Biosensoren Kraft angepasst werden, die für andere Proteine entwickelt wurden.
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Protocol
1. Besorgen Nesprin-2G-Sensor-DNA und andere Plasmid-DNA
- Erhalten Nesprin 2G-TS (Spannungssensor), Nesprin-2G HL (ohne Kopf) -Steuerung, mTFP1, Venus und TSmod aus einer kommerziellen Quelle. Propagieren alle DNA - Plasmide und reinigen , sie Standard E. coli - Stämme verwendet, wie beispielsweise DH5-α, wie zuvor 12, 13 beschrieben.
2. Transfektion von Zellen mit Nesprin-2G und anderem Plasmid-DNA
- Wachsen NIH 3T3 - Fibroblasten - Zellen zu 70-90% Konfluenz in einer 6-Well - Zellkulturschale in einem Standard - Zellkultur - Inkubator mit der Temperatur (37 ° C) und CO 2 (5%) Regelung. Für das Zellwachstumsmedium verwendet Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum.
- In einer Zellkulturhaube Entfernen des Mediums und spülen jede Vertiefung mit etwa 1 ml einer reduzierten Serum-Zellmedium. In 800 & mgr; l reduziert Serum Zellmedium zu jeder Vertiefungund legen Sie die 6-well Kammer in dem Inkubator.
- Pipette 700 & mgr; l Serum-reduziertes Zellmedium in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 35 & mgr; l Lipid-Trägerlösung, die das „lipomix“ zu bilden. Mischen durch Pipettieren. Das Röhrchen mit einem „L“
- Sammeln sechs 1,5 ml-Röhrchen und sie 1 bis 6. Je 100 & mgr; l reduziert Serums Zellmedium in jedes Röhrchen beschriften.
- Unter Verwendung der Plasmid-DNA-Konzentration aus Schritt 1 Pipette 2 ug Nesprin 2G-TS in Röhrchen 1 und 2. Pipettieren 2 ug Nesprin-HL in Röhrchen 3 und 4. Pipettieren 1 ug mTFP in das Rohr 5. Pipette 1 ug mVenus in das Rohr 6. Setzen Sie wiederverwenden Pipettenspitzen nicht, wenn verschiedene Arten von DNA-Pipettieren.
- Je 100 & mgr; L des lipomix aus dem „L“ Rohr in jedes markierten Rohr (1-6) und durch wiederholtes Pipettieren vermischt. Mit einer sauberen Pipette für jedes Röhrchen. Inkubieren für 10-20 min.
- Füge 200 & mgr; l von jedem markierten Rohr zu einem gut in der 6-well Kammer mit 70-90% konfluentenZellen. Beschriften die Oberseite jeder Vertiefung mit der entsprechenden DNA hinzugefügt. Platzieren Sie die 6-well Kammer in einem Inkubator für 4-6 h.
- Anzusaugen, das Medium und füge 1-2 ml verringert Serum Zellmedium zu spülen. Absaugen reduziertes Serum Zellmedium, 2 ml Trypsin zu jeder Vertiefung, und legen Sie die 6-Well-Platte in dem Inkubator (5-15 min).
- Während die Zellen in dem Inkubator mantel 6 Glasbodensichtschalen mit einer Schicht von Fibronektin mit einer Konzentration von 20 ug / ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst abzulösen. Lassen Sie die Gerichte, die Oberfläche in der Zellkultur zu beschichten Haube (ca. 20 min).
- Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 2 ml DMEM, sobald die Zellen abgelöst werden.
- Transferieren des Inhalts von jeder Vertiefung zu einem markierten 15-ml-Zentrifugenröhrchen und Spin-down bei 90 × g für 5 min in einem Schwingrotor zentrifugiert. Aspirieren den Überstand und resuspendiere jedes Zellpellet in 1000 & mgr; l DMEM pipettiert Mischung.
- Absaugen Fibronektin Mischung aus demGlasschalen und Pipetten 1.000 & mgr; l jeder Zellsuspension auf die Glasschalen.
- Nachdem die Zellen auf den Boden der Glasschalen (~ 15 min) absetzen, fügen eine weitere 1 ml DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep in jede Vertiefung geben und in den Zellinkubator. Lassen Sie die Zellen befestigen und exprimieren Sensor für mindestens 18-24 h.
HINWEIS: Die Zellen werden unter Verwendung von handelsüblichen kationischen Lipid - Transfektionsreagenzien transfiziert (siehe die Tabelle der Materialien). Alternativ dazu kann eine stabile Zelllinien unter Verwendung eines Plasmid mit einem Gen , das Resistenz gegenüber einem Toxin verleiht , ausgewählt werden (die pcDNA - Plasmide für Nesprin-TS und -HL sind auf einem DNA - Repository Website zur Verfügung (die Tabelle der Materialien sehen) liefern exprimierenden Zellen Geneticin - Resistenz ). Zusätzlich können virale Infektionsmethoden (Lentivirus, Retrovirus oder Adenovirus) verwendet werden, um den Sensor in Zellen zu exprimieren, die schwer zu transfizieren. - Neben Nesprin-TS, transfizieren zusätzliche Zellen mit dem Nesprin HL Null fürce Steuerung, wie in den Schritten 2,1-2,12 beschrieben; TSmod kann auch als Nullkraftsteuerung verwendet werden und ähnliche FRET Nesprin-HL zeigen sollte.
- Transfizieren von Zellen mit mTFP1 und Venus zu erzeugen, spektralen Fingerabdruck (siehe Schritt 4).
HINWEIS: mTFP1 und Venus exprimieren typischerweise bei höheren Niveaus als Nesprin-TS, und als solche, geringere Mengen an DNA müssen möglicherweise zu transfizierenden ähnlichen Expressionsniveaus zu erreichen.
3. Überprüfen Sie Transfektionseffizienz
- Etwa 18-24 h nach der Transfektion Abschluss verwenden ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop die Effizienz der Transfektion durch Vergleichen der Anzahl der fluoreszierenden Zellen an der Gesamtzahl der Zellen in der Ansicht (in der Regel 5-30%) zu untersuchen.
- Verwenden eines Fluoreszenz-Mikroskops mit einer Anregungsfrequenz in der Nähe von 462 nm ausgestattet (mTFP1) oder 525 nm (Venus) und einem Emissionsfilter zentriert in der Nähe von 492 nm (mTFP1) oder 525 nm (Venus).
HINWEIS: Alternativ GFP Filtersets wird eine Kombination aus mTFP1 erfassen und venus-Emissionen und der Bestätigung der Transfektionseffizienz ermöglichen.
- Verwenden eines Fluoreszenz-Mikroskops mit einer Anregungsfrequenz in der Nähe von 462 nm ausgestattet (mTFP1) oder 525 nm (Venus) und einem Emissionsfilter zentriert in der Nähe von 492 nm (mTFP1) oder 525 nm (Venus).
- Bild lebenden Zellen innerhalb von 48 Stunden nach der Transfektion.
- Alternativ fixieren Zellen in 4% Paraformaldehyd (in PBS mit Calcium und Magnesium) für 5 min, zu speichern in PBS und Ansicht nach 48 h 8.
HINWEIS: über 48 h, die Signalqualität und -stärke abklingt. Fixieren der Zellen bewahrt ihren Zustand, einschließlich der FRET 8 exprimiert wird; jedoch sollten die Zellen nur in PBS bebildert werden, wie Eindeckmediums 14 FRET beeinflussen können. Die fixierten Zellen können nur mit anderen fixierten Zellen verglichen werden, da kann es zu einer Veränderung der Expression sein.
Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (PSA).
- Alternativ fixieren Zellen in 4% Paraformaldehyd (in PBS mit Calcium und Magnesium) für 5 min, zu speichern in PBS und Ansicht nach 48 h 8.
4. Erfassung Spectral Fingerabdrücken von mTFP1 und Venus Fluorophore für Entmischung
- In einer Zellkulturhaube, ersetzen das Zellmedium mit bildgebenden medium (HEPES-gepufferter) mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt ist.
- Platzieren das Betrachtungs Geschirr in einer temperaturgesteuerten (37 ° C) konfokale Mikroskoptisch.
- Das Glas Sichtschal mit mTFP1 transfizierte Zellen über das Öl-Objektiv mit 60facher Vergrößerung mit einer numerischen Apertur von 1,4.
HINWEIS: Das Öl auf einem Laser-Scanning-Mikroskop auf dem 60X Objektiv verwendet wird, eng mit dem Brechungsindex des Glassubstrats ähneln. Das Öl wird auf der Oberseite der Objektivlinse angeordnet und kommt in direktem Kontakt mit dem Deckglas. - Finde mTFP1 Zellen mit einem 458 nm-Anregungsquelle und ein Emissionsbandfilter, zentriert bei 500 nm zu exprimieren.
- Mit einer fluoreszierenden Zelle in dem Sichtfeld, wählen Sie den spektralen Detektionsmodus ( „Lambda - Modus“ in der Software hier verwendet wird ) und erfassen , die spektrale Bild (Bild 3-1); umfassen alle Frequenzen über 458 nm 10 nm Inkrementen (Bild 3-3) verwendet wird . Wählen Sie eine helle fluoreszierent-Region (ROI) auf der Zelle (20-Pixel-Radius).
HINWEIS: Die spektrale Form des mTFP1-exprimierenden ROI sollte relativ konstant über die Zelle bleiben. Wenn die Form erheblich ändert, neu justieren den Laser und Einstellungen gewinnen das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern. - In der Fluoreszenz ROI bedeutet, normalisierte Intensität der spektralen Datenbank, indem Sie auf „Spektren-Datenbank speichern.“
- Optimierung der Laserleistung und die Verstärkung derart, dass ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht wird. Die Einstellungen werden für verschiedene Geräte variieren. Die Verwendung von nicht-fluoreszierenden, nicht-transfizierten Zellen als Hintergrundreferenz, erhöhen die Verstärkung und Leistung, bis die Zellen sind hell, aber nicht über den Dynamikbereich des Detektors (Sättigungspunkt). Hintergrund Zellen sollten nicht nachweisbare Fluoreszenz haben nach durchschnittlich.
- Wiederholen Sie den Vorgang für die Venus-Zellen, die mit den folgenden Ausnahmen:
- Sicherstellen, dass die Anregungsfrequenz bei 515 nm ist, und dass das Bandpassfilter ist centered in der Nähe von 530 nm, wenn Venus-exprimierende Zellen zu lokalisieren.
- In „Spectral-Modus“, eine Anregungsfrequenz von 515 nm anstelle von 458 nm.
5. Capture-Unmixed Bilder
- Schalten Sie den Aufnahmemodus auf „Entmischung“.
- Fügen Sie die spektralen Fingerabdrücke von Venus und mTFP1 Entmischung in die Kanäle (Bild 3, Pfeil-2).
- Stellen Sie den Anregungslaser zurück zu einer 458 nm Argon-Quelle.
- Platzieren Sie den Nesprin-TS Sichtschale über dem 60X Öl-Objektiv.
- Nachdem sie mit ausreichend hell-Expression auf einer Fluoreszenzzelle konzentriert, stellen die Verstärkung und die Laserleistung das Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren.
Hinweis: Da die FRET-Effizienz von Nesprin-TS in der Nähe von 20% ist, sollte die ungemischte Venus Bild wesentlich dunkler als die ungemischte mTFP1 Bild sein. Sobald eine akzeptable Leistung und Verstärkungseinstellung iterativ bestimmt worden sind, müssen diese Parameter für alle Bilder capt konstant bleibenured. - Erfassen mindestens 15-20 Bilder von Nesprin-TS-Zellen mit relativ ähnlicher Helligkeit und zur Vermeidung von übermäßiger Pixelsättigung (alle gesättigten Pixel werden während der Bildverarbeitung entfernt).
- Wiederholen Sie die Bildaufnahme-Prozess mit Nesprin-HL-Zellen mit identischen Bildgebungsparameter.
6. Bildverarbeitung und Bildanalyse-Verhältnis
- Mit Open-Source-ImageJ (FIJI) Software (http://fiji.sc/), offene native Format von Bildern mit BioFormats Reader.
- Vorprozess die Bilder und berechnet das Verhältnis Bilder zuvor etablierte Protokolle unter Verwendung von 15.
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Representative Results
Nach dem obigen Protokoll wurde Plasmid - DNA aus der DNA - Repository erworben und in E. coli - Zellen transformierte. E. coli , den Sensor - DNA exprimieren , wurde aus LB / Ampicillin - Platten ausgewählt , und in einem flüssigen LB - Medium amplifiziert. Im Anschluss an die Amplifikation der Vektoren wurden DNA-Plasmide in TRIS-EDTA-Puffer gereinigt, wobei ein Standard verwendet, im Handel erhältliche DNA-Isolierungskits. Verwendung eines Spektrophotometers, wurde gereinigt DNA in eine Standard - Konzentration von & mgr; g / ml (1A, Tage 1-2) quantifiziert.
Verwendung von NIH3T3-Fibroblasten wurden die Zellen in einer 6-Well-Zellkulturschale aus Kunststoff zu 70-90% Konfluenz wachsen gelassen. Um Plasmid-DNA in die NIH3T3-Zellen, eine Lipid-vermittelte Transfektion Plasmid-Insert wurde durchgeführt. Im Handel erhältliche Transfektionsreagenz (die Tabelle der Materialien sehen) wurde als das Lipid Gefäß für DNA verwendet. Zwei Replikatedie Nesprin-TS und Nesprin-HL - Sensoren wurden in 4 - Zellen enthaltenden Vertiefungen (1B) transfiziert. In Vorbereitung für die FRET - Bildgebung wurden einzelne Fluorophor Konstrukte mTFP1 und Venus in NIH3T3 - Zellen (1B) transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen auf Glasboden-Schalen übertragen kompatibel mit hohen Vergrößerung, invertiert konfokalen Mikroskope betrachtet.
Bevor zur konfokalen Abbildung verläuft, ein einfaches invertiertes Weitfeldfluoreszenzmikroskop wurde verwendet, um die Transfektionseffizienz zu kontrollieren. Verwendung eines 10X - Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,25, viele Zellen in einem typischen Feld-of-view exprimierten die Nesprin-TS (Abbildung 2). Im Allgemeinen lokalisierte der Sensor um die Kernhülle, im Einklang mit der Lokalisation von endogener Nesprin 2G-2. Der Leerkraftsteuersensor, Nesprin-HL, folgte ein ähnliches Expressionsmuster 2.
Schließlich wurden die spektral aufgelösten Bildstapel importiert in ImageJ Open-Source-Software für die Verarbeitung. Die Bilder wurden vorverarbeitet und Verhältnisbilder wurden unter Verwendung von etablierten Verfahren 15 berechnet.
Abbildung 1: Experimentelle Zeitbasierte Flow Chart. (A) Beginnend mit erworbenem sensoder Plasmid - DNA, E. coli - Vektoren werden mit DNA, ausgewählt transformiert und amplifiziert (Tage 1-2). Aus konzentrierter E. coli LB - Brühe, wird Plasmid - DNA isoliert und quantifizierte (Tag 3). Unter Verwendung von gereinigter DNA - Plasmide werden NIH3T3 - Fibroblasten in einem Sechs-Well - Format transfiziert (B) und übertragen auf Glasboden - Schalen , die mit einem invertierten Konfokalmikroskop kompatibel sind (Tag 3). Um den Erfolg der Transfektion zu überprüfen, werden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet Weitfeld- ausgestattet mit den entsprechenden Filtersätzen (Tag 4). Bedingt durch eine erfolgreiche Transfektion werden die Zellen auf einem konfokalen Mikroskop mit einem spektralen Detektor ausgestattet abgebildet. Verwendung von spektraler Entmischung, mTFP1 und Venus-Kanäle werden während der Erfassung getrennt und gespeichert als spektral aufgelöste Bildstapel (Tage 4-5). Schließlich werden die Bilder in ImageJ vorverarbeitet und das Verhältnis-Bilder berechnet werden. Please Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: ein repräsentatives Bild von Transfizierte NIH3T3 Fibroblasten. (A) 10 - facher Vergrößerung von transfizierten NIH3T3 Fibroblasten exprimieren Nesprin-TS eines GFP Filterset verwenden. (B) eine Explosionsansicht des Begrenzungsrahmens aus Teil A. Sensor Ausdruck folgt der Kernhülle und erstreckt sich oft in das Zytoplasma. (C) Nesprin-TS und -HL Steuerung und wie sie binden an das Actin und SUN - Bindungsdomänen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Spectral Fingerprinting-Kursus Confocal Software. Normalisierten Emissionsspektren von 20-Pixel-Radien in den markierten Regionen von Interesse abgegrenzt durch farbiges Fadenkreuz erhalten. (Pfeil-1) Spektrale Detektionsmodus das Bild zu erfassen. (Pfeil-2) „Entmischung“ -Einstellung normalisierte Spektren der spektralen Datenbank hinzuzufügen. (Pfeil-3), um die Anregungsfrequenz. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Live - Entmischung und Ausgabe von Confocal Software. (A) Kritische Bildgebungsparameter Live, ungemischte Bilder zu reproduzieren. (Pfeil-1), um die Anregungsfrequenz. (Pfeil-2) Live Entmischung Modus. (B) Nuclei Bild in ungemischten Venus - Kanal. (
Abbildung 5: Nesprin-TS FRET Verhältnis Bilder in strukturierte und unstrukturierte Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen. MDCK - Zellen , die stabil Nesprin-TS exprimieren , wurden auf 10 & mgr; m breiten Linien Fibronektin (A) oder unstrukturierte Polydimethylsiloxan (PDMS) Membranen (B) abgebildet wird . Kernmembranen wurden visuell maskiert und in FRET-Verhältnisse verarbeitet. Die Farbskala Balken stellen das FRET-Verhältnis Amplitude für unstrukturierte und strukturierte Kerne.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Verarbeitete Ratiometrisch FRET Bilder von Nesprin-TS-exprimierenden Zellen und Histogramm - Analyse aggregierter Daten. (A) Ein repräsentative, normalisierte gestapelte Histogramm von FRET Verhältnis Bildern von Nesprin-TS mit ML7 Myosin - Inhibitor behandelt, farbkodierte durch einzelne Zellkerne. (B) ein Vertreter, normalisierte gestapelte Histogramm von FRET Verhältnis Bildern von Nesprin-TS , behandelt mit Calyculin A, einem Aktivator der Zelle Kontraktilität. Die Legende korreliert jeden analysierten Kern seiner Lage auf dem Histogramm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Ein Verfahren und eine Demonstration der Abbildung lebender Zellen der mechanischen Spannung über Nesprin-2G, ein Protein in der Kern LINC-Komplex, wurden oben beschrieben. Vor dieser Arbeit wird verschiedene Techniken, wie zum Beispiel Mikropipette Bestrebung, Cytometry Magneten Wulst und mikroskopische Laserablation, verwendet worden , um Druck auf dem Zellkern zu übernehmen und seine Eigenschaften Schüttguts 16, 17, 18 zu messen. Doch bis unsere jüngsten Arbeiten hatten keine Studien direkt gezeigt , dass Zugkräfte direkt auf ein LINC - Komplex Protein in lebenden Zellen 2 übertragen werden.
Zuvor zeigte unser Labor , dass eine modifizierte Version von Nesprin2G, bekannt als Mini-Nesprin2G, konstruiert werden, um eine FRET-Kraftsonde als TSmod (2C) 2 bekannt auszudrücken. TSmod wurde zuvor dehnbare zu messen, um dynamisch gezeigt fürces in lebenden Zellen und in verschiedenen tragenden Proteinen 3, 4, 6, 8. Es wurde ferner gezeigt , daß mini-Nesprin-2G von endogenem Nesprin-2G hinsichtlich seiner Lokalisierung, bekannten Auswirkungen auf das Cytoskelett nicht zu unterscheiden war, und die Fähigkeit , nukleare Positionierung 11, 19 zu befreien. Unter Verwendung des Mini-2G Nesprin Protein mit der TSmod (Nesprin-TS), wurde gezeigt , dass Fibroblasten NIH3T3 Exprimieren der Sensor einen Basislinienspannungspegel relativ zu Nesprin-HL haben, was 2 Aktin nicht binden können. Darüber hinaus kann die Modulation der Kontraktilität zellulären Inhibitoren oder Aktivatoren von Myosin unter Verwendung von Nesprin-TS 2 detektiert werden.
Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in diesem Protokoll. Confusing Nesprin-TS mit Nesprin-HL (DNA oder exprimierende Zellen) nicht readily erkannt, da beide ähnlich wie die Kernmembran lokalisieren und zu verwirrenden Ergebnissen führen werden. Da Nesprin-HL ist eine No-Kraftregelung, sollte die gemessene FRET höher sein als Nesprin-TS im Durchschnitt. Vorsichtig sein, Sequenzierung isoliert DNA-Konstrukte und sorgfältig Markierung von Zellen werden empfohlen. Zweitens ist es wichtig, sorgfältig die Detektorverstärkung und Laserleistung auf dem konfokalen Mikroskop zu optimieren das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern und Bleichen zu minimieren. Um richtig FRET zu messen, müssen diese Parameter bei der Bildaufnahme konstant bleiben. Darüber hinaus für schwache oder sehr helle exprimierenden Zellen die Detektorverstärkung oder Leistungs Optimierung ist suboptimal, weil Median-exprimierenden Zellen werden aus dem Dynamikbereich des Detektors fallen neigen. Bestimmte Zellen, die eine hohe Konzentration von Sensor exprimieren neigen in Nukleoplasma und endoplasmatischen Retikulum fluoreszieren, so dass es schwierig, die Kernmembran zu lösen, die vermutlich ist die interessantere Region in Bezug auf force. Markieren von Zellen mit etwas niedrigeren Expressionsniveaus neigt dieses Problem von Sensor Lokalisierung zu lösen.
Während ratiometrisch spektrale Bildgebung eine relativ einfache und schnelle Art und Weise ist FRET zu messen, hat es nicht die Ausgabeeinheiten Wirkungsgrad FRET aufgrund Akzeptorsignal Durchbluten 20. Ohne Einheiten der FRET-Effizienz ist es nicht möglich, den FRET-Verhältnis-Index in eine kalibrierte Kraftmessung umzuwandeln. Aufgrund dieser Einschränkung können nur relative quantitative Kraft Vergleiche gemacht werden. FRET-Effizienz kann durch kompliziertere Verfahren, wie Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) oder Akzeptor Photobleaching bestimmt werden. Absolute Kraft (auf der Ebene pN) von FRET - Effizienz geschätzt werden, wie zuvor beschrieben , 3, 8.
Im Gegensatz zu früheren Verfahren, die mechanischen Eigenschaften des Kerns oder die Verschiebung des Kerns auf Basis os messenn von außen aufgebrachten Kräften, die FRET - Messung von Nesprin-TS den Vorteil , nicht-invasiv Sondieren Spannung auf einer Komponente der Kernmembran hat 16, 17, 18. Der Sensor gibt ein Fluoreszenzsignal, das mit dem Stamm an einzelnen Nesprin-2G Molekülen korreliert ist. Im Gegensatz dazu erfordert Mikro Aspiration die Verwendung von empfindlichen Instrumenten, wenn sie mit lebenden Zellen arbeiten. Konfokales Laser-Ablation bewirkt eine lokale Zellschäden und erfordert eine gepulste Laserquelle. Magnetischer Verdrillung Cytometry Transfers Kräfte auf die Kernmembran über das Zytoskelett und kann nicht verwendet werden, Kräfte auf spezifische Proteine zu messen, wenn es mit dem Nesprin-2G Spannungssensor gekoppelt werden sollten.
Während es gezeigt wurde, dass Aktin-basierte Zugkräften Nesprin-2G übertragen werden, Bestandteil des LINC-Komplex, bleibt es unbekannt, wie viel Zug- oder Druckkräfte ausgeübt werden,auf andere strukturelle LINC Proteine, wie SUN-1 oder SUN-2. Zukünftige Arbeiten werden bei Klonieren FRET-Sonden Kraft in diese putativen tragenden LINC Proteine gerichtet werden, um Kernmechanik mit Protein-Ebene Auflösung aufzuklären. Ein weiteres Problem, das sich stellt, ist, dass Änderungen in FRET kann auf Änderungen der Spannung, sondern reflektieren entweder Änderungen in Nesprin-2G Oligomerisierung oder Konformationsänderungen von Nesprin-2G nicht verwandt sein. Veränderungen in der zellulären pH-Wert können die Fluoreszenz des Sensors beeinflussen und den gemessenen FRET verändern. Der Nesprin-2G HL Sensor stellt eine gute Kontrolle für einige dieser Veränderungen (wie FRET Änderungen mit diesem Sensor beobachtet wurden, sind höchstwahrscheinlich ohne Bezug zu zwingen) und intermolekulare FRET Kontrollstrukturen entwickelt werden können, Oligomerisierung zu bewerten (siehe unten). Darüber hinaus wird die Expression von Nesprin-2G TS durch einen CMV-Promotor gesteuert wird, die in der Überexpression ergibt, und diese hohe Expression kann potentiell biologische Artefakte induziert. Jüngste Fortschritte mit cglänzender regelmäßig voneinander beabstandeten kurzer palindromischen Repeats (CRISPR) auf Homologie-directed Reparatur erlaubt hat (HDR) Ansätze 21 größere DNA - Sequenzen in das Genom einzufügen. Dieser Ansatz könnte verwendet werden, endogene Nesprin-2G (oder andere Proteine) zu modifizieren TSmod aufzunehmen. Dies würde die Expression des Kraftsensors liefert das entsprechende endogene Promotor verwendet wird, das Potenzial für eine Überexpression Artefakte zu reduzieren.
TSmod und andere elastischen FRET-Sonden können auch neue Sensoren für andere Proteine zu entwickeln, verwendet werden, die dann in einem ähnlichen Protokoll wie die in diesem Artikel beschriebenen verwendet werden könnten. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung eines neuen Kraftsensors ist die Bestimmung die interne Insertionsstelle für den FRET-Sensor. Erstens muss die Insertionsstelle in einer Region des gegenüber mechanischer Belastung ausgesetzt Proteins sein. Diese Bereiche können durch die Untersuchung identifiziert werden, in dem Zytoskelett-Proteine interagieren, verbunden mit dem Protein. Zweitens ist die Einfügungder großen (~ 50 kDa) TSmod muss die biologische Funktion des Proteins untersucht, nicht stören. Eine früher entwickelte „mini“ Form Nesprin-2G gezeigt , dass aktinbindenden CH - Domänen der SUN-bindende KASH Domäne ausreichend überbrückt waren für Nesprin-2G Atombewegung in verwundeten Monoschichten 11, 19, was darauf hindeutet , dass die Einfügung von TSmod würde wahrscheinlich nicht stören Proteinfunktion. Bestätigung der biologischen Funktion des Sensors erfordert einen funktionellen Assay für die Protein-Funktion (in der der Kraftsensor eine spezifische Funktion in den Zellen retten kann gezeigt werden, von endogenem Protein abgereichert). Drittens, Veränderungen des Protein Oligomerisierung können die FRET zwischen Proteinen (bezeichnet als intermolekularer FRET 22) verändern, die in FRET Veränderungen führen würden , die nicht im Zusammenhang zu erzwingen. Eine sorgfältige Analyse erfordert dies häufig spezialisierte intermolekularen FRET-Konstrukte, die speziell Oligomerisierung melden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memoria Trust (DEC) und NIH gewähren R35GM119617 unterstützt (DEC). Die konfokale Mikroskop Bildgebung wurde an der VCU Nano Characterization Core (NCC) Facility durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
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