Introduction
Sensible a la Fuerza, los sensores FRET codificados genéticamente han surgido recientemente como una herramienta importante para la medición de fuerzas de tracción a base de en células vivas, proporcionando información sobre cómo las fuerzas mecánicas son aplicada a través de proteínas de 1, 2, 3, 4. Con estas herramientas, los investigadores pueden tomar imágenes de forma no invasiva fuerzas intracelulares en células vivas utilizando microscopios fluorescentes convencionales. Estos sensores consisten en una FRET-par (proteínas donantes y fluorescentes aceptor, más frecuentemente un donante azul y el aceptor de color amarillo) separados por un péptido elástico 3. En contraste con C- o etiquetado N-terminal, este sensor se inserta en un sitio interno de una proteína para medir la fuerza mecánica transmitida a través de la proteína, comportándose como un medidor de deformación molecular. Aumento de la tensión mecánica a través de los resultados del sensor en un aumento de la distancia entre la FRET-paire, resultando en la disminución de FRET 3. Como resultado, la FRET es inversamente proporcional a la fuerza de tracción.
Estos sensores a base de fluorescentes han sido desarrollados para las proteínas de adhesión focal (vinculina 3 y talina 4), proteínas del citoesqueleto (α-actinina 5), y proteínas de unión célula-célula (E-cadherina 6, 7, VE-cadherina 8, y PECAM 8). El engarce elástico usado con más frecuencia y bien caracterizado en estos biosensores se conoce como TSmod y consiste en una secuencia repetitiva de 40 aminoácidos, (GPGGA) 8, que se deriva de la flagelliform proteína de seda de araña. TSmod se ha demostrado que comportarse como un nano-resorte elástico lineal, con la capacidad de respuesta de FRET a 1 a 5 pN de fuerza de tracción 3. Diferentes longitudes de flagelliform se pueden utilizar para alterar la dinámica range de sensibilidad TSmod FRET-fuerza 9. Además de flagelliform, espectrina repite 5 y vilina péptido pieza de cabeza (conocido como HP35) 4 se han utilizado como los péptidos elásticos entre FRET pares en biosensores fuerza similar 4. Por último, un informe reciente mostró que TSmod también se puede utilizar para detectar las fuerzas de compresión 10.
Recientemente hemos desarrollado un sensor de fuerza para el enlazador de la núcleo-citoesqueleto (LINC) complejo de proteínas Nesprin2G utilizando TSmod inserta en una proteína truncada Nesprin2G desarrollado previamente conocida como mini-Nesprin2G (Figura 2C), que se comporta de manera similar a endógena nesprin-2G 11. El complejo LINC contiene múltiples proteínas que conducen desde el exterior hacia el interior del núcleo, que une el citoesqueleto citoplásmico de la lámina nuclear. Nesprin-2G es vinculante una proteína estructural tanto a lacitoesqueleto de actina en el citoplasma y a las proteínas de sol en el espacio perinuclear. Utilizando nuestro biosensor, hemos sido capaces de demostrar que nesprin-2G está sujeta a la tensión actomyosin depende en fibroblastos NIH3T3 2. Esta fue la primera vez que la fuerza se midió directamente a través de una proteína en el complejo LINC nuclear, y es probable que se convierta en una herramienta importante para entender el papel de la fuerza en el núcleo en mecanobiología.
El protocolo a continuación proporciona una metodología detallada de cómo utilizar el sensor de fuerza nesprin-2G, incluyendo la expresión del sensor de tensión nesprin (nesprin-TS) en células de mamífero, así como la adquisición y análisis de imágenes de FRET de células que expresan Nesprin- TS. El uso de un microscopio confocal invertido equipado con un detector espectral, una descripción de cómo medir la emisión sensibilizada FRET usando desmezcla espectral y está provisto de imágenes FRET radiométrica. Las imágenes radiométricas de salida pueden ser usados para hacer qua relativacomparaciones de fuerza ntitative. Mientras que este protocolo se centra en la expresión de nesprin-TS en los fibroblastos, es fácilmente adaptable a otras células de mamífero, incluyendo las dos líneas celulares y células primarias. Además, este protocolo que se refiere a la adquisición de imágenes y el análisis FRET puede adaptarse fácilmente a otros biosensores de fuerza basados en FRET que han sido desarrollados para otras proteínas.
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Protocol
1. Obtener ADN Sensor nesprin-2G y otro ADN plásmido
- Obtener nesprin-2G TS (sensor de tensión) de control, nesprin-2G HL (sin cabeza), mTFP1, venus, y TSmod de una fuente comercial. Propagar todos los plásmidos de ADN y purificarlos usando cepas estándar de E. coli, tales como DH5-α, como se ha descrito previamente 12, 13.
2. Las células transfectar con nesprin-2G y otro ADN plásmido
- Se cultivan las células de fibroblastos NIH 3T3 a 70-90% de confluencia en una placa de cultivo celular de 6 pocillos en un incubador de cultivo celular estándar con la temperatura (37 ° C) y la regulación de CO 2 (5%). Para el medio de crecimiento celular, utilice medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal al 10%.
- En una campana de cultivo celular, se elimina el medio y enjuague cada pocillo con aproximadamente 1 ml de un medio de células de suero reducido. Añadir 800! L de medio de células de suero reducido a cada pocilloy colocar la cámara de 6 pocillos en la incubadora.
- Pipetear 700 l de medio de células de suero reducido en un tubo de 1,5 ml con 35 l de solución de vehículo lipídico para formar el "lipomix". Mezclar con la pipeta. Etiquetar el tubo con una "L"
- Reunir seis tubos de 1,5 mL y los etiquetar 1 a 6. Pipetear 100 l de medio de células de suero reducido en cada tubo.
- Uso de la concentración de plásmido de ADN de la etapa 1, una pipeta 2 g de nesprin 2G-TS en los tubos 1 y 2. Pipetear 2 g de nesprin-HL en tubos 3 y 4. pipeta de 1 g de MTFP en el tubo 5. Pipetear 1 g de mVenus en el tubo 6. no vuelva a usar las puntas de pipeta en el pipeteado de diferentes tipos de ADN.
- Pipetear 100 l de la lipomix desde el tubo de "L" en cada tubo marcado (1-6) y mezclar mediante pipeteo repetido. Usar una pipeta limpia para cada tubo. Incubar durante 10-20 min.
- Añadir 200! L de cada tubo marcado a un bien en la cámara de 6 pocillos con 70-90% de confluenciaCélulas. Etiqueta de la parte superior de cada pocillo con el ADN correspondiente añadió. Coloque la cámara de 6 pocillos en un incubador durante 4-6 h.
- Aspirar el medio y añadir 12 ml de medio de células de suero reducido para enjuagar. Aspirar el medio de células de suero reducido, añadir 2 ml de tripsina a cada pocillo, y colocar la placa de 6 pocillos en la incubadora (5-15 min).
- Mientras que las células se desprenden en la incubadora, capa 6 de vidrio con fondo de la visualización de los platos con una capa de fibronectina a una concentración de 20 mg / ml disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Permitir los platos para recubrir la superficie en la campana de cultivo de células (aproximadamente 20 min).
- Neutralizar la tripsina mediante la adición de 2 ml de DMEM una vez que se separan las células.
- La transferencia de los contenidos de cada pocillo a un tubo de centrífuga de 15 ml etiquetados y girar hacia abajo en 90 xg durante 5 min en una centrífuga de rotor de balanceo. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender cada sedimento celular en 1.000 l de DMEM por mezcla pipeta.
- Aspirar la mezcla de fibronectina a partir de laplatos de vidrio y pipeta de 1.000 l de cada suspensión celular en los platos de vidrio.
- Después de que las células se depositan en el fondo de las placas de vidrio (~ 15 min), añadir otro 1 ml de DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep a cada pocillo y colocar en el incubador de células. Dejar que las células se unan y expresan sensor durante al menos 18-24 h.
NOTA: Las células se transfectaron utilizando reactivos de transfección de lípidos catiónicos comerciales (véase la Tabla de Materiales). Alternativamente, las líneas celulares estables se pueden seleccionar mediante el uso de un plásmido con un gen que confiere resistencia a una toxina (los plásmidos pcDNA para nesprin-TS y -HL están disponibles en un sitio web repositorio de ADN (véase la Tabla de Materiales) proporcionar células que expresan la resistencia a geneticina ). Además, los métodos de infección viral (lentivirus, retrovirus, o adenovirus) se pueden utilizar para expresar el sensor en las células que son difíciles de transfectar. - Además de nesprin-TS, transfectar células adicionales con el nesprin HL cero porde control CE, tal como se describe en los pasos 2.1-2.12; TSmod también se puede utilizar como un control de fuerza cero y debe exhibir FRET similar a nesprin-HL.
- células transfectar con mTFP1 y venus para generar huellas espectrales (ver paso 4).
NOTA: mTFP1 y venus típicamente expresan en niveles más altos que nesprin-TS, y como tal, pueden necesitar ser transfectadas para lograr niveles similares de expresión cantidades menores de ADN.
3. Verificar la eficacia de transfección
- Aproximadamente 18-24 h después de completar la transfección, usar un microscopio de fluorescencia invertida para examinar la eficacia de la transfección mediante la comparación del número de células fluorescentes para el número total de células en vista (por lo general 5-30%).
- Utilice un microscopio de fluorescencia equipado con una frecuencia de excitación cerca de 462 nm (mTFP1) o 525 nm (venus) y un filtro de emisión centrada cerca de 492 nm (mTFP1) o 525 nm (venus).
NOTA: Como alternativa, GFP conjuntos de filtros capturará una combinación de mTFP1 y cinconus emisiones y permitirán la confirmación de la eficacia de transfección.
- Utilice un microscopio de fluorescencia equipado con una frecuencia de excitación cerca de 462 nm (mTFP1) o 525 nm (venus) y un filtro de emisión centrada cerca de 492 nm (mTFP1) o 525 nm (venus).
- células vivas imágenes dentro de 48 horas después de la transfección.
- Alternativamente, fijar las células en paraformaldehído al 4% (en PBS con calcio y magnesio) durante 5 min, tienda en PBS, y la vista después de 48 h 8.
NOTA: Más allá de 48 h, la calidad de la señal y la fuerza decae. La fijación de las células conserva su estado, incluyendo la FRET ser expresado 8; sin embargo, las células sólo deben ser reflejados en PBS, como medio de montaje puede afectar FRET 14. Las células fijadas sólo pueden ser comparadas con otras células fijas, ya que puede haber un cambio en la expresión.
Precaución: El paraformaldehído es tóxico. Usar los equipos de protección personal (EPP) apropiado.
- Alternativamente, fijar las células en paraformaldehído al 4% (en PBS con calcio y magnesio) durante 5 min, tienda en PBS, y la vista después de 48 h 8.
4. Captura de Huellas dactilares espectral de mTFP1 y Venus fluoróforos de desmezcla espectral
- En una campana de cultivo de células, sustituir el medio celular con mediu de formación de imágenesm (HEPES-tamponada) suplementado con suero bovino fetal al 10%.
- Colocar las cápsulas de visión en un (37 ° C) platina del microscopio confocal de temperatura controlada.
- Coloque el plato de visualización de cristal con células transfectadas con mTFP1 sobre el objetivo de aceite a 60X de ampliación con una apertura numérica de 1,4.
NOTA: El aceite se utiliza en un microscopio de barrido láser en el objetivo 60X para parecerse estrechamente el índice de refracción del sustrato de vidrio. El aceite se coloca en la parte superior de la lente objetivo y entra en contacto directo con el cubreobjetos de vidrio. - Localizar mTFP1 células que expresan con una fuente de excitación 458 nm y un filtro de paso de banda de emisión centrada a 500 nm.
- Con una célula fluorescente en el campo de visión, seleccionar el modo de detección espectral ( "Modo Lambda" en el software utilizado aquí) y capturar la imagen espectral (Figura 3-1); incluir todas las frecuencias más allá de 458 nm utilizando incrementos de 10 nm (Figura 3-3). Seleccionar un brillante FLUORESCregión ENT (ROI) en la celda (radio de 20 píxeles).
NOTA: La forma espectral de la mTFP1-expresión de ROI debe permanecer relativamente constante a través de la célula. Si la forma varía considerablemente, vuelva a ajustar el láser y obtener la configuración para mejorar la relación señal-ruido. - Añadir significa el retorno de la inversión fluorescente, intensidad normalizada a la base de datos espectral haciendo clic en "guardar espectros a la base de datos."
- Optimizar la potencia del láser y ganancia de tal manera que se consigue una buena relación señal-ruido. Ajustes variarán para diferentes equipos. El uso de células no fluorescentes, no transfectadas como referencia de fondo, aumentar la ganancia y la potencia hasta que las células son brillantes, pero no más allá del rango dinámico del detector (punto de saturación). células de fondo no deben tener fluorescencia detectable después de promediar.
- Repetir el proceso para las células transfectadas con venus con las siguientes excepciones:
- Asegúrese de que la frecuencia de excitación es a 515 nm y que el filtro de paso de banda es centered cerca de 530 nm cuando la localización de las células venus-expresan.
- En "Modo espectral," utilizar una frecuencia de excitación de 515 nm en lugar de 458 nm.
5. Capturar imágenes sin mezclar
- Cambiar el modo de captura a "Spectral desmezcla."
- Añadir las huellas espectrales de venus y mTFP1 en los canales de desmezcla (Figura 3, Arrow-2).
- Ajuste el láser de excitación de nuevo a una fuente de argón 458 nm.
- Coloque el plato de visión nesprin-TS encima del objetivo aceite de 60X.
- Después de centrarse en una célula fluorescente con la expresión suficientemente brillante, ajustar la potencia de ganancia y láser para optimizar la relación señal-ruido.
NOTA: Dado que la eficiencia de FRET de nesprin-TS es cerca de 20%, la imagen venus sin mezclar debe ser sustancialmente dimmer la imagen mTFP1 sin mezclar que. Una vez que el ajuste de la potencia y la ganancia aceptable se han determinado de forma iterativa, estos parámetros deben permanecer constantes para todas las imágenes captured. - Captura de un mínimo de 15-20 imágenes de células nesprin-TS con brillo relativamente similar y evitar la saturación excesiva pixel (todos los píxeles saturados se eliminan durante el procesamiento de imágenes).
- Repetir el proceso de captura de imagen con células nesprin-HL utilizando parámetros de imagen idénticos.
6. Procesamiento y Análisis de Imágenes Relación imagen
- Usando el software de fuente abierta ImageJ (Fiji) (http://fiji.sc/), abiertos imágenes de formato nativo utilizando BioFormats Reader.
- Pre-proceso de las imágenes y calcular el ratio de imágenes utilizando protocolos previamente establecidos 15.
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Representative Results
Siguiendo el protocolo anterior, el plásmido de ADN fue adquirido desde el repositorio de ADN y se transformó en células de E. coli. E. coli que expresan el DNA sensor fueron seleccionados de placas LB / ampicilina y se amplificaron en un caldo LB líquido. Después de la amplificación de los vectores, los plásmidos de ADN se purificaron en tampón Tris-EDTA utilizando un estándar, disponible comercialmente kit de aislamiento de ADN. El uso de un espectrofotómetro, el ADN purificado se cuantificó en una concentración estándar de g / ml (Figura 1A, Días 1-2).
Uso de fibroblastos NIH3T3, las células fueron cultivadas a 70-90% de confluencia en una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos. Para insertar el ADN del plásmido en las células NIH3T3, se realizó un plásmido de transfección mediada por lípidos. Comercialmente reactivo de transfección disponibles (véase la Tabla de Materiales) se utilizó como el recipiente de lípidos para el ADN. Dos réplicas delos sensores nesprin-TS y nesprin-HL se transfectaron en 4 pocillos de células (Figura 1B). En la preparación para formación de imágenes FRET, los constructos de fluoróforos individuales de mTFP1 y venus se transfectaron en células NIH3T3 (Figura 1B). Después de la transfección, las células se transfirieron a vidrio con fondo de la visualización de platos compatibles con una gran ampliación, microscopios confocales invertidos.
Antes de proceder a la imagen confocal, un simple microscopio de fluorescencia de campo amplio invertida se usó para verificar la eficiencia de transfección. El uso de un objetivo de 10X con una apertura numérica de 0,25, muchas células en un campo de visión-típico expresaron la nesprin-TS (Figura 2). Generalmente, el sensor localiza alrededor de la envoltura nuclear, coherente con la localización endógena de nesprin-2G 2. El sensor de control sin fuerza, nesprin-HL, siguió un patrón de expresión similar 2.
Por último, las pilas de imágenes espectralmente resueltas se importan al software de fuente abierta ImageJ para su procesamiento. Las imágenes fueron pre-procesados, y las imágenes de relación se calcularon utilizando procedimientos establecidos 15.
Figura 1: Diagrama de flujo en función del tiempo experimental. (A) A partir de sens adquiridoso plásmido de ADN, vectores de E. coli se transforman con ADN, seleccionados, y se amplificaron (días 1-2). De caldo de E. coli LB concentrado, el ADN del plásmido se aísla y se cuantificó (día 3). El uso de plásmidos de ADN purificadas, los fibroblastos NIH3T3 se transfectan en un formato de seis pocillos (B) y se transfirieron en placas con fondo de vidrio que son compatibles con un microscopio confocal invertido (día 3). Para verificar el éxito de la transfección, las células se observan bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con los conjuntos de filtros apropiados (día 4). Contingente sobre una transfección con éxito, las células se forman imágenes en un microscopio confocal equipado con un detector espectral. Uso de desmezcla espectral, canales mTFP1 y Venus se separan durante la adquisición y se guardan como pilas de imágenes espectralmente resueltos (días 4-5). Por último, las imágenes son preprocesados en ImageJ, y la relación de imágenes se calculan. Please clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: una imagen representativa de NIH3T3 transfectadas fibroblastos. (A) ampliación 10X de fibroblastos NIH3T3 transfectadas que expresan nesprin-TS usando un Filterset GFP. (B) una vista despiezada de la caja de contorno de la expresión parte A. Sensor sigue la envoltura nuclear y, a menudo se extiende en el citoplasma. (C) nesprin-TS y Control -HL y la forma en que se unen a la actina y dominios de unión a sol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Spectral huellas dactilares Tutorial Uso de Confocal Software. espectros de emisión normalizados obtenidos de radios 20 píxeles en las regiones de intereses resaltados delineados por retículos de colores. (Arrow-1) modo de detección espectral para capturar la imagen. (Arrow-2) "Spectral desmezcla" Configuración de añadir espectros normalizados a la base de datos espectral. (Arrow-3) La frecuencia de excitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Vivo espectral desmezcla y salida de Confocal Software. (A) los parámetros de imagen críticos para reproducir imágenes en vivo, sin mezclar. (Arrow-1) la frecuencia de excitación. (Arrow-2) Live modo de desmezcla espectral. Imagen (B) Núcleos en el canal venus sin mezclar. (
Figura 5: las imágenes de relación de nesprin-TS FRET en el riñón Madin-Darby Canine estampadas y sin patrón (MDCK) células. Células MDCK que expresan de manera estable nesprin-TS fueron imágenes en 10 líneas mu m de ancho de fibronectina (A) o polidimetilsiloxano unpatterned (PDMS) membranas (B). membranas nucleares fueron enmascarados visualmente y se procesan en relaciones de FRET. La barra de color escala representa la relación de amplitud FRET para los núcleos sin dibujo y estampadas.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Procesado Imágenes Ratiometric FRET de las células y análisis de histograma de Datos Agregados nesprin-TS-Expresando. (A) Un representante, normalizado histograma apilado de imágenes de relación de FRET de nesprin-TS tratados con ML7 inhibidor de la miosina, un código de colores por núcleos de las células individuales. (B) Un representante, normalizado histograma apilado de imágenes de relación de FRET de nesprin-TS tratados con Calyculin A, un activador de la contractilidad celular. La leyenda se correlaciona cada núcleo analizado a su ubicación en el histograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un método y la demostración de imágenes de células vivas de la tensión mecánica a través de nesprin-2G, una proteína en el complejo nuclear de LINC, se esbozó anteriormente. Antes de este trabajo, varias técnicas, tales como la aspiración de micropipeta, magnético en perlas de citometría, y microscópica láser de ablación, se han utilizado para aplicar tensión en el núcleo de la célula y para medir sus propiedades de material a granel 16, 17, 18. Sin embargo, hasta nuestro último trabajo, ningún estudio había demostrado directamente que las fuerzas de tracción se transfieren directamente a un complejo de proteínas en células vivas LINC 2.
Anteriormente, nuestro laboratorio demostró que una versión modificada de Nesprin2G, conocida como mini-Nesprin2G, podría modificarse por ingeniería genética para expresar una sonda FRET-fuerza conocida como TSmod (Figura 2C) 2. TSmod fue demostrado previamente para medir de forma dinámica a la tracción paraces en células vivas y en diversas proteínas de soporte de carga 3, 4, 6, 8. Se demostró además que mini-nesprin-2G fue indistinguible de endógeno nesprin-2G con respecto a su localización, conocidos efectos sobre el citoesqueleto, y la capacidad para rescatar posicionamiento nuclear 11, 19. Uso de la proteína mini nesprin-2G con la TSmod (nesprin-TS), se demostró que los fibroblastos NIH3T3 que expresan el sensor tienen un nivel de línea de base de la tensión con respecto a nesprin-HL, que no puede unirse a la actina 2. Además, la modulación de la contractilidad celular utilizando inhibidores o activadores de la miosina puede ser detectado por nesprin-TS 2.
Hay una serie de pasos críticos en este protocolo. La confusión nesprin-TS con nesprin-HL (ADN o células que expresan) no es readiLy detectado, ya que ambos de manera similar se localizan en la membrana nuclear, y dará lugar a resultados confusos. Desde nesprin-HL es un control sin fuerza, la FRET medido debe ser más alta que nesprin-TS en promedio. Para ser prudente, se aconseja aislado de secuenciación de constructos de ADN y las células de etiquetado cuidadosamente. En segundo lugar, es importante para optimizar el cuidado de la ganancia del detector y la potencia del láser en el microscopio confocal para mejorar la relación señal-ruido y para minimizar la decoloración. Para medir correctamente FRET, estos parámetros deben permanecer constante durante la adquisición de imágenes. Además, la optimización de la ganancia del detector o de energía para las células que expresan tenues o muy brillantes es subóptima, porque las células que expresan la mediana tenderán a caer fuera de la gama dinámica del detector. Ciertas células que expresan una alta concentración de sensores tienden a mostrar fluorescencia en el nucleoplasma y el retículo endoplásmico, por lo que es difícil resolver la membrana nuclear, que presumiblemente es la región más interesante con respecto a FORCE. La selección de células con ligeramente más bajos niveles de expresión tiende a resolver este problema de la localización del sensor.
Mientras que la imagen espectral radiométrico es una manera relativamente simple y rápido para medir FRET, lo hace unidades no de salida de la eficiencia de FRET debido a la señal de aceptor de purga a través de 20. Sin unidades de eficiencia FRET, no es posible convertir el índice de relación de FRET en una medición de la fuerza calibrada. Debido a esta limitación, las comparaciones cuantitativas de fuerza único pariente se pueden hacer. eficiencia de FRET se puede determinar por métodos más complicados, tales como imágenes de microscopía de fluorescencia de vida (FLIM) o photobleaching aceptor. Fuerza absoluta (a nivel de pN) puede estimarse a partir eficiencia FRET, como se describe previamente 3, 8.
En contraste con los métodos anteriores para medir las propiedades mecánicas del núcleo o el desplazamiento del núcleo a base de on fuerzas aplicadas externamente, la medición de la FRET de nesprin-TS tiene la ventaja de no invasiva tensión de sondeo en un componente de la membrana nuclear 16, 17, 18. El sensor emite una señal fluorescente que se correlaciona con la tensión en moléculas individuales nesprin-2G. Por el contrario, la aspiración micropipeta requiere el uso de herramientas delicadas cuando se trabaja con células vivas. la ablación con láser confocal causa daño celular local y requiere una fuente de láser pulsado. torsión magnética citometría de fuerzas transfiere sobre la membrana nuclear a través del citoesqueleto y no puede ser usado para medir fuerzas en proteínas específicas, a menos que fuera para ser acoplado con el sensor de tensión nesprin-2G.
Si bien se ha demostrado que las fuerzas de tracción a base de actina se transfieren a nesprin-2G, un componente del complejo LINC, sigue siendo desconocido cuánto se ejercen fuerzas de tracción o de compresiónen otras proteínas estructurales LINC, tales SUN-1 o SUN-2. El trabajo futuro será dirigida a la clonación sondas FRET-fuerza en estas proteínas LINC putativos de soporte de carga para aclarar aún más la mecánica nucleares con resolución a nivel de proteína. Otra cuestión que se presenta es que los cambios en FRET pueden no estar relacionados con cambios en la tensión, sino más bien reflejan los cambios de en nesprin-2G oligomerización o cambios conformacionales de nesprin-2G. Los cambios en el pH celular pueden influir en la fluorescencia del sensor y cambiar el FRET medido. El sensor nesprin-2G HL representa un buen control para algunos de estos cambios (como los cambios de FRET observada con este sensor son más probable no relacionada con la fuerza), y construcciones de control FRET intermoleculares puede ser desarrollado para evaluar oligomerización (ver abajo). Además, la expresión de nesprin-2G TS es impulsado por un promotor de CMV, lo que resulta en la sobreexpresión, y este alto nivel de expresión puede inducir potencialmente artefactos biológicos. Los avances recientes con cAbrillantado interspaced regularmente repeticiones palindrómicas cortas (de CRISPR) han permitido para la reparación de homología dirigida (HDR) se acerca para insertar secuencias de ADN más grandes en el genoma 21. Este enfoque podría ser utilizado para modificar endógeno nesprin-2G (u otras proteínas) para incluir TSmod. Esto proporcionaría expresión del sensor de fuerza usando el promotor endógeno apropiado, reduciendo el potencial de artefactos sobreexpresión.
TSmod y otras sondas FRET elástico también se pueden utilizar para desarrollar nuevos sensores para otras proteínas, que luego podrían ser utilizados en un protocolo similar a la descrita en este artículo. Una preocupación importante con el desarrollo de cualquier nuevo sensor de fuerza es la determinación del lugar de la inserción interno para el sensor de FRET. En primer lugar, el sitio de inserción debe estar en una región de la proteína sometida a carga mecánica. Estas regiones se pueden identificar mediante el examen de donde las proteínas del citoesqueleto conectados interactúan con la proteína. En segundo lugar, la inserciónde la grande (~ 50 kDa) TSmod no debe alterar la función biológica de la proteína en estudio. Un "mini" forma previamente desarrollada de nesprin-2G mostró que se unen a actina dominios CH puenteados al dominio KASH dom vinculante eran suficientes para el movimiento nuclear nesprin-2G en monocapas heridos 11, 19, lo que sugiere que la inserción de TSmod probablemente no interrumpir la función de la proteína. La confirmación de la función biológica del sensor requiere un ensayo funcional para la función de la proteína (en la que el sensor de fuerza se puede demostrar que rescatar a una función específica en las células agotadas de la proteína endógena). En tercer lugar, los cambios en la oligomerización de proteína pueden alterar la FRET entre las proteínas (denominado FRET intermolecular 22), lo que resultaría en cambios de FRET que no están relacionados a la fuerza. Un análisis cuidadoso de esto a menudo requiere construcciones FRET intermolecular especializados que informan específicamente oligomerización.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Thomas F. Miller y Kate Jeffress Memoria Trust (DEC) y el NIH subvención R35GM119617 (DEC). La formación de imágenes de microscopio confocal se realizó en la Instalación de VCU Nanomateriales Caracterización Core (NCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
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