Introduction
Kraft-känslig, har genetiskt kodade FRET sensorer nyligen dykt upp som ett viktigt verktyg för att mäta dragbaserade krafter i levande celler, som ger insikt i hur mekaniska krafter appliceras tvärs proteiner 1, 2, 3, 4. Med dessa verktyg, forskare kan icke-invasivt bild intracellulära krafter i levande celler med hjälp av konventionella fluorescerande mikroskop. Dessa sensorer består av ett FRET-par (donator- och acceptor fluorescerande proteiner, oftast en blå donator och gul acceptor) åtskilda av en elastisk peptid 3. I motsats till C- eller N-terminal taggning är denna sensor införd i ett inre ställe i ett protein för att mäta den mekaniska kraften som överförs över proteinet, beter sig som en molekylär töjningsgivare. Ökad mekanisk spänning över sensorn resulterar i ett ökat avstånd mellan FRET-pluft, vilket resulterar i minskade FRET 3. Som en följd av detta FRET omvänt relaterad till dragkraft.
Dessa fluorescerande baserade sensorer har utvecklats för fokala vidhäftningsproteiner (vinkulin 3 och talin 4), cytoskelettproteiner (α-actinin 5), och cell-cell-junction-proteiner (E-cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, och PECAM 8). Den mest använda och väl känne elastisk linker i dessa biosensorer är känd som TSmod och består av en repetitiv sekvens av 40 aminosyror, (GPGGA) 8, som var härledda från spindelsilkesprotein flagelliform. TSmod har visats uppträda som en linjär elastisk nano våren, med FRET känslighet för 1 till 5 pN av dragkraft 3. Olika längder av flagelliform kan användas för att förändra den dynamiska range av TSmod FRET-force känslighet 9. Förutom flagelliform upprepar spektrin 5 och villin headpiece peptid (känd som HP35) 4 har använts som de elastiska peptiderna mellan FRET-par i liknande kraft biosensorer 4. Slutligen en färsk rapport visade att TSmod också kan användas för att upptäcka tryckkrafter 10.
Vi utvecklade nyligen en kraftsensor för linkern av nukleo-cytoskelettet (LINC) komplex protein Nesprin2G med hjälp TSmod införd i en tidigare utvecklad trunkerad Nesprin2G protein känt som mini-Nesprin2G (figur 2C), som uppför sig på liknande sätt som endogen Nesprin-2G 11. LINC-komplexet innehåller multipla proteiner som leder från utsidan till insidan av kärnan, förbinder den cytoplasmatiska cytoskelettet till den nukleära lamina. Nesprin-2G är ett strukturellt protein som binder till bådeaktin cytoskelettet i cytoplasman och SUN proteiner i perinukleära utrymmet. Med vår biosensor, kunde vi visa att Nesprin-2G är föremål för aktomyosin beroende spänningar i NIH3T3 fibroblaster 2. Detta var första gången som kraft direkt mätt över ett protein i kärn LINC komplexa, och det kommer sannolikt att bli ett viktigt verktyg för att förstå vilken roll kraft kärnan i mechanobiology.
Protokollet nedan ger en detaljerad metod för hur man använder Nesprin-2G kraftsensor, innefattande expression av Nesprin spänningssensorn (Nesprin-TS) i däggdjursceller, samt insamling och analys av FRET bilder av celler som uttrycker Nesprin- TS. Användning av ett inverterat konfokalt mikroskop utrustat med en spektral detektor, FRET en beskrivning av hur man mäter sensibiliserade emission med användning av spektral unmixing och ratiometrisk FRET avbildning tillhandahålls. Utgången ratiometrisk bilder kan användas för att göra relativa quantitative kraft jämförelser. Även om detta protokoll fokuserar på uttrycket av Nesprin-TS i fibroblaster, är det lätt att anpassa till andra däggdjursceller, inklusive både cellinjer och primära celler. Vidare kan detta protokoll eftersom det gäller bildförvärvande och FRET-analys lätt anpassas till andra FRET-baserade kraft biosensorer som har utvecklats för andra proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Erhåll Nesprin-2G Sensor-DNA och annan plasmid-DNA
- Erhålla Nesprin-2G TS (spänningssensor), Nesprin-2G HL (huvudlös) kontroll, mTFP1, venus, och TSmod från en kommersiell källa. Propagera alla DNA-plasmider och rena dem med användning av standard E. coli-stammar, såsom DH5-α, såsom beskrivits tidigare 12, 13.
2. transfektera celler med Nesprin-2G och Annan Plasmid-DNA
- Växa NIH 3T3-fibroblastceller till 70-90% konfluens i en 6-brunnars cellodlingsskål i en standardcellodlingsinkubator med temperatur (37 ° C) och CO 2 (5%) reglering. För celltillväxtmediet, använd Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt kalvserum.
- I en cellkultur huva, avlägsna mediet och skölj varje brunn med ca 1 ml av en cellmedium reducerad-serum. Lägga 800 mikroliter av reducerad serumcellmedium till varje brunnoch placera sex-brunnars kammare i inkubatorn.
- Pipettera 700 mikroliter av reducerad serumcellmedium i en 1,5 ml rör med 35 | il av lipid bärarlösning för att bilda den "lipomix". Blanda genom pipettering. Märka röret med en "L"
- Samla sex 1,5 ml rör och märka dem 1 till 6. Pipettera 100 mikroliter av reducerad serumcellmedium i varje rör.
- Med användning av plasmid-DNA-koncentration från steg 1, pipett 2 pg av Nesprin 2G-TS i rör 1 och 2. Pipettera 2 ^ g av Nesprin-HL i rör 3 och 4. Pipettera 1 pg av mTFP in i röret 5. Pipettera 1 pg av mVenus i röret 6. inte återanvända pipettspetsar vid pipettering olika typer av DNA.
- Pipettera 100 mikroliter av lipomix från "L" röret i varje märkt rör (1-6) och blanda genom upprepad pipettering. Använd en ren pipett för varje rör. Inkubera i 10-20 min.
- Lägga 200 mikroliter från varje märkt rör till en brunn i 6-brunnars kammare med 70-90% sammanflytandeceller. Märka den övre delen av varje brunn med motsvarande DNA tillsatt. Placera 6-brunnars kammare i en inkubator under 4-6 timmar.
- Aspirera mediet och tillsätt 1-2 mL reducerad serumcellmedium för att skölja. Aspirera cellmediet minskas-serum, tillsätt 2 ml trypsin till varje brunn, och placera 6-brunnsskål i inkubatorn (5-15 min).
- Medan cellerna lossnar i inkubatorn, täcka sex glasbotten visning rätter med ett skikt av fibronektin vid en koncentration av 20 pg / ml löst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillåta diskgodset att belägga ytan i cellkultur huva (ca 20 min).
- Neutralisera trypsinet genom att tillsätta 2 ml av DMEM när cellerna lösgörs.
- Överför innehållet i varje brunn till en märkt 15-ml centrifugrör och centrifugera ner vid 90 xg under 5 min i en svängande rötor centrifug. Aspirera supernatanten och återsuspendera varje cellpelleten i 1000 mikroliter av DMEM med pipett blandning.
- Aspirera fibronektin blandningen frånglas rätter och pipett 1000 mikroliter av varje cellsuspension på glaset rätter.
- Efter det att cellerna sedimentera till botten av glasskålar (~ 15 min), lägga till ytterligare en ml DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep till varje brunn och plats i cellinkubator. Tillåta cellerna att fästa och uttrycka sensor för åtminstone 18-24 timmar.
OBS: Celler transfekteras med användning av kommersiella katjoniska lipid transfektionsreagens (se tabell of Materials). Alternativt kan stabila cellinjer väljas genom användning av en plasmid med en gen som ger resistens mot ett toxin (pcDNA plasmider för Nesprin-TS och -HL finns på en DNA förvar webbplats (se tabell of Materials) tillhandahålla celler som uttrycker geneticin resistans ). Dessutom kan virala infektionsmetoder (lentivirus, retrovirus eller adenovirus) användas för att uttrycka sensorn i celler som är svåra att transfektera. - Förutom Nesprin-TS, transfektera ytterligare celler med Nesprin HL noll-förce kontroll, såsom beskrivits i steg 2.1-2.12; TSmod kan också användas som en nollkraftstyrning och bör uppvisa liknande FRET till Nesprin-HL.
- Transfektera celler med mTFP1 och venus att generera spektrala fingeravtryck (se steg 4).
OBS: mTFP1 och venus uttrycker typiskt vid högre nivåer än Nesprin-TS, och som sådan, kan lägre mängder DNA måste transfekteras för att uppnå liknande expressionsnivåer.
3. Kontrollera Transfektion Effektivitet
- Ungefär 18-24 timmar efter avslutad transfektion, använda ett inverterat fluorescensmikroskop för att undersöka effektiviteten för transfektion genom jämförelse av antalet fluorescerande celler till det totala antalet celler i vy (vanligen 5-30%).
- Använda ett fluorescensmikroskop utrustat med en exciteringsfrekvens nära 462 nm (mTFP1) eller 525 nm (venus) och ett emissionsfilter centrerat nära 492 nm (mTFP1) eller 525 nm (venus).
OBS: Alternativt kommer GFP filteruppsättningar fånga en kombination av mTFP1 och veNus utsläpp och gör det möjligt för bekräftelse av transfektionseffektiviteten.
- Använda ett fluorescensmikroskop utrustat med en exciteringsfrekvens nära 462 nm (mTFP1) eller 525 nm (venus) och ett emissionsfilter centrerat nära 492 nm (mTFP1) eller 525 nm (venus).
- Bild levande celler inom 48 timmar efter transfektion.
- Alternativt fixera cellerna i 4% paraformaldehyd (i PBS med kalcium och magnesium) i 5 min, lagra i PBS, och vyn efter 48 h 8.
OBS: Beyond 48 h, sönderfaller signalkvalitet och styrka. Fixering av cellerna bevarar deras tillstånd, inklusive FRET uttrycks 8; emellertid bör celler endast avbildas i PBS, som monteringsmedium kan påverka FRET 14. Fixerade celler kan bara jämföras med andra fasta celler, eftersom det kan finnas en förändring i uttryck.
Varning: Paraformaldehyd är giftigt. Bär lämplig personlig skyddsutrustning (PPE).
- Alternativt fixera cellerna i 4% paraformaldehyd (i PBS med kalcium och magnesium) i 5 min, lagra i PBS, och vyn efter 48 h 8.
4. Capture Spectral fingeravtryck mTFP1 och Venus Fluoroforer för Spectral Unmixing
- I en cellkultur huva, ersätta cellmediet med imaging medium (HEPES-buffrad) kompletterat med 10% fetalt bovint serum.
- Placera de tittar rätter i en temperaturreglerad (37 ° C) konfokalmikroskop skede.
- Placera glas visning skålen med mTFP1-transfekterade celler över olje målet vid 60X förstoring med en numerisk apertur av 1,4.
OBS: Oljan används på ett laserscanningsmikroskop på 60X målet att nära likna brytningsindex för glassubstratet. Oljan placeras ovanpå objektivet och kommer i direkt kontakt med glastäck. - Lokalisera mTFP1 uttryckande celler med en 458 nm exciteringskälla och en emissionsbandpassfilter centrerat vid 500 nm.
- Med en fluorescerande cell i synfältet, väljer den spektrala detekteringsläge ( "Lambda Mode" i den programvara som används här) och fånga den spektrala bilden (Figur 3-1); inkluderar alla frekvenser bortom 458 nm med användning av 10 nm ökningar (Figur 3-3). Välj en ljus fluorescerent område (ROI) på cellen (20-pixel radie).
OBS: Den spektrala formen hos mTFP1-uttryck ROI bör förbli relativt konstant över cellen. Om formen varierar avsevärt, åter justera laser och få inställningar för att förbättra signal-till-brusförhållandet. - Tillsätt fluorescerande ROI menar, normaliserad intensitet till den spektrala databasen genom att klicka på "spara spektra till databasen."
- Optimera lasereffekten och få så att ett bra signal-brusförhållande uppnås. Inställningar kommer att variera för olika utrustning. Med användning av icke-fluorescerande, otransfekterade celler såsom en bakgrundsreferens, öka förstärkningen och kraft tills cellerna är ljusa, men inte längre än det dynamiska området hos detektorn (mättnadspunkten). Bakgrunds celler bör inte ha påvisbar fluorescens efter i genomsnitt.
- Upprepa processen för venus-transfekterade cellerna med följande undantag:
- Säkerställa att exciteringsfrekvensen är vid 515 nm och att bandpassfiltret är centered nära 530 nm då lokalisera venus-uttryckande celler.
- I "Spectral Mode" använda en exciteringsfrekvens på 515 nm i stället för 458 nm.
5. Fånga oblandade Images
- Växla inspelningsläge till "Spectral Unmixing."
- Lägga de spektrala fingeravtryck av venus och mTFP1 in i unmixing kanalerna (figur 3, pil-2).
- Ställ excitation laser tillbaka till en 458 nm argon källa.
- Placera Nesprin-TS visning skålen ovanför oljemålet 60X.
- Efter fokusering på en fluorescerande cell med tillräckligt ljus uttryck, justera förstärkningen och lasereffekten för att optimera signal-brusförhållande.
OBS: Eftersom FRET effektivitet Nesprin-TS är nära 20%, bör den oblandade venus bild vara väsentligen dimmer än den oblandade mTFP1 bilden. När en acceptabel styrka och förstärkningsinställning har fastställts iterativt måste dessa parametrar förblir konstant för alla bilder captkonfiguerad. - Fånga ett minimum av 15-20 bilder av Nesprin-Tg-celler med relativt lika ljusstyrka och undvika överdriven pixel mättnad (alla mättade pixlar avlägsnas under bildbehandling).
- Upprepa bildinfångningsprocessen med Nesprin-HL-celler med användning identiska avbildningsparametrar.
6. Bildbehandling och Ratio bildanalys
- Genom att använda öppen källkod ImageJ (Fiji) programvara (http://fiji.sc/), öppna eget format bilder med hjälp av BioFormats Reader.
- Pre-process bilderna och beräkna förhållandebilder med användning av tidigare etablerade protokoll 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt det protokoll som ovan, var plasmid-DNA förvärv från DNA förvaret och transformerades in i E. coli-celler. E. coli som uttrycker sensor DNA valdes från LB / ampicillinplattor och amplifieras i ett flytande LB-buljong. Efter amplifiering av de vektorer, var DNA-plasmider renas till TRIS-EDTA-buffert med användning av en standard, kommersiellt tillgänglig DNA-isoleringskit. Användning av en spektrofotometer, renades DNA kvantifierades i en standardkoncentration av ^ g / ml (Figur 1A, Dag 1-2).
Med användning av NIH3T3-fibroblaster odlades celler till 70-90% konfluens i en 6-brunnars plastcellkulturskål. Att infoga plasmid-DNA in i NIH3T3-celler, var en lipid-medierad plasmid transfektion utförs. Kommersiellt tillgängligt transfektionsreagens (se tabell of Materials) användes som lipid kärlet för DNA. Två replikat avde Nesprin-TS och Nesprin-HL-sensorer transfekterades in i 4-cell brunnar (Figur 1B). Som förberedelse för FRET avbildning ades enskilda fluoroforenheter konstruktioner av mTFP1 och venus transfekterades in i NIH3T3-celler (Figur 1B). Efter transfektion överfördes cellerna till glasbotten visning rätter som är kompatibla med hög förstoring, inverterade konfokala mikroskop.
Innan man går vidare till konfokal avbildning, var en enkel inverterat brett fält fluorescerande mikroskop som används för att kontrollera transfektionseffektiviteten. Med användning av en 10X objektiv med en numerisk apertur på 0,25, många celler i ett typiskt fält-of-view uttryckte Nesprin-TS (figur 2). Allmänhet, sensorn lokaliserad runt kärnhöljet, i överensstämmelse med den endogena lokalisering av Nesprin-2G 2. No-kraftstyrsensor, Nesprin-HL, följde ett liknande uttrycksmönster 2.
Slutligen var de spektralt upplösta bildstaplar som importeras till ImageJ programvara med öppen källkod för bearbetning. Bilderna förbehandlas, och förhållandebilder beräknades med användning av etablerade förfaranden 15.
Figur 1: Experimental Tidsbaserad flödesschemat. (A) Start med förvärvade senseller plasmid-DNA, är E. coli-vektorer som transformerats med DNA, selekterades och amplifierades (Dag 1-2). Från koncentrerad E.coli LB-buljong, är plasmid-DNA isoleras och kvantifieras (Dag 3). Med användning av renade DNA-plasmider, är NIH3T3-fibroblaster transfekterade i en sex-brunnsformat (B) och överfördes på glasbottnade rätter som är kompatibla med ett inverterat konfokalmikroskop (dag 3). För att kontrollera framgången med transfektion, cellerna betraktas under ett widefield fluorescerande mikroskop utrustad med lämpliga filteruppsättningar (dag 4). Knuten en framgångsrik transfektion, celler avbildas på ett konfokalt mikroskop utrustat med en spektral detektor. Med användning av spektral unmixing, är mTFP1 och venus kanaler separeras under förvärv och sparas som spektralt upplösta bildstaplar (Dagar 4-5). Slutligen är bilder förbehandlas i ImageJ och förhållandet-bilderna beräknas. Please Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: en representativ bild av transfekterade NIH3T3 fibroblaster. (A) 10X förstoring av transfekterade NIH3T3-fibroblaster som uttrycker Nesprin-TS med användning av en GFP filterset. (B) En sprängvy av bounding box från del A. Sensor uttryck följer kärnhöljet och ofta sträcker sig in i cytoplasman. (C) Nesprin-TS och -HL styrning och hur de binder till aktin och SUN-bindande domäner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Spectral fingeravtryck Tutorial Använda Confocal Software. Normaliserade emissionsspektra erhållits från 20-pixel radier i de markerade områdena på Intressanta avgränsade av färgade hårkors. (Arrow-1) Spektral detekteringsmoden för att ta bilden. (Pil-2) "Spectral Unmixing" inställningen för att lägga normaliserade spektra till den spektrala databasen. (Arrow-3) Den exciteringsfrekvens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Live Spectral Unmixing och utmatning av Confocal Software. (A) Kritiska avbildningsparametrar att reproducera levande, oblandade bilder. (Arrow-1) Den exciteringsfrekvens. (Pil-2) Live spektral unmixing läge. (B) Nuclei bild i oblandad venus kanal. (
Figur 5: Nesprin-TS FRET förhållandebilder i mönstrade och omönstrade Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler. MDCK-celler som stabilt uttrycker Nesprin-TS avbildades på 10 | j, m-omfattande fibronektin linjer (A) eller omönstrad polydimetylsiloxan (PDMS) membran (B). Nukleära membran visuellt maskeras och bearbetas till FRET-förhållanden. Den färgade Skalstrecket representerar FRET förhållandet amplitud under omönstrade och mönstrade kärnor.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Bearbetade Propportionell FRET Bilder från Nesprin-TS-uttryckande celler och Histogram Analys av samlade uppgifter. (A) är en representant, normaliserade staplade histogram av FRET förhållandebilder av Nesprin-TS behandlade med ML7 myosin-inhibitor, färgkodade av enskilda cellkärnor. (B) är en representant, normaliserade staplade histogram av FRET förhållandebilder av Nesprin-TS behandlade med kalykulin A, en aktivator av cell kontraktilitet. Legenden korrelerar varje analyserat kärna vare sitt läge på histogrammet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett förfarande och en demonstration av levande cell imaging av mekanisk spänning tvärs Nesprin-2G, ett protein i det nukleära LINC-komplexet, skisserades ovan. Före detta arbete, olika tekniker, såsom mikropipett aspiration, magnetisk-vulst-cytometri, och mikroskopisk laser-ablation, använts för att applicera belastning på cellkärnan och för att mäta dess bulkmaterialegenskaper 16, 17, 18. Emellertid, tills vår senaste arbete, inga studier direkt hade visat att dragkrafter överförs direkt på en LINC komplex protein i levande celler 2.
Tidigare, visat vårt laboratorium att en modifierad version av Nesprin2G, känd som mini-Nesprin2G, skulle kunna utformas för att uttrycka ett FRET-kraft sond känd som TSmod (figur 2C) 2. TSmod visades tidigare att dynamiskt mäta drag förces i levande celler och i olika lastbärande proteiner 3, 4, 6, 8. Det visades vidare att mini-Nesprin-2G var omöjlig att skilja från endogen Nesprin-2G med avseende på dess lokalisering, med kända effekter på cytoskelettet, och förmåga rädda nukleär placering 11, 19. Med användning av mini Nesprin-2G protein med den TSmod (Nesprin-TS), visades det att NIH3T3-fibroblaster som uttrycker sensorn har en baslinjenivå av spänning i förhållande till Nesprin-HL, som inte kan binda till aktin 2. Vidare kan modulering av cellulära kontraktilitet med användning av inhibitorer eller aktivatorer av myosin detekteras genom Nesprin-TS 2.
Det finns ett antal kritiska steg i detta protokoll. Förvirrande Nesprin-TS med Nesprin-HL (DNA eller uttryckande celler) inte Readily detekteras, såsom både på liknande sätt lokalisera till kärnmembranet, och kommer att leda till förvirrande resultat. Sedan Nesprin-HL är en no-kraftstyrning, bör den uppmätta FRET vara högre än Nesprin-TS i genomsnitt. Att vara försiktig, är sekvense isolerad DNA-konstruktioner och noggrant märknings celler rekommenderas. För det andra är det viktigt att noggrant optimera detektorförstärkningen och lasereffekt på konfokalmikroskop att förbättra signal-till-brusförhållandet och för att minimera blekning. För att korrekt mäta FRET, måste dessa parametrar vara konstant under bilden förvärvet. Vidare optimera detektorförstärkningen eller effekt för belysning eller mycket ljusa uttryckande celler är suboptimalt, eftersom medianuttryckande celler kommer att tendera att falla ut av det dynamiska området hos detektorn. Vissa celler som uttrycker en hög koncentration av sensorn tenderar att fluorescera i nukleoplasman och endoplasmatiska retiklet, vilket gör det svårt att lösa kärnmembranet, som är förmodligen mer intressant region med avseende på FoRCE. Val av celler med något lägre uttrycksnivåer tenderar att lösa problemet sensor lokalisering.
Medan kvotmetrisk spektral avbildning är ett relativt enkelt och snabbt sätt att mäta FRET, det gör det inte ut-enheter av FRET effektivitet på grund av acceptor signalgenomblödning 20. Utan enheter av FRET effektivitet, är det inte möjligt att omvandla FRET förhållandet index till en kalibrerad kraftmätning. På grund av denna begränsning kan endast relativa kvantitativa kraft jämförelser göras. FRET effektivitet kan bestämmas genom mer komplicerade metoder, såsom fluorescens-livstidsavbildning mikroskopi (FLIM) eller acceptor fotoblekning. Absolut kraft (vid pN-nivå) kan uppskattas från FRET effektivitet, som tidigare beskrivits 3, 8.
I motsats till tidigare metoder för att mäta de mekaniska egenskaperna hos kärnan eller förskjutningen av kärnan baserade on externt applicerade krafter, mätning av FRET från Nesprin-TS har fördelen av icke-invasivt sondering spänning på en komponent i kärnmembranet 16, 17, 18. Sensorn avger en fluorescerande signal som är korrelerad med stammen på individuella Nesprin-2G-molekyler. Däremot kräver mikropipett aspiration användning av känsliga verktyg när man arbetar med levande celler. Confocal laser ablation orsakar lokala cellskador och kräver en pulsad laserkälla. Magnetisk vridning cytometry överför krafter på kärnmembranet via cytoskelettet och kan inte användas för att mäta krafter på specifika proteiner, såvida det skulle kopplas med Nesprin-2G spänningssensor.
Även om det har visats att aktin baserade dragkrafter överförs till Nesprin-2G, en del av LINC komplexa, är det fortfarande okänt hur mycket drag- eller tryckkrafter utövaspå andra strukturella LINC-proteiner, såsom SUN-1 eller SUN-2. Framtida arbete kommer att riktas mot kloning FRET-force-prober i dessa förmodade bärande LINC-proteiner för att ytterligare belysa kärn mekanik med protein-nivå upplösning. En annan fråga som inställer sig är att förändringar i FRET kan vara samband med förändringar i spänning utan snarare återspeglar antingen förändringar i Nesprin-2G oligomerisering eller konformationsförändringar av Nesprin-2G. Förändringar i cellulär pH kan påverka fluorescensen av sensorn och ändra den uppmätta FRET. Den Nesprin-2G HL sensor utgör en god kontroll för en del av dessa förändringar (som FRET förändringar som observerats med denna sensor är mest sannolikt relaterade till tvinga), och inter FRET kontroll konstruktioner kan utvecklas för att bedöma oligomerisering (se nedan). Dessutom är uttrycket av nesprin-2G TS som drivs av en CMV-promotor, vilket resulterar i överexpression, och denna höga nivå av expression kan potentiellt leda till biologiska artefakter. Senaste framstegen med clustered regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) har tillåtit för homologi-riktad reparations (HDR) närmar att infoga större DNA-sekvenser in i genomet 21. Detta tillvägagångssätt kan användas för att modifiera endogena Nesprin-2G (eller andra proteiner) för att inkludera TSmod. Detta skulle ge uttryck för kraftsensorn med lämplig endogen promotor, vilket minskar risken för överuttryck artefakter.
TSmod och andra elastiska FRET-prober kan också användas för att utveckla nya sensorer för andra proteiner, som sedan skulle kunna användas i ett liknande protokoll som det som beskrivs i denna artikel. Ett stort problem med utvecklingen av nya kraftsensor är att bestämma den interna insättningsstället för FRET sensorn. Först måste insättningsstället vara i en region av proteinet utsätts för mekanisk belastning. Dessa regioner kan identifieras genom undersökning av var cytoskelettala kopplade proteiner interagerar med proteinet. För det andra, införandetav det stora (~ 50 kDa) TSmod får inte störa den biologiska funktionen hos proteinet som studeras. Ett tidigare utvecklat "mini" form av Nesprin-2G visade att aktinbindande CH domänerna överbryggade till SUN bindande KASH domänen var tillräckliga för Nesprin-2G kärnkraftsrörelsen i sårade monoskikt 11, 19, vilket tyder på att införandet av TSmod sannolikt skulle inte störa proteinfunktion. Bekräftelse av den biologiska funktionen av sensorn kräver en funktionell analys för proteinfunktion (i vilken kraftsensorn kan visas för att rädda en specifik funktion i celler utarmade på endogent protein). Tredje, kan förändringar i protein oligomerisering förändra FRET mellan proteiner (benämnda intermolekylär FRET 22), vilket skulle resultera i FRET förändringar som inte är relaterade till tvinga. En noggrann analys av detta kräver ofta specialiserade inter FRET konstruktioner som specifikt rapporterar oligomerisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Thomas F. och Kate Miller Jeffress Memoria Trust (till DEC) och NIH bevilja R35GM119617 (till december). Konfokalmikroskop avbildning utfördes vid VCU Nanomaterial Karakterisering Kärna (NCC) Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
