Introduction
Kracht-gevoelige, zijn genetisch gecodeerde FRET sensoren recentelijk naar voren gekomen als een belangrijk instrument voor het meten van treksterkte gebaseerde krachten in levende cellen, inzicht in hoe mechanische krachten in eiwitten 1, 2, 3, 4 aangebracht. Met deze tools, kunnen onderzoekers het niet-invasief intracellulaire krachten in levende cellen met behulp van conventionele tl-microscopen. Deze sensoren bestaan uit een FRET-paar (donor en acceptor fluorescerende eiwitten, meestal een blauwe donor en acceptor geel) gescheiden door een elastisch peptide 3. In tegenstelling tot de C- of N-terminale tagging, wordt deze sensor ingebracht in een interne plaats van een eiwit om de mechanische kracht overgebracht in het eiwit te meten, gedraagt als een moleculaire spanningsmeter. Verhoogde mechanische spanning over de sensor resulteert in een grotere afstand tussen de FRET-plucht, wat resulteert in verminderde FRET 3. Hierdoor wordt de FRET omgekeerd evenredig met trekkracht.
Deze fluorescerende gebaseerde sensoren zijn ontwikkeld voor focale adhesie-eiwitten (vinculin 3 en talin 4), cytoskeletproteïnen (α-actinine 5) en cel- junction eiwitten (E-Cadherine 6, 7, VE-cadherine 8 en PECAM 8). De meest gebruikte en goed gekarakteriseerde elastische linker in deze biosensoren heet TSmod en bestaat uit een herhaalde sequentie van 40 aminozuren, (GPGGA) 8, die was afgeleid van de spin zijdeproteïne flagelliform. TSmod is aangetoond gedragen als een lineaire elastische nano-veer, met FRET reactiviteit op 1-5 pN trekkracht 3. Verschillende lengten flagelliform kan worden gebruikt om de dynamische r wijzigenange van TSmod FRET-force gevoeligheid 9. Naast flagelliform, spectrine herhalingen 5 en villin kopstuk peptide (bekend als HP35) 4 werden gebruikt als elastisch peptiden tussen FRET-paren soortgelijke werking biosensoren 4. Tot slot, een recent rapport bleek dat TSmod ook kan worden gebruikt om drukkrachten 10 detecteren.
We hebben onlangs een krachtsensor de linker van de nucleo-cytoskelet (LINC) complex eiwit Nesprin2G ontwikkeld door TSmod ingebracht in een eerder ontwikkelde afgeknot eiwit Nesprin2G zogenaamde mini-Nesprin2G (figuur 2C), die eveneens gedraagt endogene Nesprin-2G 11. LINC complex bevat meerdere eiwitten die leiden vanaf de buitenzijde naar de binnenzijde van de kern, die de cytoplasmatische cytoskelet de nucleaire lamina. Nesprin-2G is een structureel eiwit bindt aan zowel deactine cytoskelet in het cytoplasma en SUN eiwitten in de perinucleaire ruimte. Met behulp van onze biosensor, waren we in staat om aan te tonen dat Nesprin-2G is onderworpen aan actomyosine-afhankelijke spanning in NIH3T3 fibroblasten 2. Dit was de eerste keer dat kracht werd direct gemeten over een eiwit in de nucleaire LINC complex, en het is waarschijnlijk een belangrijk instrument om de rol van kracht op de kern in Mechanobiology begrijpen geworden.
Onderstaande protocol geeft een gedetailleerde methodologie van de Nesprin-2G krachtsensor gebruiken en het uiten van de Nesprin spanningssensor (Nesprin-TS) in zoogdiercellen, en het verzamelen en analyseren van FRET afbeeldingen cellen die Nesprin- TS. Behulp van een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een spectrale detector, een beschrijving van het gesensibiliseerde emissie gemeten FRET gebruikt spectrale ontmenging en ratiometrische FRET beeldvorming verschaft. De output ratiometrische beelden kunnen worden gebruikt om de relatieve qua makenntitative kracht vergelijkingen. Hoewel dit protocol is gericht op de expressie van Nesprin-TS in fibroblasten is gemakkelijk aan andere zoogdiercellen, waaronder beide cellijnen en primaire cellen. Bovendien kan dit protocol als het gaat om beeldacquisitie en FRET analyse gemakkelijk worden aangepast aan andere FRET-gebaseerde biosensoren kracht die zijn ontwikkeld voor andere eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Haal Nesprin-2G Sensor DNA en andere Plasmid DNA
- Verkrijgen Nesprin-2G TS (spanningssensor), Nesprin-2G HL (headless) controle, mTFP1, venus en TSmod uit een commerciële bron. Propageren alle DNA- plasmiden en zuiveren ze met behulp van standaard E. coli-stammen, zoals DH5-α, zoals eerder 12, 13 beschreven.
2. Transfecteren Cellen met Nesprin-2G en andere Plasmide DNA
- Groeien NIH 3T3 fibroblastcellen tot 70-90% confluentie in 6-well celcultuur schotel in een standaard celkweek incubator met temperatuur (37 ° C) en CO2 (5%) regulering. Voor het celkweekmedium gebruikt Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum.
- In een celkweek kap Verwijder het medium en spoel elk putje met ongeveer 1 ml van een verlaagde serum celmedium. Voeg 800 ul van verlaagde serum cel medium aan elk putjeen plaats de 6-well kamer in de incubator.
- Pipetteer 700 ul van verlaagde serum-celmedium in een 1,5 ml buis met 35 pl lipide drageroplossing van "lipomix" vormen. Meng door pipetteren. Label de buis met een "L"
- Verzamel zes 1,5 ml buisjes en labelen van 1 tot 6. Pipetteer 100 ul van verlaagde serum-celmedium in elke buis.
- Met het plasmide-DNA-concentratie van stap 1, pipet 2 ug Nesprin 2G-TS in buizen 1 en 2. Pipetteer 2 ug Nesprin-HL in buisjes 3 en 4. Pipetteer 1 ug mTFP in buis 5. Pipetteer 1 ug mVenus in de buis 6. niet hergebruiken pipet tips bij het pipetteren verschillende soorten DNA.
- Pipetteer 100 ul van de lipomix van de "L" buis in elk gemerkt buis (1-6) en meng door herhaald pipetteren. Met een schone pipet voor elke buis. Incubeer gedurende 10-20 min.
- Voeg 200 pi van elk gemerkt buis een putje in 6-well kamer met 70-90% confluentcellen. Label de top van elk putje met de bijbehorende DNA toegevoegd. Plaats de 6-well kamer in een incubator gedurende 4-6 uur.
- Zuig het medium en voeg 1-2 ml gereduceerd-serum celmedium te spoelen. Zuig het verminderde serum-celmedium, voeg 2 ml trypsine aan elk putje en plaats de 6 putjes in de incubator (5-15 min).
- Terwijl de cellen los in de incubator, laag 6 glazen bodem weergave gerechten met een laag van fibronectine in een concentratie van 20 ug / ml opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Laat de gerechten het bekleden van het oppervlak in de celkweek kap (ongeveer 20 min).
- Neutraliseer de trypsine door toevoeging van 2 ml DMEM wanneer de cellen worden losgemaakt.
- De inhoud van elk putje een label 15 ml centrifugebuis en spin neer op 90 g gedurende 5 minuten in een swinging rotor centrifuge. Zuig het supernatant en resuspendeer elke cel pellet in 1000 pi DMEM pipet mengen.
- Zuig het fibronectine mengsel vanglazen schalen en pipetteer 1000 pi van elke celsuspensie op de glazen schalen.
- Nadat de cellen naar de bodem van de glazen schalen (~ 15 minuten), voeg nog 1 ml DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep aan elk putje en plaats in de celincubator. De cellen te laten hechten en een automatische sensor voor ten minste 18-24 uur.
OPMERKING: Cellen worden getransfecteerd met gebruikmaking van commerciële kationische lipiden transfectie reagens (zie de Tabel Materials). Als alternatief kunnen stabiele cellijnen worden geselecteerd met een plasmide met een gen dat resistentie tegen een toxine (het pcDNA plasmiden voor Nesprin-TS en -HL zijn op een DNA repository website (zie tabel of Materials) leveren cellen die geneticineresistentie ). Daarnaast kunnen virale infectie methoden (lentivirus, retrovirus of adenovirus) worden gebruikt om de sensor in cellen die moeilijk te transfecteren drukken. - Naast Nesprin-TS, transfecteren aanvullende cellen met de Nesprin HL nul voorce controle, zoals beschreven in stap 2,1-2,12; TSmod kan ook worden gebruikt als een nul-krachtregeling en moeten vergelijkbaar FRET vertonen Nesprin-HL.
- Transfecteren cellen met mTFP1 en Venus spectrale fingerprints (zie stap 4) te genereren.
OPMERKING: mTFP1 en venus gewoonlijk tot expressie op hogere niveaus dan Nesprin-TS, en als zodanig, kunnen kleinere hoeveelheden DNA moeten worden getransfecteerd vergelijkbare expressieniveaus te bereiken.
3. Controleer Transfectie efficiëntie
- Ongeveer 18-24 uur na afloop van de transfectie gebruikt een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om de efficiëntie van transfectie onderzocht door het aantal fluorescerende cellen in vergelijking met het totale aantal cellen gezien (gewoonlijk 5-30%).
- Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een excitatie frequentie nabij 462 nm (mTFP1) of 525 nm (venus) en een emissie filter gecentreerd nabij 492 nm (mTFP1) of 525 nm (venus).
OPMERKING: U zal GFP filter sets een combinatie van mTFP1 vangen en venus emissies en zal de bevestiging van de transfectie-efficiëntie mogelijk te maken.
- Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een excitatie frequentie nabij 462 nm (mTFP1) of 525 nm (venus) en een emissie filter gecentreerd nabij 492 nm (mTFP1) of 525 nm (venus).
- Afbeelding levende cellen binnen 48 uur na transfectie.
- Alternatief fix cellen in 4% paraformaldehyde (in PBS met calcium en magnesium) gedurende 5 minuten bewaren in PBS en bekijken na 48 uur 8.
OPMERKING: Beyond 48 h, de signaalkwaliteit en kracht vergaat. Het bevestigen van de cellen behouden hun toestand, met inbegrip van de FRET uitgedrukt 8; evenwel moeten de cellen alleen afgebeeld in PBS, als fixeermiddel FRET 14 kunnen beïnvloeden. Gefixeerde cellen kan alleen vergeleken met andere gefixeerde cellen, omdat er een verandering in expressie kan worden.
Let op: Paraformaldehyde is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
- Alternatief fix cellen in 4% paraformaldehyde (in PBS met calcium en magnesium) gedurende 5 minuten bewaren in PBS en bekijken na 48 uur 8.
4. Capture Spectral Fingerprints of mTFP1 en Venus Fluoroforen voor de spectrale componenten voor elke pixel
- In een celcultuur kap, vervangt de cel medium met imaging medium (HEPES-buffer) aangevuld met 10% foetaal runderserum.
- Leg het zichtbare schotels in een temperatuurgecontroleerde (37 ° C) confocale microscoop podium.
- Plaats de glazen schaaltje met bezichtiging mTFP1 getransfecteerde cellen via olie doelstelling op 60X vergroting met een numerieke apertuur van 1,4.
OPMERKING: De olie wordt gebruikt op een laserscanning microscoop op de 60X objectief nauw lijken op de brekingsindex van het glazen substraat. De olie wordt bovenop de objectieflens en komt in direct contact met het glas dekglaasje. - Lokaliseren mTFP1 expressie brengende cellen met 458 nm excitatie bron en een emissie banddoorlaatfilter gecentreerd bij 500 nm.
- Met een fluorescerende cel in het gezichtsveld, selecteert de spectrale detectiemodus ( "Lambda Mode" in de software gebruikt) en vastleggen van de spectraal beeld (figuur 3-1); inclusief alle frequenties boven 458 nm met gebruikmaking van 10 nm stappen (figuur 3-3). Kies een heldere tlent gebied (ROI) van de cel (20 pixelradius).
LET OP: De spectrale vorm van de mTFP1 expressie ROI moet relatief constant over de cel blijven. Als de vorm aanzienlijk varieert, past de laser en versterkingsinstellingen de signaal-ruisverhouding te verbeteren. - Voeg de fluorescerende ROI betekenen, genormaliseerde intensiteit van de spectrale-database door te klikken op "save spectra database."
- Optimaliseer het laservermogen en krijgen zodanig dat een goede signaal-ruisverhouding wordt bereikt. Instellingen zal variëren voor verschillende apparatuur. Met niet-fluorescerende, niet-getransfecteerde cellen als achtergrondinformatie, verhoging van de versterking en energie tot de cellen zijn helder, maar niet buiten het dynamisch bereik van de detector (verzadigingspunt). Achtergrondcellen niet detecteerbare fluorescentie na middeling.
- Herhaal dit proces voor het venus-getransfecteerde cellen met de volgende uitzonderingen:
- Waarborgen dat de excitatiefrequentie wordt bij 515 nm en dat het banddoorlaatfilter is centered nabij 530 nm bij het lokaliseren venus tot expressie brengende cellen.
- In "Spectral Mode" gebruikt een excitatiefrequentie van 515 nm in plaats van 458 nm.
5. Capture Unmixed Images
- Schakel de opnamefunctie op "Spectral componenten voor elke pixel."
- Voeg de spectrale fingerprints van Venus en mTFP1 in de ontmenging kanalen (figuur 3, Arrow-2).
- Stel de excitatielaser naar een 458 nm argon bron.
- Plaats de Nesprin-TS bekijken schotel boven de olie objectief 60X.
- Scherp op een fluorescerende cel met voldoende heldere expressie, de versterking aanpassen laservermogen en de signaal-ruisverhouding te optimaliseren.
Opmerking: omdat de efficiëntie van FRET Nesprin-TS nabij 20%, zou het de ongemengde venus hoofdzaak dimmer beeld onvermengde mTFP1 zijn dan. Zodra een aanvaardbare kracht en gain-instelling zijn iteratief is vastgesteld, moeten deze parameters constant voor alle beelden capt blijvenreerd. - Vang minimaal 15-20 afbeeldingen Nesprin TS-cellen met relatief even helder en vermijd buitensporige pixel verzadiging (alle verzadigde pixels worden verwijderd tijdens beeldverwerking).
- Herhaal beeldvastlegbewerking met Nesprin HL-cellen onder toepassing identieke beeldvormingsparameters.
6. Beeldverwerking en Ratio beeldanalyse
- Het gebruik van open-source ImageJ (Fiji) software (http://fiji.sc/), open eigen formaat beelden met behulp van BioFormats Reader.
- Voorbewerking van de beelden en het berekenen verhoudingsafbeeldingen toepassing van eerder vastgestelde protocollen 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het protocol dat hierboven werd plasmide-DNA verkregen uit de DNA-gegevensbank en getransformeerd in E. coli-cellen. E. coli tot expressie sensor DNA werden geselecteerd uit LB / ampicilline-platen en geamplificeerd in vloeibaar LB-bouillon. Na de amplificatie van de vectoren werden DNA plasmiden gezuiverd in Tris-EDTA-buffer met een standaard, commercieel verkrijgbare DNA isolatie kit. Met behulp van een spectrofotometer werd gezuiverd DNA gekwantificeerd in een standaardconcentratie van ug / ml (Figuur 1A, dagen 1-2).
Gebruik NIH3T3 fibroblasten werden cellen gekweekt tot 70-90% confluentie in 6-well plastic celkweekschaal. Plasmide DNA in de NIH3T3-cellen te voegen, werd een lipide-bemiddelde transfectie plasmide uitgevoerd. Commercieel verkrijgbare transfectiereagens (zie tabel of Materials) werd gebruikt als lipide schip voor DNA. Twee herhalingen vande Nesprin-TS en Nesprin HL-sensoren werden getransfecteerd in putjes 4 cellen (Figuur 1B). Ter voorbereiding van FRET beeldvorming, enkelvoudige fluorofoor constructen van mTFP1 en Venus werden getransfecteerd in NIH3T3-cellen (Figuur 1B). Na transfectie werden de cellen overgebracht naar glazen bodem weergave schotels compatibel met hoge vergroting, omgekeerde confocale microscopen.
Alvorens tot confocale beeldvorming, werd een eenvoudige omgekeerde groothoek fluorescentiemicroscoop gebruikt voor de transfectie-efficiëntie te controleren. Gebruik een 10x objectief met een numerieke apertuur van 0,25, een groot aantal cellen in een typisch beeldveld opvatting de Nesprin-TS (figuur 2). In het algemeen, de sensor gelokaliseerd rond de kern omhullende, consistent met de lokalisatie van endogene Nesprin-2G 2. De niet-force sensor, Nesprin-HL, volgde een vergelijkbaar expressiepatroon 2.
Tenslotte werden de spectraal opgelost afbeelding stacks geïmporteerd in ImageJ open-source software voor de verwerking. De beelden werden voorbewerkt en verhoudingsafbeeldingen berekend met gebruikmaking van gevestigde procedures 15.
Figuur 1: Experimentele Time-based Flow Chart. (A) Beginnend met verworven sensof plasmide DNA, E. coli vectoren worden getransformeerd met DNA, geselecteerd en geamplificeerd (dagen 1-2). Van geconcentreerde E. coli LB-bouillon, plasmide-DNA wordt geïsoleerd en gekwantificeerd (dag 3). Gebruikmaking van gezuiverd DNA plasmiden worden NIH3T3-fibroblasten getransfecteerd in een zes putjes (B) en overgebracht op glazen bodem gerechten die compatibel is met een omgekeerde confocale microscoop (dag 3). Het succes van de transfectie controleren, worden de cellen bekeken onder een groothoek fluorescentiemicroscoop uitgerust met geschikte filtersets (dag 4). Afhankelijk succesvolle transfectie worden cellen afgebeeld op een confocale microscoop uitgerust met een spectrale detector. Gebruik spectrale ontmenging worden mTFP1 en Venus kanalen gescheiden tijdens de opname en opgeslagen als spectraal gescheiden afbeeldingsstapels (dagen 4-5). Ten slotte worden de beelden voorbewerkt in ImageJ, en de verhouding-beelden worden berekend. Please klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Een representatief beeld van getransfecteerde NIH3T3 fibroblasten. (A) 10x vergroting getransfecteerde NIH3T3 fibroblasten die Nesprin-TS met gebruik van een GFP filterset. (B) Een opengewerkt aanzicht van het kader van deel A. Sensor expressie volgt de nucleaire envelop en vaak uitstrekt tot in het cytoplasma. (C) Nesprin-TS en -HL controle en hoe ze binden aan het actine SUN bindingsdomeinen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Spectral Fingerprinting Tutorial met behulp van confocale Software. Genormaliseerde emissiespectra verkregen uit 20 pixels stralen in de gemarkeerde gebieden speciale locaties afgebakend door gekleurde dradenkruis. (Arrow-1) Spectral detectie modus om de foto te maken. (Arrow-2) "spectrale componenten voor elke pixel" instelling spectra genormaliseerd aan de spectrale database. (Arrow-3) De excitatiefrequentie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Live-Spectral componenten voor elke pixel en Output van Confocale Software. (A) Critical imaging parameters om live, ongemengde beelden te reproduceren. (Arrow-1) De excitatiefrequentie. (Pijl 2) Leven spectrale ontmenging modus. (B) Kernen afbeelding ongemengde venus kanaal. (
Figuur 5: Nesprin-TS FRET verhoudingsafbeeldingen in gevormde en unpatterned Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) -cellen. MDCK-cellen die stabiel tot expressie Nesprin-TS werden afgebeeld op 10 pm brede lijnen fibronectine (A) of zonder patroon polydimethylsiloxaan (PDMS) membranen (B). Nucleaire membranen werden visueel gemaskeerd en verwerkt tot FRET verhoudingen. De gekleurde schaalbalk geeft de FRET verhouding amplitude ongestructureerde en gevormde kernen.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Verwerkte Ratiometrische FRET Afbeeldingen van Nesprin-TS-exprimerende cellen en Histogram analyse van verzamelde gegevens. (A) Een representatieve, genormaliseerd gestapelde histogram van FRET verhoudingsafbeeldingen van Nesprin-TS behandeld met ML7 myosine inhibitor, kleurcodering individuele celkernen. (B) Een representatieve, genormaliseerd gestapelde histogram van FRET verhoudingsafbeeldingen van Nesprin-TS behandeld met calyculine A, een activator van celcontractie. De legenda correleert elk geanalyseerd kern naar de locatie in het histogram. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Werkwijze en demonstratie van live cell imaging van mechanische spanning in Nesprin-2G, een eiwit in de kern LINC complex werd hierboven beschreven. Voorafgaand aan dit werk verschillende technieken, zoals micropipet aspiratie, magnetische-kraal cytometrie en microscopische laser-ablatie, gebruikt om spanning toe te passen op de celkern en de bulk materiaaleigenschappen 16, 17, 18 te meten. Echter, tot onze recente werk, geen studies hadden direct aangetoond dat trekkrachten direct overgebracht naar een LINC complex eiwit in levende cellen 2.
Voorheen ons laboratorium aangetoond dat een gemodificeerde versie van Nesprin2G, zogenaamde mini-Nesprin2G kan worden gemanipuleerd om een FRET-probe force genoemd TSmod (figuur 2C) 2 tot expressie. TSmod bleek eerder dynamisch meten van treksterkteces in levende cellen en in diverse dragende eiwitten 3, 4, 6, 8. Er werd verder aangetoond dat mini-Nesprin-2G was niet te onderscheiden van endogene Nesprin-2G met betrekking tot de lokalisatie, effect op het cytoskelet, en het vermogen om nucleaire plaatsen 11, 19 te redden. Met de mini Nesprin 2G-eiwit met de TSmod (Nesprin-TS), werd aangetoond dat NIH3T3 fibroblasten die de sensor een basislijn spanningsniveau ten opzichte Nesprin-HL, die niet binden aan actine 2. Voorts kan de modulatie van cellulaire contractiliteit gebruik remmers of activatoren van myosine worden gedetecteerd door Nesprin-TS2.
Er zijn een aantal belangrijke stappen in dit protocol. Verwarrende Nesprin-TS met Nesprin-HL (DNA of expressie brengen) niet Readily gedetecteerd, aangezien beide op dezelfde manier te lokaliseren aan de nucleaire membraan, en zal leiden tot verwarrende resultaten. Aangezien Nesprin-HL een niet-krachtsturing dient de gemeten FRET boven Nesprin-TS gemiddeld zijn. Om voorzichtig te zijn, wordt geïsoleerd sequencing DNA-constructen en zorgvuldig labelen cellen geadviseerd. Ten tweede is het belangrijk optimaliseren de detectorversterking laservermogen en de confocale microscoop om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en bleken te minimaliseren. Om FRET behoren te meten, moeten deze parameters tijdens de beeldacquisitie constant blijven. Bovendien, het optimaliseren van de detector winst of het vermogen voor dimmen of zeer heldere tot expressie brengen niet optimaal zijn, omdat de mediaan tot expressie brengen zal de neiging van het dynamisch bereik van de detector te vallen. Bepaalde cellen die een hoge concentratie sensor drukken vaak fluoresceren in het nucleoplasma en endoplasmatisch reticulum, waardoor het moeilijk is het kernmembraan, wat vermoedelijk de meest interessante regio met betrekking tot fo lossenRCE. cellen selecteren met iets lagere expressieniveaus lijkt dit probleem sensor lokalisatie lossen.
Terwijl ratiometrische spectrale imaging is een relatief eenvoudige en snelle manier om FRET meten, niet uitvoereenheden van FRET rendement door acceptorsignaal doorbloeding 20. Zonder eenheden FRET efficiëntie, is het niet mogelijk de FRET verhouding index omzetten in een gekalibreerde krachtmeting. Door deze beperking, kan alleen relatieve kwantitatieve kracht vergelijkingen worden gemaakt. FRET efficiëntie kan worden bepaald meer gecompliceerde werkwijzen zoals fluorescentie-lifetime imaging microscopy (FLIM) of acceptor fotobleken. Absolute kracht (op het niveau pN) kan worden bepaald FRET-efficiëntie, zoals eerder beschreven 3, 8.
In tegenstelling tot eerdere werkwijzen om de mechanische eigenschappen van de kern en de verplaatsing van de kern gebaseerde nagaan vann uitwendig uitgeoefende krachten meten van de FRET van Nesprin-TS heeft het voordeel dat niet-invasief probing spanning op een onderdeel van het kernmembraan 16, 17, 18. De sensor levert een fluorescerend signaal dat gecorreleerd is met de druk op individuele Nesprin 2G-moleculen. In tegenstelling micropipet aspiratie vereist het gebruik van delicate gereedschap bij het werken met levende cellen. Confocale laser ablatie veroorzaakt lokale cellulaire schade en vereist een gepulste laserbron. Magnetische draaiende cytometrie transfers krachten op het kernmembraan via het cytoskelet en kan niet worden gebruikt om de krachten gemeten op specifieke eiwitten, tenzij het wordt gekoppeld met de Nesprin-2G spanningssensor.
Terwijl is aangetoond dat actine gebaseerde trekkrachten overgebracht naar Nesprin-2G, een component van het complex LINC, blijft het onbekend hoeveel trek- en drukkrachten uitgeoefendop andere structurele LINC eiwitten, SUN-1 of SUN-2. Toekomstige werkzaamheden zijn gericht op het kloneren FRET-probes force in deze vermoedelijke dragende LINC eiwitten nucleaire mechanica met eiwit-niveau aanleiding helderen. Een ander probleem dat zich voordoet is dat veranderingen in FRET geen verband houden met wijzigingen in de spanning kan zijn, maar ook veranderingen in Nesprin-2G oligomerisatie of conformationele veranderingen van Nesprin-2G weerspiegelen. Veranderingen in cellulaire pH kan de fluorescentie van de sensor beïnvloeden en veranderen de gemeten FRET. De Nesprin-2G HL sensor is een goede beheersing van enkele van deze veranderingen (als FRET veranderingen waargenomen met deze sensor zijn waarschijnlijk niet verwant kracht) en intermoleculaire FRET besturingsconstructies kunnen worden ontwikkeld om oligomerisatie te beoordelen (zie hieronder). Bovendien is de expressie van nesprin-2G TS aangedreven door een CMV-promoter, hetgeen resulteert in overexpressie, en dit hoog expressieniveau kan mogelijk biologische artefacten veroorzaken. Recente ontwikkelingen met clustered regelmatige onderlinge afstand korte palindroom herhalingen (CRISPR), voor homologie-gerichte reparatie toegestaan (HDR) zal grotere DNA-sequenties in het genoom 21. Deze aanpak kan worden gebruikt om endogene Nesprin-2G (of andere eiwitten) aan te passen aan TSmod bevatten. Dit zou expressie van de krachtsensor indienen waarbij de geschikte endogene promotor, waardoor de kans op overexpressie artefacten.
TSmod en ander elastisch FRET probes kunnen ook worden gebruikt om nieuwe sensoren voor andere eiwitten, die vervolgens kan worden gebruikt in een vergelijkbaar protocol als beschreven in dit artikel ontwikkelen. Een groot probleem bij de ontwikkeling van nieuwe krachtopnemer is waarmee de inwendige insertieplaats voor FRET sensor. Ten eerste moet de plaats van insertie in een gebied van het eiwit blootgesteld aan mechanische belasting. Deze gebieden kunnen worden geïdentificeerd door het onderzoeken waarbij cytoskelet-verbonden eiwitten interageren met het eiwit. Ten tweede, de invoegingvan de grote (~ 50 kDa) TSmod mag verstoren de biologische functie van het eiwit onderzocht. Een eerder ontwikkelde "mini" vorm van Nesprin-2G bleek dat actinebindend CH domeinen overbrugd SUN-bindende KASH domein volstonden Nesprin-2G nucleaire beweging gewonde monolagen 11, 19, wat suggereert dat het inbrengen van TSmod zou waarschijnlijk niet verstoren eiwitfunctie. Bevestiging van de biologische functie van de sensor heeft een functionele assay voor eiwitfunctie (waarbij de krachtopnemer kan worden aangetoond dat een specifieke functie redden van cellen ontdaan van endogeen eiwit). Ten derde, veranderingen in eiwit oligomerisatie kan het FRET tussen eiwitten (zogenaamde intermoleculaire FRET 22), die zou resulteren in FRET veranderingen die niet gerelateerd kracht te veranderen. Een zorgvuldige analyse van dit vereist vaak gespecialiseerde intermoleculaire FRET constructies die specifiek oligomerisatie melden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memoria Trust (DEC) en NIH-subsidie R35GM119617 (DEC). De confocale microscoop beeldvorming werd uitgevoerd bij de VCU nanomaterialen karakterisering Core (NCC) Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
