Introduction
Sensibile alla Forza, sensori FRET geneticamente codificati recente sono emersi come uno strumento importante per misurare forze di trazione basati in cellule vive, permettono di approfondire come le forze meccaniche vengono applicate attraverso proteine 1, 2, 3, 4. Con questi strumenti, i ricercatori possono immagine in modo non invasivo le forze intracellulare nelle cellule viventi utilizzano microscopi a fluorescenza convenzionali. Questi sensori sono costituiti da una coppia FRET (proteine fluorescenti donatore e accettore, più frequentemente un donatore e accettore blu giallo) separati da un peptide elastico 3. Contrariamente a C- o codifica N-terminale, questo sensore è inserito in un sito interno di una proteina per misurare la forza meccanica trasmessa attraverso la proteina, comportandosi come un estensimetro molecolare. Aumento della tensione meccanica di tutti i risultati dei sensori in un aumento della distanza tra il FRET-pl'aria, con conseguente diminuzione FRET 3. Come risultato, il FRET è inversamente proporzionale alla forza di trazione.
Questi sensori fluorescenti basati sono stati sviluppati per proteine adesione focale (vinculin 3 e talin 4), proteine del citoscheletro (α-actinina 5), e proteine di giunzione cellula-cellula (E-caderina 6, 7, VE-caderina 8, e PECAM 8). Il linker elastico più utilizzato e ben caratterizzato in questi biosensori è noto come TSmod e consiste in una sequenza ripetitiva di 40 amminoacidi, (GPGGA) 8, che sono stati ottenuti dalla flagelliform proteina seta di ragno. TSmod ha dimostrato di comportarsi come un elastico nano-molla lineare, con FRET reattività per 1 a 5 pN della forza di trazione 3. Diverse lunghezze di flagelliform possono essere utilizzati per modificare la dinamica range di TSmod FRET-forza sensibilità 9. Oltre a flagelliform, spettrina ripete 5 e villin testata peptide (noto come HP35) 4 sono stati usati come i peptidi elastici tra FRET coppie in simili forza biosensori 4. Infine, un recente rapporto ha mostrato che TSmod può anche essere utilizzato per rilevare forze di compressione 10.
Abbiamo recentemente sviluppato un sensore di forza per il linker del nucleo-citoscheletro (LINC) complesso proteico Nesprin2G utilizzando TSmod inserito in una proteina troncata Nesprin2G precedentemente sviluppato noto come mini-Nesprin2G (Figura 2C), che si comporta in modo simile a endogena Nesprin-2G 11. Il complesso LINC contiene più proteine che portano dall'esterno verso l'interno del nucleo, che collega il citoscheletro citoplasmatica alla lamina nucleare. Nesprin-2G è vincolante una proteina strutturale sia allaactina citoscheletro nel citoplasma e alle proteine SUN nello spazio perinucleare. Utilizzando il nostro biosensore, siamo stati in grado di dimostrare che Nesprin-2G è soggetto a tensioni actomiosina-dipendente NIH3T3 fibroblasti 2. Questa è stata la prima volta che la forza è stata misurata direttamente attraverso una proteina nel complesso LINC nucleare, ed è destinato a diventare uno strumento importante per comprendere il ruolo della forza sul nucleo in mechanobiology.
Il protocollo che segue una metodologia dettagliata di come utilizzare il sensore di forza Nesprin-2G, compresa l'espressione del sensore di tensione Nesprin (Nesprin-TS) in cellule di mammifero, nonché l'acquisizione e l'analisi di immagini FRET su cellule che esprimono Nesprin- TS. Utilizzando un microscopio confocale invertito equipaggiato con un rivelatore spettrale, una descrizione di come misurare emissioni sensibilizzate FRET utilizzando unmixing spettrale e di imaging raziometrico FRET è disponibile. Le immagini raziometriche uscita possono essere usati per fare relativa quaconfronti forza ntitative. Mentre questo protocollo è focalizzata sull'espressione di Nesprin-TS in fibroblasti, è facilmente adattabile ad altre cellule di mammifero, entrambe le linee cellulari e cellule primarie. Inoltre, questo protocollo in cui riguarda l'acquisizione delle immagini e analisi FRET può essere facilmente adattato ad altri biosensori forza FRET-based che sono stati sviluppati per altre proteine.
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Protocol
1. Ottenere Nesprin-2G sensore DNA e di altri DNA plasmidico
- Ottenere Nesprin-2G TS (sensore di tensione) controllo, Nesprin-2G HL (senza testa), mTFP1, venere, e TSmod da una fonte commerciale. Propagare tutti i plasmidi di DNA e purificare utilizzando ceppi standard di E. coli, come DH5-α, come descritto in precedenza 12, 13.
2. Le cellule trasfezione con Nesprin-2G e altri plasmidi DNA
- Coltivare fibroblasti NIH 3T3 cellule al 70-90% di confluenza in un piatto di coltura cellulare 6 pozzetti in un incubatore standard di coltura cellulare con la temperatura (37 ° C) e regolazione CO 2 (5%). Per mezzo di crescita cellulare, utilizzare Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino.
- In una cappa di coltura cellulare, rimuovere il terreno e risciacquare ciascun pozzetto con circa 1 ml di medium di cellule ridotto siero. Aggiungere 800 ml di media cella ridotto siero in ciascun pozzettoe posizionare la camera 6 pozzetti in incubatrice.
- Pipettare 700 ml di mezzo di cellule ridotto siero in una provetta da 1,5 ml con 35 ml di soluzione di veicolo lipidico per formare il "lipomix". Mescolare pipettando. Etichettare la provetta con una "L"
- Raccogliere sei provette da 1,5 mL e li etichetta 1 a 6. Pipettare 100 ml di mezzo di cellule ridotto siero in ciascuna provetta.
- Utilizzando la concentrazione di DNA plasmidico dal passaggio 1 pipetta 2 pg di Nesprin 2G-TS in tubi 1 e 2. Pipettare 2 ug di Nesprin-HL in tubi 3 e 4. Pipettare 1 ug mTFP nel tubo 5. Pipettare 1 pg di mVenus nel tubo 6. non riutilizzare i puntali delle pipette durante la dispensazione diversi tipi di DNA.
- Pipetta 100 microlitri della lipomix dal tubo "L" in ogni provetta etichettata (1-6) e mescolare pipettando ripetutamente. Utilizzare una pipetta pulita per ogni provetta. Incubare per 10-20 minuti.
- Aggiungere 200 microlitri da ogni provetta etichettata ad un pozzo nella camera 6 pozzetti con 70-90% confluentile cellule. Etichettare la parte superiore di ciascun pozzetto con il DNA corrispondenti aggiunto. Posizionare la camera 6 pozzetti in un incubatore per 4-6 h.
- Aspirare il terreno e aggiungere 1-2 ml di mezzo di cellule ridotto siero risciacquo. Aspirare il mezzo cellule ridotta siero, aggiungere 2 ml di tripsina a ciascun pozzetto, e posizionare il piatto 6 pozzetti nell'incubatrice (5-15 min).
- Mentre le cellule si staccano nell'incubatrice, cappotto 6 fondo di vetro visualizzazione piatti con uno strato di fibronectina ad una concentrazione di 20 ug / ml disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Consentire i piatti per rivestire la superficie del cofano coltura cellulare (circa 20 minuti).
- Neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 mL di DMEM volta che le cellule sono staccati.
- Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta da centrifuga da 15 ml etichettati e centrifugare a 90 xg per 5 minuti in una centrifuga rotore oscillante. Aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet cellulare in 1.000 ml di DMEM con pipetta di miscelazione.
- Aspirare la miscela fibronectina dalpiatti di vetro e pipetta 1000 microlitri di ciascuna sospensione cellulare sulle stoviglie in vetro.
- Dopo che le cellule si depositano sul fondo dei piatti di vetro (~ 15 min), aggiungere un altro 1 ml di DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep ciascun pozzetto e posto nell'incubatrice cella. Permettono alle cellule per fissare e esprimere sensore per almeno 18-24 ore.
NOTA: Le cellule sono transfettate utilizzando cationici reagenti di transfezione lipidi commerciali (vedere la tabella dei materiali). Alternativamente, linee cellulari stabili possono essere selezionati utilizzando un plasmide con un gene che conferisce resistenza ad una tossina (plasmidi pcDNA per Nesprin-TS e -HL sono disponibili su un sito repository DNA (vedere la tabella dei materiali) fornire cellule che esprimono resistenza geneticina ). Inoltre, metodi di infezione virale (lentivirus, retrovirus o adenovirus) possono essere utilizzati per esprimere il sensore in cellule che sono difficili da trasfettare. - Oltre a Nesprin-TS, trasfettare cellule aggiuntivi con l'Nesprin HL zero percontrollo CE, come descritto ai punti 2.1-2.12; TSmod può anche essere usato come controllo zero forza e deve presentare FRET simile a Nesprin-HL.
- cellule trasfezione con mTFP1 e venus per generare impronte spettrali (vedere fase 4).
NOTA: mTFP1 e venus tipicamente esprimono a livelli superiori Nesprin-TS, e, come tale, può essere necessario transfettate per raggiungere livelli di espressione simili minori quantità di DNA.
3. Verificare Trasfezione efficienza
- Approssimativamente 18-24 ore dopo aver completato la trasfezione, utilizzare un microscopio a fluorescenza invertito per esaminare l'efficienza di trasfezione confrontando il numero di cellule fluorescenti al numero totale di cellule in vista (di solito 5-30%).
- Utilizzare un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una frequenza di eccitazione vicino 462 nm (mTFP1) o 525 nm (venere) ed un filtro di emissione centrato vicino 492 nm (mTFP1) o 525 nm (venere).
NOTA: In alternativa, GFP set di filtri catturerà una combinazione di mTFP1 e vele emissioni di Nus e permetterà la conferma della efficienza di trasfezione.
- Utilizzare un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una frequenza di eccitazione vicino 462 nm (mTFP1) o 525 nm (venere) ed un filtro di emissione centrato vicino 492 nm (mTFP1) o 525 nm (venere).
- Immagine cellule vive entro 48 ore dopo la trasfezione.
- In alternativa, fissare le cellule in 4% paraformaldeide in PBS (con calcio e magnesio) per 5 min, conservare in PBS, e visualizzazione dopo 48 h 8.
NOTA: Al di là di 48 ore, la qualità del segnale e la forza decade. Fissa le cellule preserva il loro stato, compreso il FRET espressi 8; Tuttavia, le cellule devono essere esposte solo in PBS, come mezzo di fissaggio può influire FRET 14. Cellule fisse possono essere confrontati solo ad altre cellule fisse, come ci può essere un cambiamento di espressione.
Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Indossare dispositivi di protezione adeguati (DPI).
- In alternativa, fissare le cellule in 4% paraformaldeide in PBS (con calcio e magnesio) per 5 min, conservare in PBS, e visualizzazione dopo 48 h 8.
4. Acquisizione spettrale impronte digitali di mTFP1 e Venere Fluorofori per spettrale unmixing
- In una cappa di coltura cellulare, sostituire il mezzo cella con l'imaging medium (HEPES-buffered) supplementato con 10% siero bovino fetale.
- Porre le capsule visualizzazione in (37 ° C) fase di microscopio confocale a temperatura controllata.
- Porre la capsula di visualizzazione in vetro con cellule mTFP1 transfettate oltre l'obiettivo dell'olio a 60X ingrandimenti, con un'apertura numerica di 1,4.
NOTA: L'olio viene utilizzato su un microscopio a scansione laser sull'obiettivo 60X per assomigliare da vicino l'indice di rifrazione del substrato di vetro. L'olio è posto sulla parte superiore della lente dell'obiettivo e viene in contatto diretto con il vetro coprioggetto. - Localizzare mTFP1 cellule che esprimono con una sorgente di eccitazione 458 nm ed un filtro passa-banda di emissione centrato a 500 nm.
- Con una cella fluorescente nel campo visivo, selezionare la modalità di rilevamento spettrale ( "Modo Lambda" nel software utilizzato qui) e catturare l'immagine spettrale (Figura 3-1); includere tutte le frequenze oltre 458 nm utilizzando incrementi di 10 nm (Figura 3-3). Selezionare un fl luminosoent regione (ROI) sulla cella (raggio 20 pixel).
NOTA: La forma spettrale della mTFP1 esprimono ROI dovrebbe rimanere relativamente costante attraverso la cella. Se la forma varia considerevolmente, ri-regolare il laser e ottenere impostazioni per migliorare il rapporto segnale-rumore. - Aggiungere il ROI fluorescente dire, l'intensità normalizzata al database spettrale facendo clic su "salva spettri al database."
- Ottimizzare la potenza del laser e di ottenere tale che un buon rapporto segnale-rumore è raggiunto. Impostazioni varieranno per diverse apparecchiature. Uso non fluorescenti, le cellule non transfettate come riferimento sfondo, aumentare il guadagno e la potenza finché le cellule sono luminose, ma non oltre la gamma dinamica del rivelatore (punto di saturazione). le cellule di sfondo non dovrebbero avere la fluorescenza rilevabile dopo una media di.
- Ripetere la procedura per le cellule venus-trasfettate con le seguenti eccezioni:
- Assicurarsi che la frequenza di eccitazione è a 515 nm e che il filtro passa-banda è centered vicino a 530 nm quando localizzare le cellule venus-esprimono.
- Nel "Modo Spectral", utilizzare una frequenza di eccitazione di 515 nm invece di 458 nm.
5. Acquisire immagini non miscelati
- Attivare la modalità di cattura per "spettrale unmixing."
- Aggiungere le impronte spettrali di venere e mTFP1 nei canali unmixing (Figura 3, ALT-2).
- Impostare il laser di eccitazione ad una fonte di argon 458 nm.
- Porre la capsula visualizzazione Nesprin-TS sopra dell'obiettivo olio 60X.
- Dopo aver focalizzato su una cella fluorescente con espressione sufficientemente chiara, regolare la potenza del laser guadagno e per ottimizzare il rapporto segnale-rumore.
NOTA: Poiché l'efficienza FRET di Nesprin-TS è vicina al 20%, l'immagine mescolate venere dovrebbe essere sostanzialmente dimmer dell'immagine mTFP1 mescolate rispetto. Una volta che un livello di potenza e guadagno accettabile sono stati determinati iterativamente, questi parametri devono rimanere costanti per tutte le immagini captured. - Acquisire un minimo di 15-20 immagini di cellule Nesprin-TS con una luminosità relativamente simili, evitando un'eccessiva saturazione pixel (tutti i pixel saturi vengono rimossi durante l'elaborazione dell'immagine).
- Ripetere il processo di cattura dell'immagine con cellule Nesprin-HL, utilizzando parametri di imaging identici.
Elaborazione 6. immagine e Rapporto Image Analysis
- Utilizzando il software open-source ImageJ (FIJI) (http://fiji.sc/), le immagini in formato nativo aperti con BioFormats Reader.
- Pre-elaborare le immagini e calcolano le immagini rapporto utilizzando protocolli stabiliti in precedenza 15.
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Representative Results
Seguendo il protocollo di cui sopra, il DNA plasmidico è stato acquisito dal repository DNA e trasformato in cellule di E. coli. E. coli che esprimono il DNA sensore sono stati selezionati da LB / piastre ampicillina e amplificati in un brodo LB liquido. Seguendo l'amplificazione dei vettori, plasmidi di DNA sono stati purificati in tampone TRIS-EDTA utilizzando uno standard, disponibile in commercio Kit di isolamento del DNA. Utilizzando uno spettrofotometro, DNA purificato è stato quantificato in un concentrazione standard di ug / mL (Figura 1A, giorni 1-2).
Usando fibroblasti NIH3T3, le cellule sono state coltivate a 70-90% di confluenza in un 6-ben piatto di plastica coltura cellulare. Per inserire DNA plasmidico nelle cellule NIH3T3, un plasmide trasfezione lipidi mediata è stata eseguita. Disponibile in commercio reagente di trasfezione (vedere la tabella dei materiali) è stato utilizzato come il vaso di lipidi per il DNA. Due repliche dii sensori Nesprin-TS e Nesprin-HL sono state trasfettate in 4 pozzetti di cellule (Figura 1B). In preparazione per l'imaging FRET, singoli costrutti fluoroforo di mTFP1 e venus state trasfettate in cellule NIH3T3 (Figura 1B). A seguito di trasfezione, le cellule sono state trasferite al fondo di vetro piatti visualizzazione compatibili con alto ingrandimento, microscopi confocali invertiti.
Prima di procedere al confocale, un semplice microscopio a fluorescenza a grande campo invertito è stato utilizzato per verificare l'efficienza di trasfezione. Utilizzando un obiettivo 10X con un'apertura numerica di 0,25, molte cellule in un campo di vista tipico espresso le Nesprin-TS (Figura 2). In generale, il sensore localizzato attorno all'involucro nucleare, coerente con la localizzazione di endogena Nesprin-2G 2. Il sensore controllo senza forza, Nesprin-HL, seguito un simile pattern di espressione 2.
Infine, le pile di immagini spettralmente risolte sono state importate in un software open-source ImageJ per l'elaborazione. Le immagini sono state pre-elaborati e immagini di rapporto sono stati calcolati utilizzando procedure stabilite 15.
Figura 1: diagramma di flusso Sperimentale Tempo basata. (A) A partire con sens acquisitio DNA plasmidico, E. coli vettori sono trasformate con DNA, selezionate e amplificate (giorni 1-2). Da concentrato brodo E. coli LB, DNA plasmidico è isolato e quantificato (3 ° giorno). Utilizzando plasmidi purificati, fibroblasti NIH3T3 sono transfettate in un formato sei pozzetti (B) e trasferite su piatti fondo di vetro che sono compatibili con un microscopio confocale invertito (3 ° giorno). Per verificare il successo della trasfezione, le cellule sono osservati sotto un microscopio a fluorescenza widefield dotate dei set di filtri appropriati (4 ° giorno). Subordinata una trasfezione di successo, le cellule vengono esposte su un microscopio confocale con rivelatore spettrale. Utilizzando unmixing spettrale, canali mTFP1 e Venere sono separati durante l'acquisizione e salvati come pile di immagini spettralmente risolte (giorni 4-5). Infine, le immagini vengono preparati in ImageJ, e il rapporto-immagini vengono calcolate. Please clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: un'immagine rappresentativa di transfettate NIH3T3 fibroblasti. (A) ingrandimento 10X di fibroblasti NIH3T3 trasfettate esprimenti Nesprin-TS utilizzando un filterset GFP. (B) Una vista esplosa del riquadro dall'espressione parte A. Sensore segue la membrana nucleare e spesso si estende nel citoplasma. (C) Nesprin-TS e Controllo -HL e come si legano al actina e domini di legame SUN. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Spectral Fingerprinting Tutorial Utilizzando Confocal Software. spettri di emissione normalizzato ottenuto da radio 20-pixel nelle regioni-di-interesse evidenziati delineate da mirini colorati. (ALT-1) modalità di rilevazione spettrale per acquisire l'immagine. (Arrow-2) "spettrale unmixing" impostazione per aggiungere spettri normalizzati al database spettrale. (ALT-3) La frequenza di eccitazione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: diretta spettrale unmixing e uscita di confocale Software. (A) i parametri di imaging critici di riprodurre, le immagini non miscelati dal vivo. (ALT-1) La frequenza di eccitazione. (Arrow-2) Live modalità unmixing spettrale. Immagine (B) Nuclei di canale venus non miscelato. (
Figura 5: Nesprin-TS FRET immagini quoziente modellata e nanostrutturata rene Madin Darby Canine-(MDCK) cellule. Cellule MDCK che esprimono stabilmente Nesprin-TS sono stati ripresi su 10 linee um a livello fibronectina (A) o (B) membrane polidimetilsilossano nanostrutturata (PDMS). membrane nucleari sono stati visivamente mascherati e trasformati in rapporti FRET. La barra della scala colorata rappresenta il rapporto di ampiezza FRET per nuclei nanostrutturata e modellata.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Processed raziometrica FRET Immagini da cellule e analisi Istogramma di dati aggregati Nesprin-TS-Esprimendo. (A) Un rappresentante, normalizzato istogramma sovrapposto di FRET immagini ratio Nesprin-TS trattati con inibitore miosina ML7, codice colore da singoli nuclei cellulari. (B) Un rappresentante, istogramma sovrapposto normalizzato di FRET immagini ratio Nesprin-TS trattati con caliculina A, un attivatore di contrattilità cellulare. La legenda correla ogni nucleo analizzata per la sua posizione sulla istogramma. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Procedimento e dimostrazione di cellule vive di tensione meccanica di tutti Nesprin-2G, una proteina nel complesso LINC nucleare, è stata illustrata sopra. Prima di questo lavoro, varie tecniche, come micropipetta aspirazione, magnetico-tallone citometria, e microscopica laser ablazione, sono stati utilizzati per applicare tensione sul nucleo cellulare e per misurare le proprietà materiali sfusi 16, 17, 18. Tuttavia, fino al nostro recente lavoro, studi hanno dimostrato direttamente che forze di trazione vengono trasferite direttamente su una proteina complesso LINC in cellule vive 2.
In precedenza, il nostro laboratorio ha dimostrato che una versione modificata di Nesprin2G, noto come mini-Nesprin2G, potrebbe essere ingegnerizzato per esprimere una sonda FRET forza conosciuta come TSmod (Figura 2C) 2. TSmod stato mostrato precedentemente per misurare dinamicamente trazione perces in cellule vive e in varie proteine portanti 3, 4, 6, 8. E 'stato inoltre dimostrato che mini-Nesprin-2G indistinguibile da quello endogeno Nesprin-2G rispetto alla sua localizzazione, effetti noti sulla citoscheletro, e la capacità di salvare posizionamento nucleare 11, 19. Utilizzando la proteina mini Nesprin-2G con il TSmod (Nesprin-TS), è stato dimostrato che i fibroblasti NIH3T3 esprimenti la sonda hanno un livello basale di tensione rispetto al Nesprin-HL, che non possono legarsi ai actina 2. Inoltre, la modulazione della contrattilità cellulare utilizzando inibitori o attivatori di miosina può essere rilevato da Nesprin-TS 2.
Ci sono una serie di passaggi critici in questo protocollo. Confondere Nesprin-TS con Nesprin-HL (DNA o cellule che esprimono) non è READIly rilevato, sia come analogamente localizzare nella membrana nucleare, e porterà a risultati confusi. Poiché Nesprin-HL è un controllo senza forza, il FRET misurata dovrebbe essere superiore Nesprin-TS in media. Per essere prudenti, di sequenziamento isolato costrutti di DNA e cellule con cura di etichettatura è consigliato. In secondo luogo, è importante per ottimizzare attentamente il guadagno del rivelatore e potenza del laser sul microscopio confocale a migliorare il rapporto segnale-rumore e minimizzare candeggio. Per misurare correttamente FRET, questi parametri devono rimanere costante durante l'acquisizione dell'immagine. Inoltre, ottimizzando il guadagno del rivelatore di potenza o per cellule esprimenti dim o molto luminoso è ottimale, perché le cellule che esprimono mediani tenderanno a cadere fuori della gamma dinamica del rivelatore. Alcune cellule che esprimono una elevata concentrazione di sensore tendono a fluorescenza in nucleoplasma e reticolo endoplasmatico, rendendo difficile risolvere la membrana nucleare, che è probabilmente la regione più interessante per quanto riguarda FoRCE. Selezionando le cellule con livelli di espressione leggermente inferiori tende a risolvere il problema della localizzazione sensore.
Mentre raziometrico immagini spettrali è un modo relativamente semplice e rapido per misurare FRET, che fa unità non uscita di efficienza FRET causa di segnale accettore spurgo attraverso 20. Senza unità di efficienza FRET, non è possibile convertire l'indice del rapporto FRET in una misurazione di forza calibrata. A causa di questa limitazione, solo relativi confronti forza quantitative possono essere fatte. efficienza FRET può essere determinata con metodi più complessi, come l'imaging di fluorescenza-vita microscopia (FLIM) o accettore photobleaching. Forza assoluta (a livello pN) può essere stimata efficienza FRET, come precedentemente descritto 3, 8.
In contrasto con i metodi precedenti per misurare le proprietà meccaniche del nucleo o lo spostamento del nucleo o basen esternamente applicata forze, misurando il FRET da Nesprin-TS ha il vantaggio di non invasivo tensione sondaggio su un componente della membrana nucleare 16, 17, 18. Il sensore emette un segnale fluorescente che è correlato con la pressione sulle singole molecole Nesprin-2G. Al contrario, micropipetta aspirazione richiede l'uso di utensili delicati quando si lavora con cellule vive. Confocale ablazione laser provoca danni cellulari locale e richiede una sorgente laser pulsata. torsione magnetica citometria forze trasferisce sulla membrana nucleare attraverso il citoscheletro e non può essere utilizzato per misurare forze sulle proteine specifiche, se non dovesse essere accoppiato con il sensore di tensione Nesprin-2G.
Mentre è stato dimostrato che le forze di trazione actina-based sono trasferiti Nesprin-2G, un componente del complesso LINC, rimane sconosciuta quante trazione o forze di compressione sono esercitatesu altre proteine strutturali LINC, quali SUN-1 o SUN-2. lavoro futuro sarà diretto alla clonazione sonde FRET-force in queste proteine putative LINC portanti per chiarire ulteriormente meccanica nucleari con risoluzione a livello proteico. Un altro problema che si presenta è che i cambiamenti nella FRET può essere correlato alle variazioni di tensione, ma piuttosto riflettono sia variazioni Nesprin-2G oligomerizzazione o cambiamenti conformazionali di Nesprin-2G. Variazioni di pH cellulare possono influenzare la fluorescenza del sensore e modificare il FRET misurato. Il sensore Nesprin-2G HL rappresenta un buon controllo per alcuni di questi cambiamenti (come variazioni FRET osservati con questo sensore è più probabile estranei a forza), e intermolecolari costrutti di controllo FRET può essere sviluppato per valutare oligomerizzazione (vedi sotto). Inoltre, l'espressione di nesprin-2G TS è guidata da un promotore di CMV, che si traduce in sovraespressione, e questo elevato livello di espressione può potenzialmente indurre artefatti biologici. I recenti progressi con clustered regolarmente intervallati ripete palindromi brevi (CRISPR) hanno permesso per la riparazione di omologia-diretto (HDR) si avvicina per inserire sequenze di DNA più grandi nel genoma 21. Questo approccio potrebbe essere utilizzato per modificare endogena Nesprin-2G (o altre proteine) per includere TSmod. Ciò darebbe espressione del sensore di forza utilizzando il promotore endogeno appropriato, riducendo il rischio di artefatti iperespressione.
TSmod e altre sonde FRET elastici possono anche essere utilizzati per sviluppare nuovi sensori per altre proteine, che potrebbe quindi essere utilizzati in un protocollo simile a quello descritto in questo articolo. Una grande preoccupazione con lo sviluppo di qualsiasi nuovo sensore di forza è determinare il sito di inserzione interna per il sensore FRET. In primo luogo, il sito di inserimento deve essere in una regione della proteina sottoposto a carico meccanico. Tali regioni possono essere identificati esaminando cui le proteine citoscheletriche collegato interagiscono con la proteina. In secondo luogo, l'inserimentodel grande (~ 50 kDa) TSmod non deve disturbare la funzione biologica della proteina studiata. Una forma precedentemente sviluppato "mini" di Nesprin-2G dimostrato che i domini CH actina-di legame a ponte al dominio KASH SUN-binding erano sufficienti per Nesprin-2G movimento nucleare in monostrati feriti 11, 19, suggerendo che l'inserimento di TSmod sarebbe probabilmente non disturbare la funzione della proteina. Conferma della funzione biologica del sensore richiede un saggio funzionale per la funzione della proteina (in cui il sensore di forza può essere visualizzata per salvare una funzione specifica nelle cellule impoverito di proteina endogena). In terzo luogo, i cambiamenti nella oligomerizzazione delle proteine possono alterare il FRET tra le proteine (chiamato FRET intermolecolare 22), che si tradurrebbe in cambiamenti FRET che non sono legati alla forza. Un'attenta analisi di questo spesso richiede costrutti specializzati intermolecolari FRET che riportano specificamente oligomerizzazione.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Thomas F. e Kate Miller Jeffress Memoria Trust (a dicembre) e NIH concedere R35GM119617 (a dicembre). Il microscopio confocale di imaging è stata effettuata presso l'impianto di VCU Nanomateriali Caratterizzazione core (NCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
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