Introduction
포스 성 유전자 부호화 FRET 센서 최근 생균 인장 계의 힘을 측정하는 단백질 1, 2, 3, 4에인가되는 방법을 기계적 힘에 대한 통찰력을 제공하기위한 중요한 도구로 떠오르고있다. 이러한 도구를 사용하여, 연구자들은 기존의 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포에서 비 침습적 영상 세포 내 힘 수 있습니다. 이러한 센서는 탄성 펩티드 (3)에 의해 분리 된 FRET 쌍 (도너와 억 셉터 형광 단백질, 자주 청색 공여체 및 수용체 노란색)로 구성된다. C- 또는 N- 말단 태그 대조적으로,이 센서는 분자 스트레인 게이지로서 행동하고,이 단백질에 걸쳐 전송되는 기계적인 힘을 측정 할 수있는 단백질의 내부 부위에 삽입된다. 프렛-P 사이의 증가 된 거리에서 센서 결과 걸쳐 기계적 장력을 증대공기 감소 FRET 3의 결과. 그 결과, FRET 반비례 인장력에 관한 것이다.
이러한 형광 기반 센서는 초점 접착 단백질 (vinculin 3 talin 4), 세포 골격 단백질 (α-티닌 5), 및 세포 - 세포 접합 단백질을 위해 개발 된 (E-cadherin의 6, 7, VE-cadherin의 8 및 PECAM 8). 이러한 바이오 센서에서 가장 자주 사용되는 잘 특징으로하는 탄성 링커 TSmod라고도하고 거미줄 단백질 flagelliform로부터 유도 된 40 개 아미노산 (GPGGA) (8)의 반복되는 시퀀스로 구성된다. TSmod은 인장력 3/5 PN 1 FRET에 응답하여 선형 탄성 나노 스프링처럼 행동하는 것으로 나타났다. flagelliform의 다른 길이는 동적 R을 변경하는 데 사용할 수 있습니다TSmod FRET 힘 감도 (9)의 플랜지. flagelliform 외에도 스펙 트린은 (HP35라고도 함) (5)와 villin 투구 펩티드 4는 유사한 포스 바이오 센서 (4) 사이의 FRET 쌍 탄성 펩티드로서 사용되어왔다를 반복한다. 마지막으로, 최근의 보고서는 TSmod는 압축력 (10)를 감지하는 데 사용할 수 있다는 것을 보여 주었다.
최근 TSmod 내생 비슷하게 동작 미니 Nesprin2G (도 2C)로 알려진 이전에 개발 된 절두 Nesprin2G 단백질 삽입 이용하여 nucleo - 골격 (LINC) 복합 단백질 Nesprin2G의 링커 힘 센서를 개발 Nesprin-2G (11). LINC 복합체는 핵에 얇은 골격을 연결하는 세포질, 핵의 외부에서 내부로 이끌어 다중 단백질을 포함한다. Nesprin-2G는 구조적 단백질에 결합되는 두세포질과 핵 주변 공간에 태양 단백질 액틴 세포 골격. 우리의 바이오 센서를 사용하여, 우리는 Nesprin-2G는 NIH3T3 섬유 아세포 2 액토 마이 오신에 의존 긴장 될 수 있음을 보여줄 수 있었다. 이것은 그 힘이 바로 핵 LINC 단지에 단백질을 통해 측정 한 처음, 그리고 제어 공학의 핵에 힘의 역할을 이해하는 중요한 도구가 될 가능성이 높습니다.
프로토콜은 아래 Nesprin-을 발현하는 세포의 FRET 화상의 포유 동물 세포에서 Nesprin 장력 센서 (Nesprin-TS)의 발현뿐만 아니라, 수집 및 분석을 포함하여 Nesprin-2G 힘 센서를 사용하는 방법의 상세한 방법을 제공한다 TS. 분광 검출기를 구비 한 반전 된 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여, 발광 증감을 측정하는 방법을 설명 unmixing 스펙트럼을 이용하여 비율 적 FRET FRET 및 촬상이 제공된다. 출력 이미지가 상대적 비율 적 ...로서 확인하는데 사용될 수있다ntitative 힘 비교. 이 프로토콜은 섬유 아세포 Nesprin-TS의 발현에 집중되는 반면, 세포주 및 일차 전지 모두 포함한 다른 포유 동물 세포에 쉽게 적응할 수있다. 또한, 이미지 수집 및 FRET 분석에 관련된 프로토콜이 용이 다른 단백질에 대해 개발 된 다른 FRET 기반 포스 바이오 센서에 적용될 수있다.
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Protocol
1. Nesprin-2G 센서 DNA 및 다른 플라스미드 DNA를 구합니다
- 상업적인 소스로부터 Nesprin 2G-TS (인장 센서) Nesprin HL-2G (헤드리스) 제어 mTFP1 금성 및 TSmod를 구합니다. 모든 DNA 플라스미드를 전파 이전 12,13 바와 같이, 이러한 DH5-α 표준 E. 콜라이 균주를 사용하여 정제.
Nesprin-2G 및 기타 플라스미드 DNA 2. 형질 세포
- 온도 (37 ° C) 및 CO 2 5 %로 규제 표준 세포 배양 인큐베이터에서 6- 웰 세포 배양 접시에 70-90 %의 합류점에 NIH 3T3 섬유 아세포의 세포 성장. 세포 성장 매체의 경우, 10 % 소 태아 혈청 둘 베코의 변형 이글 중간 (DMEM)을 사용합니다.
- 세포 배양 후드에서, 배지를 제거하고 감소 된 혈청 배지 세포의 약 1 mL로 각 웰을 씻어. 각 웰에 감소 혈청 세포 매체의 800 μL를 추가상기 인큐베이터에서 6- 웰 챔버를 배치했다.
- 지질 담체 용액 35 μL와 함께 1.5 ㎖의 튜브에 감소 된 혈청 세포 배지 700 μL 피펫은 "lipomix"를 형성한다. 피펫으로 섞는다. 에 "L."로 튜브 라벨
- 여섯 개 1.5 ㎖의 튜브를 수집하고, 각 관으로 감소 된 혈청 세포 배지 6 μL 피펫 (100)을 통해 1 라벨.
- mVenus 항 피펫 1 μg의 튜브에 튜브 (3) 및 제 피펫 1 mTFP의 μg의로 튜브 1 및 2 피펫 2 Nesprin-HL의 μg의 한 단계 1 피펫 2 Nesprin 2G-TS의 μg의으로부터 플라스미드 DNA의 농도를 사용하여 튜브 (6)에 다시 사용하지 마십시오 피펫 팁을 DNA의 다른 유형을 피펫 팅 할 때.
- 각 분류 관 (1-6)에 "L"튜브로부터 lipomix 100 μL 피펫 및 피펫 팅을 반복하여 혼합한다. 각 튜브에 대한 깨끗한 피펫을 사용합니다. 10 ~ 20 분 동안 품어.
- 70-90 % 합류로 6 웰 챔버의 웰에 각각 분류 관에서 200 μL를 추가세포. 해당 DNA와 각 웰의 상부에 라벨했다. 4-6 시간 동안 인큐베이터에서 6- 웰 챔버를 놓는다.
- 배지를 흡인하고 린스 감소 된 혈청 배지 셀 1-2 mL를 첨가. 상기 감소 된 - 혈청 배지를 세포 기음 각 웰에 트립신 2 mL를 첨가하고, 인큐베이터 (5-15 분)로 6 웰 접시를 배치했다.
- 세포 배양기에서 분리되지만, 피막 (6) 유리 바닥은 인산 완충 용액 (PBS)에 용해 된 20 ㎍ / ml의 농도에서 피브로넥틴의 층으로 요리를보고. 코팅하는 요리를 세포 배양 후드 (약 20 분)의 표면을 허용한다.
- 세포가 분리되면 DMEM 2 용액을 첨가함으로써 트립신을 중성화.
- 또한 표지 된 15 mL의 원심 분리 튜브에 각각의 콘텐츠를 전송하고 스윙 로터 원심 분리기에서 5 분 동안 90 XG에서 스핀 다운. 상등액을 흡인 피펫 혼합하여 DMEM 1000 μL의 각 세포 펠렛을 다시 일시.
- 로부터 피브로넥틴 혼합물 기음유리 접시 피펫 유리 접시 상에 각 세포 현탁액을 1000 μL.
- 세포가 유리 접시의 바닥 (~ 15 분)에 정착 한 후, 세포 배양기에서 잘 장소 각각 다른 DMEM 1 ㎖의 + 10 % FBS + 1 % 스트렙토 펜을 추가한다. 세포가 적어도 18 ~ 24 시간 동안 센서를 부착하고 표현 할 수 있습니다.
참고 : 세포 상업 양이온 성 지질 형질 전환 시약 (재료의 표 참조)을 사용하여 형질 전환된다. 대안 적으로, 안정한 세포주는 독소에 대한 내성을 부여하는 유전자를 가진 플라스미드를 사용하여 선택 될 수있다 (Nesprin-TS와 -hl 대한 pcDNA 벡터 플라스미드 네티 신 내성을 발현하는 세포 (물질의 표를 참조)를 제공하는 DNA 저장소 사이트에서 사용할 ). 또한 바이러스 감염 방법 (렌티 바이러스, 레트로 바이러스 또는 아데노 바이러스)를 형질 어렵다 셀 센서를 표현하는데 이용 될 수있다. - Nesprin-TS 외에도 Nesprin HL 제로위한 부가적인 세포를 형질CE 제어 2.1-2.12 단계에서 설명한 바와 같이, TSmod 또한 제로 - 힘 제어로 사용될 수 Nesprin HL-유사한 FRET을 발휘한다.
- mTFP1 금성로 형질 세포 스펙트럼 지문 (단계 4 참조)를 생성한다.
참고 mTFP1 금성은 일반적 Nesprin-TS보다 높은 수준의 발현과 같은 DNA의 하부 양 유사한 발현 수준을 달성하기 위해 형질 전환 될 필요가있다.
3. 형질 전환 효율을 확인
- 대략 18-24 시간 형질을 마친 후,도 셀 (통상 5-30 %)의 총 수에 형광 세포의 수를 비교하여 형질 전환의 효율을 조사하기 반전 형광 현미경을 사용한다.
- 462 나노 미터 (mTFP1) 또는 525 나노 미터 (금성) 및 492 nm의 (mTFP1) 또는 525 나노 미터 (금성) 근처에 중심 발광 필터 근처의 여기 주파수가 장착 된 형광 현미경을 사용한다.
참고 : 또는 GFP 필터 세트 mTFP1의 조합을 캡처했습니다 것NUS 배출량은 형질 전환 효율의 확인을 허용합니다.
- 462 나노 미터 (mTFP1) 또는 525 나노 미터 (금성) 및 492 nm의 (mTFP1) 또는 525 나노 미터 (금성) 근처에 중심 발광 필터 근처의 여기 주파수가 장착 된 형광 현미경을 사용한다.
- 형질 전환 후 48 시간 내에 이미지 살아있는 세포.
- 대안 적으로, 48 시간 후 8 PBS에서 5 분간, 상점, 볼 (칼슘 및 마그네슘과 PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다.
참고 : 48 시간을 넘어, 신호 품질 및 강도는 붕괴. 세포를 고정하기 (8)로 표현되는 FRET 포함한 상태를 유지; 매체를 장착하여 FRET (14)에 영향을 미칠 수있다 그러나, 셀은, PBS에 이미징되어야한다. 표정의 변화가있을 수에 따라 고정 셀은 다른 셀에 고정 비교 될 수있다.
주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 할 것.
- 대안 적으로, 48 시간 후 8 PBS에서 5 분간, 상점, 볼 (칼슘 및 마그네슘과 PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다.
스펙트럼 Unmixing에 대한 mTFP1과 금성 형광 발색단 4. 캡처 스펙트럼 지문
- 세포 배양 후드에서 촬상 mediu와 세포 배지를 교체10 % 소 태아 혈청 m (HEPES 완충).
- 온도 제어 (37 ° C) 공 초점 레이저 주사 현미경 단계에서 보는 요리를 놓는다.
- 1.4 개구 수 60X 배율 오일 대물 위에 mTFP1 형질 세포 유리 뷰잉 접시 놓는다.
주 : 오일 밀접 유리 기판의 굴절률이 유사 할 60X 대물 렌즈에 레이저 스캐닝 현미경에 사용된다. 오일은 대물 렌즈의 상단에 배치하고 유리 커버 슬립과 직접 접촉한다. - mTFP1는 458 nm의 여기 원 및 500 nm의 발광 중심 대역 통과 필터로 발현 세포를 찾아.
- 시야에서 형광 셀 (여기에서 사용되는 소프트웨어 "람다 모드") 스펙트럼 검출 모드를 선택하고, 분광 화상 (도 3-1)을 캡처; 10 개 나노 미터 단위 (도 3-3)을 이용하여 458 nm의 이후의 모든 주파수를 포함한다. 밝은 fluoresc를 선택셀 (20 화소 반경)에 ENT 영역 (ROI).
참고 : mTFP1 발현 투자 수익 (ROI)의 스펙트럼 형태는 셀에 걸쳐 상대적으로 일정하게 유지해야한다. 형상이 현저하게 변화되면, 레이저를 재조정하고, 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 설정을 얻는다. - 클릭하여 스펙트럼 데이터베이스에, 형광 ROI 의미 정규화 강도를 추가 "데이터베이스에 스펙트럼을 저장합니다."
- 레이저 파워를 최적화하고 양호한 신호 대 잡음비가 성취되도록 얻는다. 설정은 다른 장비에 따라 다를 것입니다. 배경 기준으로 비 - 형광, 형질 감염되지 않은 세포를 사용하여, 그러나, 검출기 (포화)의 동적 범위를 넘어, 세포가 밝은 때까지 상기 이득과 전력을 증가시킨다. 배경 세포는 평균 후 감지 형광 없어야합니다.
- 다음을 제외 금성 - 형질 전환 된 세포의 과정을 반복합니다 :
- 여기 주파수가 515 nm에서인지 확인하고, 밴드 패스 필터는 CE라고금성 발현 세포를 찾을 때 530 나노 미터 근처 ntered.
- 의 "스펙트럼 모드"내지 515 대신 458 nm 인 여기 주파수를 사용한다.
5. 캡처 혼합하지 않은 이미지
- 에 캡처 모드 전환 "스펙트럼 Unmixing을."
- unmixing 채널로 (도 3, 화살표 2) 금성 mTFP1의 스펙트럼 지문을 추가한다.
- 다시 458 nm의 아르곤 소스 여진 레이저를 설정한다.
- 60X 오일 대물 위 Nesprin-TS 볼 접시 놓는다.
- 충분히 밝은 식 형광 세포에 집중하면, 신호 대 잡음비를 최적화하는 게인 및 레이저 파워를 조정한다.
참고 Nesprin-TS의 FRET 효율은 20 % 가까이 있기 때문에, 혼합되지 않은 금성 화상이 섞이지 mTFP1 이미지보다 실질적으로 더 어둡게 될 것이다. 허용 전력 및 이득 설정이 반복적으로 결정되면, 이들 매개 변수는 모두 이미지 대위에 대한 일정하게 유지해야ured. - (모든 포화 화소 화상 처리 동안 제거되는) 비교적 유사한 밝기 Nesprin-TS 셀 15-20 이미지 캡처 최소 화소 과도한 포화를 방지.
- 동일한 촬상 파라미터를 사용하여 HL-Nesprin 세포 촬상 처리를 반복한다.
6. 이미지 프로세싱 및 비율 이미지 분석
- 사용하여 오픈 소스 ImageJ에 (피지) 소프트웨어 (http://fiji.sc/), BioFormats Reader를 사용하여 열려있는 기본 형식 이미지.
- 전 과정을 이미지와는 이전에 설정된 프로토콜 15을 사용하는 비율 이미지를 계산한다.
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Representative Results
전술 한 프로토콜에 따라, 플라스미드 DNA는 DNA 저장소로부터 취득하고, 대장균에 형질 전환. 센서 DNA를 발현하는 대장균을 LB / 암피실린 플레이트로부터 선택 LB 액체 배지에서 증폭 하였다. 벡터의 증폭에 이어, 플라스미드 DNA는 표준 시판 DNA 분리 키트를 이용 TRIS-EDTA 버퍼로 정제 하였다. 분광 광도계를 사용하여, 정제 된 DNA는 ㎍ / ㎖ (도 1a, 1-2 일), 표준의 농도로 정량 하였다.
NIH3T3 섬유 아세포를 사용하여, 세포를 6- 웰 세포 배양 플라스틱 접시에 70-90 %의 합류로 성장시켰다. NIH3T3 세포로의 플라스미드 DNA를 삽입하기 위해, 지질 - 매개 형질 감염, 플라스미드 수행 하였다. 시판되는 형질 감염 시약 (물질의 표를 참조)에 대한 DNA 지질 용기로서 사용 하였다. 두 복제Nesprin-TS 및 HL-Nesprin 센서 4 셀 웰 (도 1b)로 형질 감염시켰다. FRET 촬상 준비에서 mTFP1 금성 단일 형광 제물은 NIH3T3 세포 (도 1b)로 형질 감염시켰다. 형질 감염 후, 세포를 고배율, 반전 된 공 초점 현미경과 호환 요리 시청 유리 바닥에 옮겼다.
공 촛점 이미지로 진행하기 전에, 간단한 반전 넓은 분야 형광 현미경 형질 감염 효율을 확인 하였다. 전형적인 시야 0.25 많은 세포의 개구와 10X 대물 렌즈를 사용하여이 Nesprin-TS를 (도 2)에 나타냈다. 일반적으로, 센서 Nesprin-2G 2 내인성 제이션과 일치 핵막 주변 지역화. 노 구동력 제어 센서 Nesprin HL-가 유사한 발현 양상이 따랐다.
마지막으로, 스펙트럼 해결 이미지 스택은 처리를 위해 ImageJ에 오픈 소스 소프트웨어에 수입되었다. 이미지를 전처리하고, 비 이미지 설정 절차 15을 사용하여 계산 하였다.
그림 1 : 실험 시간 기반 플로우 차트. (A) 인수 SENS 시작또는 플라스미드 DNA, 대장균 벡터는 DNA로 형질 전환 선택하고, (1-2 일) 증폭된다. 농축 E. 콜라이 LB 배지에서 플라스미드 DNA를 분리하였고, (주 3) 정량. 정제 된 DNA 플라스미드를 사용 NIH3T3 섬유 아세포는 여섯 웰 포맷 (B)에 형질 감염 반전 공 초점 현미경 (주 3)과 호환되는 유리 - 바닥 접시 상에 전사된다. 형질의 성공 여부를 확인하기 위해, 세포는 적절한 필터 세트 (주 4)가 장착 된 형광 현미경 위드 볼된다. 성공적인 형질 감염 할시, 세포는 분광 검출기를 구비 한 공 초점 현미경에 이미징된다. 스펙트럼 unmixing를 사용 mTFP1 금성 채널 획득 과정을 분리하고, 스펙트럼 분해 화상 스택 (4-5 일)으로서 저장된다. 마지막으로, 이미지를 ImageJ에에서 전처리되고, 비 - 이미지가 계산된다. PLEASE는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 트랜 NIH3T3 섬유 아 세포의 대표 이미지. GFP의 filterset를 사용 Nesprin-TS를 발현하는 형질 감염된 NIH3T3 섬유 아세포의 (A) 10X 배율. (B) 부분 A. 식 센서에서 바운딩 박스의 분해도 핵막 다음 종종 세포질 내로 연장된다. (C) Nesprin-TS와 -hl 제어 및 그들이 어떻게 액틴과 SUN 바인딩 도메인에 바인딩합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : S공 초점 소프트웨어를 사용 pectral 지문 자습서. 표준화 발광 스펙트럼은 하이라이트 영역 관심 - 컬러로 구분 십자선 20 픽셀의 반경에서 얻어진. (화살표 1) 이미지를 캡처하는 스펙트럼 검출 모드. 스펙트럼 데이터베이스에 정규화 된 스펙트럼을 추가 설정 (화살표-2) "스펙트럼 Unmixing". (화살표 3) 여기 주파수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 라이브 스펙트럼 Unmixing 및 공 촛점 소프트웨어의 출력. (A) 중요한 이미징 매개 변수 라이브, 혼합되지 않은 이미지를 재현합니다. (화살표 1) 여기 주파수. (화살표-2) 스펙트럼 unmixing 모드 라이브. 섞이지 금성 채널 (B) 핵 이미지. (
도 5 : 패터닝되고 패터닝되지 않은 Madin - 다비 개 신장 (MDCK) 세포 Nesprin TS-FRET 비율 이미지. 안정적 Nesprin-TS 표현 MDCK 세포를 10 μm의 폭 피브로넥틴 라인 (A) 또는 패턴 화 된 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 막 (B) 상에 묘화 하였다. 핵막 시각적 마스킹 및 FRET 비율로 처리 하였다. 착색 스케일 바는 패턴 화 및 패터닝을위한 핵 FRET 진폭 비를 나타낸다.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6에서 처리 된 비례 FRET 이미지 셀 및 집계 된 데이터의 히스토그램 분석을 Nesprin-TS는 발현. (A)의 대표적인 개별 세포 핵에서 컬러 코딩 ML7 미오신 억제제로 처리 Nesprin-TS의 FRET 비율 이미지 정규화 누적 히스토그램. (B)의 대표적인, 칼리 큐린 A, 셀 수축력 활성제로 처리 Nesprin-TS의 FRET 비율 이미지 정규화 누적 히스토그램. 범례 히스토그램상의 위치에 대한 각 분석 핵 상관 관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
방법 및 Nesprin-2G 핵 LINC 복잡 단백질 걸쳐 기계적 장력 생균 촬상 시연은 위에서 언급되었다. 이전이 연구에, 이러한 마이크로 피펫 흡인 세포 계측법, 자성 비드, 현미경 레이저 절제와 같은 다양한 기술들은, 세포핵에 변형을 적용하고, 벌크 물성 16, 17, 18을 측정하기 위해 사용되었다. 그러나, 최근의 작품까지, 어떤 연구는 직접 인장 힘은 살아있는 세포 2에 LINC 복잡한 단백질에 직접 전달되는 것을 보여 없었다.
이전에, 우리 실험실 미니 Nesprin2G라고도 Nesprin2G, 수정 된 버전 TSmod (도 2c) 2로 알려진 FRET 력 프로브를 발현하도록 유전자 조작 될 수 있다는 것을 보여 주었다. TSmod 이전위한 동적 장력을 측정하는 것으로 하였다생균과 각종 내력벽 단백질 3, 4, 6, 8에서 CES. 그것은 상기 미니 Nesprin-2G는 제이션에 대한 내인성 Nesprin-2G 구별 것을 도시하고, 골격, 및 능력에 영향 알려진 핵 위치 11, 19 구출. TSmod (Nesprin-TS)와 미니 Nesprin-2G 단백질을 이용하여, 상기 센서를 발현하는 NIH3T3 섬유 아세포는 액틴 (2)에 결합 할 수 Nesprin-HL에 장력 상대적 기준 레벨을 가지고 도시되었다. 또한, 억제제 또는 미오신의 활성제를 이용하여 세포의 수축력 변조 Nesprin-TS (2)에 의해 검출 될 수있다.
이 프로토콜의 중요한 단계가 있습니다. Nesprin-HL (DNA 또는 발현 세포)를 Nesprin-TS 혼동 readi 것은 아니다모두 유사하게 핵 막에 지역화, 혼란 결과로 이어질 것으로 사라져가 발견되었습니다. Nesprin HL-가없는 구동력 제어이기 때문에, 측정 FRET은 평균 Nesprin-TS 이상이어야한다. 신중하기 위해, 서열 고립 DNA 구조 및주의 라벨 세포가 좋습니다. 둘째,주의하여 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 표백을 최소화하기 위해 공 초점 현미경에 검출기 이득 및 레이저 출력을 최적화하는 것이 중요하다. 제대로 FRET를 측정하기 위해, 이러한 매개 변수는 이미지 수집하는 동안 일정하게 유지해야합니다. 중앙값 발현 세포는 상기 검출기의 동적 범위 밖으로 떨어지는 경향이 있기 때문에 또한, 어둡거나 너무 밝은 발현 세포에 대한 검출기 이득 또는 전력을 최적화하는 것은, 최적이다. 센서의 고농도 발현을 특정 세포가 곤란 FO에 관해서 더욱 흥미 영역이 생각된다 핵막을 해결하기 위해 만들어 핵질 및 소포체에서 형광 경향RCE. 약간 낮은 발현 수준과 세포를 선택하면 센서 현지화의 문제를 해결하는 경향이있다.
비율 적 스펙트럼 이미징은 FRET 측정을 비교적 간단하고 빠른 방법이지만, 인해 수용체 신호 블리드 스루 20 FRET 효율성의 출력하지 않는 장치. FRET 효율성 단위 없이는 보정 힘 측정에 FRET 비 인덱스로 변환 할 수 없다. 이 때문에 제한으로 만 상대 정량 힘 비교는 할 수있다. FRET 효율성 같은 형광 수명 이미징 현미경 (FLIM) 또는 수용체 광표백 같은보다 복잡한 방법에 의해 결정될 수있다. 이전 3 8 바와 같이합니다 (PN 수준) 절대 력은 FRET 효율성에서 추정 될 수있다.
이전의 방법과는 대조적으로 핵의 기계적 특성이나 핵 O 계의 변위를 측정 할외부 Nesprin N-TS는 핵막 16, 17, 18의 구성 요소에 비 침습적 프로빙 장력의 이점을 갖는다에서 FRET 측정, 힘을 적용 하였다. 센서는 개별 Nesprin-2G 분자의 변형과 연관되어 형광 신호를 출력한다. 살아있는 세포로 작업 할 때 대조적으로, 마이크로 피펫 흡인 섬세한 도구의 사용을 필요로한다. 공 초점 레이저 박리는 현지 세포 손상의 원인 및 펄스 레이저 소스를 필요로한다. 그것은 Nesprin-2G 장력 센서와 결합 될 것이었다 않는 자기 세포 골격을 통하여 핵막 상으로 전송 력 및 비틀림 계측법은, 특정 단백질에 힘을 측정 할 수 없다.
이 액틴 기반의 인장력이 Nesprin-2G의 LINC 복합체의 구성 요소로 전송되는 것을 입증되었지만, 인장 또는 압축력이 가해 얼마나 많은 알려지지 않았다다른 구조적 LINC 단백질 상 등 SUN-1 또는 SUN-2. 미래의 작업은 더 단백질 수준의 해상도 핵 역학을 규명하기 위해 이러한 추정로드 베어링 LINC 단백질로 FRET 힘 프로브를 복제로 이동합니다. 자신을 제시 또 다른 문제는 FRET의 변화는 긴장의 변화와 관련이없는 일이 아니라 Nesprin-2G의 올리고머 또는 Nesprin-2G의 구조적인 변화 중 하나 변화를 반영 할 수 있다는 것이다. 세포의 pH 변화는 형광 센서의 영향 및 FRET 측정을 변경할 수있다. (이 센서 관찰 FRET 변경 대부분 무관 한 힘이다된다) Nesprin-2G HL 센서는 이러한 변경의 일부에 대한 좋은 컨트롤을 나타내고, 분자 FRET 제어 구조 (아래 참조) 올리고머를 평가하기 위해 개발 될 수있다. 또한 nesprin 2G-TS의 발현 과발현 결과 CMV 프로모터에 의해 구동되고, 발현이 높은 잠재적 생물 아티팩트를 유도 할 수있다. C와 최근의 진보lustered 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR)는 상동 - 감독 수리를 위해 허용 한 (HDR)는 게놈 (21)에 큰 DNA 시퀀스를 삽입하는 접근한다. 이 접근법은 TSmod을 포함하는 내생 Nesprin-2G (또는 다른 단백질)를 수정하는 데 사용될 수 있습니다. 이것은 과발현 아티팩트에 대한 가능성을 줄이는 적당한 내생 프로모터를 사용하여 힘 센서의 발현을 제공 할 것이다.
TSmod 다른 탄성 FRET 프로브는 다음이 문서에서 설명 된 것과 유사한 프로토콜에 사용될 수있는 다른 단백질, 새로운 센서를 개발하기 위해 사용할 수있다. 새로운 힘 센서의 개발의 주요 관심사는 FRET 센서 내부 삽입 위치를 판정한다. 첫째, 삽입 위치는 기계적 하중을받는 단백질의 영역에 있어야한다. 이러한 영역은 골격 연결된 단백질, 단백질과 상호 작용하는 위치를 조사함으로써 식별 될 수있다. 둘째, 삽입대형의 (~ 50 kDa의) TSmod 단백질의 생물학적 기능이 연구되고 방해해서는 안된다. Nesprin-2G의 이전에 개발 된 "미니"형식에는 SUN 결합 KASH 도메인에 다리를 액틴 결합 CH 도메인이 제안, 상처 단일 층 11, 19 Nesprin-2G 핵 이동을위한 충분한 것으로 나타났다 그 것 가능성이없는 TSmod의 삽입 단백질 기능을 방해. 센서의 생물학적 기능의 확인은 (상기 힘 센서가 내인성 단백질 결핍 세포의 특정 함수를 구하기 위해 도시 될 수있는) 단백질 기능에 대한 기능 분석을 요구한다. 셋째, 단백질 올리고머 변화 강제 관계없는 FRET 변화 초래 단백질 사이의 FRET (라 분자간 FRET 22)를 변경할 수있다. 이것의주의 깊은 분석은 종종 특히 올리고머를보고 전문 분자 FRET 구조를 필요로한다.
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Acknowledgments
이 작품은 (DEC에) R35GM119617을 부여 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 Memoria (DEC에) 신뢰와 NIH에 의해 지원되었다. 공 초점 현미경 영상은 VCU 나노 물질 특성 코어 (NCC) 시설에서 수행되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
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