Introduction
Чувствительная к Силе, генетически кодируемые сенсоры FRET недавно появились в качестве важного инструмента для измерения растяжения на основе силы в живых клетках, обеспечивая понимание того , как механические силы прикладываются белки 1, 2, 3, 4. С помощью этих инструментов, исследователи могут неинвазивно изображения внутриклеточных сил в живых клетках с помощью обычных флуоресцентных микроскопов. Эти датчики состоят из FRET-пары (донорные и акцепторные флуоресцентных белков, наиболее часто синий донор и желтый акцептор) , разделенная упругого пептидом 3. В отличии от С- или N-концевого мечения, этот датчик вставлен во внутреннем сайт белка для измерения механической силы, передаваемой через белок, ведет себя как датчик молекулярной деформации. Повышение механических напряжений через результаты датчика к увеличению расстояния между FRET-рвоздух, что приводит к снижению FRET 3. В результате лада обратно пропорциональна растягивающей силы.
Эти флуоресцентные основой датчики были разработаны для координационных белков адгезии (винкулины 3 и талины 4), белков цитоскелета (α-актинин 5), и клетка-клетка соединительных белков (Е-кадгерин 6, 7, VE-кадгерин 8 и РЕСЫ 8). Наиболее часто используемый и хорошо характеризуются упругий линкер в этих биосенсорах известен как TSmod и состоит из повторяющихся последовательности из 40 аминокислот, (GPGGA) 8, который был получен из паука шелка белка жгутовидного. TSmod было показано, ведет себя как линейная упругую нано-пружину, с FRET отзывчивостью к 1 до 5 пН растягивающего усилия 3. Различные длины жгутовидного могут быть использованы для изменения динамического гАнж из TSmod FRET силы чувствительности 9. В дополнении к жгутовидному, спектрин повторяет 5 и виллина заставку пептид (известный как HP35) 4 были использован в качестве эластичных пептидов между FRET-паром в аналогичных силовых биосенсорах 4. Наконец, недавний отчет показал , что TSmod также может быть использована для обнаружения сжимающих сил 10.
Недавно мы разработали датчик силы для линкера-цитоскелета ядерно (ЛИНК) сложный белок Nesprin2G с помощью TSmod вставляется в ранее разработанном усеченный белок Nesprin2G известного как мини-Nesprin2G (рис 2С), которая ведет себя так же , как эндогенные Nesprin-2G 11. Комплекс ЛИНКА содержит множество белков, которые ведут от наружного к внутренней части ядра, связывая цитоплазматические цитосколют к ядерной пластинке. Nesprin-2G представляет собой структурный белок связывания с какактина цитоскелета в цитоплазме и SUN белки в перинуклеарном пространстве. Используя наш биосенсор, мы смогли показать , что Nesprin-2G подлежит актомиозиновую-зависимую напряженность в NIH3T3 фибробластах 2. Это был первый раз, когда сила измеряется непосредственно через белок в комплексе ядерного ЛИНКА, и это, вероятно, станет важным инструментом для понимания роли силы на ядре в mechanobiology.
Протокол ниже приводится подробная методикой, как использовать датчик силы Nesprin-2G, в том числе экспрессии датчика натяжения Nesprin (Nesprin-TS) в клетках млекопитающих, а также сбора и анализа FRET изображений клеток, экспрессирующих Nesprin- TS. Используя перевернутую конфокальной микроскопии, оснащенный детектором спектрального, описание того, как измерить сенсибилизированные излучение FRET с использованием спектральной расслоении и обеспечивается ратиометрический FRET изображений. Выходные логометрических изображения могут быть использованы для относительного кваntitative сила сравнения. Хотя этот протокол ориентирован на экспрессию Nesprin-TS в фибробластах, он легко адаптируется к другим клеткам млекопитающих, в том числе обеих клеточных линий и первичных клеток. Кроме того, этот протокол, как он относится к приобретению и анализу изображений FRET может быть легко адаптирован к другим силе биосенсоров на основе FRET, которые были разработаны для других белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение Nesprin-2G датчик ДНК и другие плазмидной ДНК
- Получение Nesprin-2G TS (датчик натяжения) контроля, Nesprin-2G HL (без головы), mTFP1, Венера, и TSmod из коммерческого источника. Размножьтесь все плазмиды ДНК и очистить их с использованием стандартных штаммов E.coli, такие как DH5-альфа, как описано ранее , 12, 13.
2. Клетки с трансфекции Nesprin-2G и других плазмидной ДНК
- Grow NIH 3Т3 фибробласты клетки 70-90% слияния в 6-луночный культуральный блюдо в стандартном инкубаторе для клеточных культур с температурой (37 ° C) и СО 2 (5%) регулирования. Для среды роста клеток, используют Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка.
- В капоте культуры клеток, удалить среды и промыть каждую лунку с приблизительно 1 мл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки. Добавьте 800 мкл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки в каждую лункуи поместить в камеру 6-а в инкубаторе.
- Пипетка 700 мкл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки в 1,5 мл пробирку с 35 мкл раствора липида-носителя, чтобы сформировать «lipomix». Смешать с помощью пипетки. Этикетка трубки с «L.»
- Собирают шесть 1,5 мл пробирки и маркировать их от 1 до 6. Pipette 100 мкл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки в каждую пробирку.
- Использование концентрации плазмидной ДНК из стадии 1, пипетки 2 мкг Nesprin 2G-TS в пробирки 1 и 2. пипеткой 2 мкг Nesprin-HL в пробирки 3 и 4. пипеткой 1 мкг mTFP в трубку 5. Pipette 1 мкг mVenus в трубу 6. не повторное использование пипеток при пипетке различных типов ДНК.
- Пипетка по 100 мкл lipomix от «L» трубки в каждую пробирку с маркировкой (1-6) и перемешать повторным пипетированием. Используйте чистую пипетку для каждой трубки. Инкубировать в течение 10-20 мин.
- Добавляют 200 мкл из каждой меченой трубки к скважине в 6-луночный камере с 70-90% сплошностиклетки. Добавьте в верхней части каждой скважины с соответствующей ДНК добавляли. Поместите камеру 6-а в инкубаторе в течение 4-6 ч.
- Аспирируйте среду и добавляют 1-2 мл среды клеток с пониженным содержанием сыворотки для полоскания. Аспирируйте среду клеток с пониженным содержанием сыворотки, добавляют 2 мл трипсина в каждую лунку, и поместите блюдо 6-а в инкубаторе (5-15 мин).
- В то время как клетки отделить в инкубаторе, пальто 6 стеклянным дном просмотра блюда слоем фибронектина при концентрации 20 мкг / мл, растворенного в фосфатно-солевом буфере (PBS). Разрешить посуду, чтобы покрыть поверхность в капоте культуры клеток (примерно 20 мин).
- Нейтрализовать трипсина путем добавления 2 мл DMEM, как только клетки отделяют.
- Передача содержимого каждой лунки с меченым центрифужной пробиркой 15 мл и спина вниз на 90 мкг в течение 5 мин в качающемся роторе центрифуге. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать каждый осадок клеток в 1000 мкл DMEM с помощью пипетки смешивания.
- Аспирируйте фибронектин смесь изстеклянной посуды и пипетки 1000 мкл каждой клеточной суспензии на стеклянной посуды.
- После того как клетки оседают на дно стеклянной посуды (~ 15 мин), добавляют еще 1 мл DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep в каждую лунку и место в инкубаторе клеток. Разрешить клетки приложить и выразить датчик в течение по крайней мере 18-24 часов.
Примечание: Клетки трансфицировали с использованием коммерческих катионных липидных трансфекций реагентов (см Таблицы материалов). В качестве альтернативы, стабильные клеточные линии могут быть выбраны с помощью плазмиды с геном , придающим устойчивость к токсину (плазмиды PcDNA для Nesprin-TS и -HL доступны на веб - сайте хранилища ДНК (см таблицу материалов) обеспечивают клетки , экспрессирующие генетицина сопротивление ). Кроме того, могут быть использованы вирусные инфекции (методы лентивирусов, ретровируса или аденовируса), чтобы выразить датчик в клетках, которые трудно для трансфекции. - В дополнение к Nesprin-TS, дополнительные трансфекции клеток с Nesprin HL нулевой дляКонтроль с, как описано в шагах 2.1-2.12; TSmod также может быть использована в качестве контроля нулевой силы и должна проявлять подобную FRET к Nesprin-HL.
- Трансфекции клеток с mTFP1 и Венерой генерировать спектральные отпечатки пальцев (этап 4).
Примечание: mTFP1 и венера, как правило, выражают на более высоких уровнях, чем Nesprin-TS, и, как таковые, более низкие количества ДНК, возможно, должны быть трансфицированы для достижения аналогичных уровней экспрессии.
3. Проверка эффективности трансфекции
- Примерно 18-24 ч после завершения трансфекции, использовать инвертированный флуоресцентный микроскоп для изучения эффективности трансфекции пути сравнения числа флуоресцирующих клеток к общему числу клеток в поле зрения (обычно 5-30%).
- С помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного частотой возбуждения вблизи 462 нм (mTFP1) или 525 нм (Венера) и фильтр излучения с центром около 492 нм (mTFP1) или 525 нм (Венера).
Примечание: В качестве альтернативы, GFP наборы фильтров захватит комбинацию mTFP1 и веNUS выбросы и позволят подтверждение эффективности трансфекции.
- С помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного частотой возбуждения вблизи 462 нм (mTFP1) или 525 нм (Венера) и фильтр излучения с центром около 492 нм (mTFP1) или 525 нм (Венера).
- Изображение живые клетки в течение 48 часов после трансфекции.
- В качестве альтернативы, зафиксировать клетки в 4% параформальдегид в PBS (с кальцием и магнием) в течение 5 мин, хранить в PBS, и вид через 48 часов 8.
Примечание: За 48 ч, качество и сила сигнала убывает. Фиксация клеток сохраняет свое состояние, в том числе FRET выражается 8; Однако, клетки должны быть отображены только в PBS, в качестве монтажной среды может повлиять на FRET 14. Фиксированные клетки можно сравнить только с другими фиксированными клетками, так как может быть изменение в экспрессии.
Внимание: параформальдегид является токсичным. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
- В качестве альтернативы, зафиксировать клетки в 4% параформальдегид в PBS (с кальцием и магнием) в течение 5 мин, хранить в PBS, и вид через 48 часов 8.
4. Захват Спектральный Отпечатки из mTFP1 и Венеры флуорофоров для спектрального расслоении
- В капоте культуры клеток, заменить среду клеток с mediu изображенийм (HEPES-буфер) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки.
- Поместите просмотр блюда в контролируемой температурой (37 ° C) конфокальной столик микроскопа.
- Поместите стекла обзора блюдо с mTFP1-трансфецированных клеток над целью масла при 60X увеличении с числовой апертурой 1,4.
Примечание: Масло используется на лазерном сканирующем микроскопе на объектив 60X, чтобы близко напоминают показатель преломления стеклянной подложки. Масло помещают поверх линзы объектива и приходит в непосредственный контакт с покровным стеклом. - Расположить mTFP1 клетки, экспрессирующие с источником возбуждения 458 нм и полосового фильтра излучения с центром при 500 нм.
- С флуоресцентной клетки в поле зрения, выбрать режим спектрального обнаружения ( «Lambda Mode» в программном обеспечении , используемом здесь) и захвата спектрального изображения (рис 3-1); включают в себя все частоты за пределами 458 нм с использованием шагом 10 нм (рис 3-3). Выберите яркий fluorescлор область (ROI), на мобильном (радиусе 20 пикселей).
Примечание: спектральная форма mTFP1-экспрессирующие ROI должен оставаться относительно постоянной по всей клетке. Если форма изменяется значительно, повторно отрегулировать лазер и получить параметры, чтобы улучшить отношение сигнал-шум. - Добавить флуоресцентный ROI значит, нормированная интенсивность спектральной базы данных, нажав кнопку «Сохранить спектры в базе данных.»
- Оптимизация мощности лазера и получить таким образом, что хорошее отношение сигнал-шум достигается. Настройки будут различаться для различного оборудования. Используя нефлуоресцентные, нетрансфицированные клетки в качестве фона ссылки, увеличивает усиление и мощность, пока клетки светлые, но не выходит за рамками динамического диапазона детектор (точка насыщения). Фоновые клетки не должны обнаруживаемая флуоресценция после усреднения.
- Повторите этот процесс для Венеры, трансформированные клеток со следующими исключениями:
- Убедитесь, что частота возбуждения при 515 нм, и что полосовой фильтр в.п.ntered вблизи 530 нм при определении местоположения венера-экспрессирующие клетки.
- В «Спектральный режиме» используют частоту возбуждения 515 нм вместо 458 нм.
5. Захват изображение Несмешанного
- Переключение в режим захвата на «Spectral расслоении.»
- Добавьте спектральные отпечатки Венеры и mTFP1 в расслоении каналов (рисунок 3, Arrow-2).
- Установите лазер возбуждения обратно в источник аргона в 458 нм.
- Поместите блюдо просмотра Nesprin-TS выше цели 60X нефти.
- После фокусировки на флуоресцентную клетку с достаточно ярким выражением, регулировки усиления и мощность лазера для оптимизации отношения сигнала-шум.
Примечание: Поскольку эффективность ладу Nesprin-TS находится вблизи 20%, несмешанная венера изображение должно быть существенно слабее, чем в несмешанном mTFP1 изображении. После того, как приемлемая мощность и коэффициент усиления настройка была определена итерационно, эти параметры должны оставаться постоянными для всех изображений CaptUred. - Захват минимум 15-20 изображений клеток Nesprin-TS с относительно аналогичной яркостью и избежать чрезмерного насыщения пикселя (все насыщенные пиксели удаляются во время обработки изображения).
- Повторите процесс захвата изображения с клетками HL-Nesprin с использованием одинаковых параметров обработки изображений.
Обработка изображений и 6. Соотношение анализа изображений
- Использование с открытым исходным кодом ImageJ (FIJI) программное обеспечение (http://fiji.sc/), открывать изображения родной формат с помощью BioFormats Reader.
- Предварительная обработка изображения и вычислить отношение изображений с использованием ранее установленных протоколов 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В результате вышеуказанного протокола, плазмидная ДНК была приобретена из хранилища ДНК и трансформировали в клетках E.coli. E.coli , экспрессирующий ДНК датчика были отобраны из LB / ампициллин и амплифицировал в жидкой LB - бульоне. После амплификации векторов, ДНК-плазмиды были очищены в буфере Трис-ЭДТА с использованием стандартной, коммерчески доступный набор для выделения ДНК. С помощью спектрофотометра, очищенные ДНК количественно в стандартную концентрацию мкг / мл (фиг.1О, дни 1-2).
Используя NIH3T3 фибробласты, клетки выращивали до 70-90% слияния в 6-луночные пластиковые клетки культуры блюдо. Для вставки плазмидной ДНК в клетки NIH3T3, липид-опосредованной трансфекция плазмиды проводила. Коммерчески доступный реагент трансфекции (см Таблицы материалов) был использован в качестве липидного сосуда для ДНК. Два повторностейдатчики Nesprin-TS и Nesprin-HL трансфицировали в 4 - клеточных скважин (рис 1В). При подготовке к визуализации FRET, одиночный флуорофор конструкты mTFP1 и Венере были трансфицированы в клетки NIH3T3 (Фигура 1В). После трансфекции клетку переносила в стеклянном дне просмотр блюда, совместимое с большим увеличением, инвертированными конфокальными микроскопами.
Прежде чем приступить к конфокальной микроскопии, простой перевернутый широкого поля флуоресцентный микроскоп был использован для проверки эффективности трансфекции. Использование цели 10X с числовой апертурой 0,25, много клеток в типичном виде поля из-Высказывалось Nesprin-TS (рисунок 2). Как правило, датчик локализованы вокруг ядерной оболочки, в соответствии с эндогенной локализацией Nesprin-2G 2. Датчик контроля нет силы, Nesprin-HL, а затем подобный паттерн экспрессии 2.
Наконец, спектрально разрешенные стеки изображений были импортированы в ImageJ с открытым исходным кодом для обработки. Изображения были предварительно обработаны, а соотношение изображения были вычислены с использованием установленных процедур 15.
Рисунок 1: Экспериментальное Время на основе блок - схемы. (A) Начиная с приобретенным Sensили плазмидная ДНК, векторы E.coli, трансформированные ДНК, выбраны, и амплифицируют (дни 1-2). Из концентрированного E.coli , LB бульоне, плазмидную ДНК выдел ют и количественно (3 -й день). С помощью очищенных плазмид ДНК, NIH3T3 фибробластов трансфицируют в формате шесть-луночного (B) и переносили на стеклянное дне блюда, которые совместимы с перевернутой конфокальной микроскопией (День 3). Чтобы проверить успешность трансфекции клетки рассматриваются под широкопольными флуоресцентного микроскопа, снабженного соответствующими наборами фильтров (День 4). Контингент после успешной трансфекции клетки изображаются на конфокальный микроскоп, снабженный спектральным детектором. Используя спектральное расслоение, каналы mTFP1 и Венеры разделены во время сбора и сохранены как спектрально разрешенные изображений стеки (4-5 дней). И, наконец, изображения препроцессора в ImageJ, а отношение-изображения вычисляются. Плеаза нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель изображения трансфицированных NIH3T3 фибробласты. (А) 10 - кратная трансфицированных фибробластов NIH3T3 , экспрессирующих Nesprin-TS с использованием GFP filterset. (Б) в разобранном виде прямоугольника из выражения часть A. Sensor следует за ядерной оболочки и часто простирается в цитоплазму. (C) Nesprin-TS и -HL управления и как они связываются с актином и SUN связывающих доменов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Spectral Отпечатки Учебник Использование конфокальной программного обеспечения. Спектры Нормированных выбросов получены из 20-пиксельных радиусов в выделенных областях интересов, очерченных цветными перекрестия. (Стрелка-1) Режим обнаружения Спектральный для захвата изображения. (Стрела-2) «Спектральное расслоение» настройка для добавления нормированных спектров к спектральной базе данных. (Стрелка-3) Частота возбуждения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Живое Спектральное расслоение и вывод конфокального программного обеспечения. (A) Критические параметры визуализации для воспроизведения живых, несмешанных изображений. (Стрелка-1) Частота возбуждения. (Стрелка-2) Живой режим спектрального расслоении. (Б) Ядра изображения в несмешанном канале Венеря. (
Рисунок 5: Nesprin-TS FRET соотношение изображение в узорчатом и без рисунка Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) клетки. MDCK клетка , которые стабильно экспрессируют Nesprin-TS были обследованы на 10 мкм ширина фибронектина линий (А) или без шаблона полидиметилсилоксана (PDMS) мембран (B). Ядерные мембраны были визуально маскируются и перерабатывают в соотношения FRET. Шкалы цвета представляет собой отношение амплитуд для FRET и без рисунка узорчатых ядер.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фигура 6: Обработанная Логометрический FRET Изображение из Nesprin-TS-экспрессирующие клетки и Гистограмма Анализ агрегированных данных. (А) представитель, нормализовали сложены гистограмма FRET соотношение изображений Nesprin-TS , обработанных ингибитором миозина ML7, цвет-закодированного на отдельных ядрах клеток. (Б) представитель, нормализовали сложены гистограмма FRET соотношение изображений Nesprin-TS , обработанных Calyculin А, активатор клеток сократимости. Легенда коррелирует каждое анализируемое ядро на его место на гистограмме. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способ и демонстрация клеток живого изображения от механического напряжения через Nesprin-2G, белок в комплексе ядерного ЛИНКА, были описаны выше. До этой работы, различные методы, такие как микропипетки аспирации, магнитно-бусинки цитометрии, и микроскопического лазерной абляции, были использованы , чтобы применить нагрузку на ядро клетки и измерить его свойства сыпучего материала 16, 17, 18. Однако до нашей недавней работы, никаких исследований не были непосредственно показано , что растягивающие силы передаются непосредственно на в комплексе белок ЛИНКА в живых клетках 2.
Ранее в нашей лаборатории показала , что модифицированная версия Nesprin2G, известный как мини-Nesprin2G, может быть сконструирована для экспрессии FRET-силового зонда , известный как TSmod (рис 2C) 2. TSmod Ранее было показано, динамически измерить прочность на разрыв дляКЕС в живых клетках и в различных несущих белках 3, 4, 6, 8. Кроме того , было показано , что мини-Nesprin-2G был неотличим от эндогенного Nesprin-2G по отношению к его локализации, известные эффекты на цитоскелете, и способности спасти ядерное позиционирование 11, 19. Использование белка мини - Nesprin-2G с TSmod (Nesprin-TS), было показано , что фибробласты NIH3T3 , экспрессирующие датчик имеет базовый уровень натяжения по отношению к Nesprin-HL, которые не могут связываться с актином 2. Кроме того, модуляция клеточной сократимости с использованием ингибиторов или активаторов миозина может быть обнаружена с помощью Nesprin-TS 2.
Есть целый ряд важных шагов в этом протоколе. Смешение Nesprin-TS с Nesprin-HL (ДНК или экспрессирующих клеток) не ReadiLY обнаруживается, так как и аналогичным образом локализовать на ядерной мембране, и приведет к неожиданным результатам. Так как Nesprin-HL является контроль не сила, измеренная FRET должна быть выше, чем Nesprin-TS в среднем. Для того, чтобы быть осторожными, секвенирование изолированных конструкции ДНК и тщательно маркировочная клетка рекомендуются. Во-вторых, важно тщательно оптимизировать коэффициент усиления детектора и мощности лазера на конфокальной микроскопии, чтобы улучшить отношение сигнал-шум и свести к минимуму обесцвечивание. Для того, чтобы правильно измерить FRET, эти параметры должны оставаться постоянными во время получения изображения. Кроме того, оптимизация коэффициент усиления детектора или мощность для тусклых или очень ярких, экспрессирующих клеток является оптимальным, так как медиана экспрессирующих клеток будут иметь тенденцию выпадать из динамического диапазона детектора. Некоторые клетки, которые выражают высокую концентрацию датчика, как правило, флуоресценцию в нуклеоплазме и эндоплазматической сети, что делает его трудно решить ядерную мембрану, которая, предположительно, более интересный регион с относительно FoRCE. Выбор ячеек с несколько более низким уровнем экспрессии, как правило, решить эту проблему локализации датчика.
В то время как ратиометрические спектральные изображения являются относительно простым и быстрым способом для измерения FRET, он не выводит единица эффективности FRET из - за акцептор сигнал отводимого через 20. Без единиц эффективности FRET, не представляется возможным преобразовать индекс соотношения FRET в мерном измерение силы. Из-за это ограничение, только относительные сравнения количественных сил могут быть сделаны. FRET эффективность может быть определена с помощью более сложных методов, таких как микроскопии флуоресцентно срока службы изображений (FLIM) или акцептора фотообесцвечивание. Абсолютная сила (на уровне Pn) может быть оценена по эффективности FRET, как описано ранее , 3, 8.
В отличии от предыдущих методов для измерения механических свойств ядра или смещения ядра на основе Oп приложенных извне сил, измерение FRET от Nesprin-TS имеет преимущество неинвазивно зондирующая напряженность на компоненте ядерной мембраны 16, 17, 18. Датчик выдает флуоресцентный сигнал, который коррелирует с нагрузкой на отдельные молекулы Nesprin-2G. В отличие от этого, микропипетка стремление требует использования тонких инструментов при работе с живыми клетками. Конфокальной лазерной абляции вызывает локальное повреждение клеток и требует импульсного лазерного источника. Магнитное скручивание цитометрии переводы сил на ядерную мембрану через цитоскелет и не может быть использовано для измерения силы на специфических белках, если это не должны было быть соединено с датчиком натяжения Nesprin-2G.
В то время как было показано, что актиновые на основе растягивающие силы передаются Nesprin-2G, компонент комплекса ЛИНК, остается неизвестным, сколько растяжение или сжимающие силы воздействуютна другие структурные белки ЛИНК, например ВС-1 или ВС-2. Дальнейшая работа будет направлена на клонирование FRET-зондов силы в эти предполагаемые несущем ЛИНКЕ белки для дальнейшего пояснения ядерной механики с разрешением белка уровня. Другой вопрос, что представляет собой то, что изменения в FRET могут быть связаны с изменением напряженности, а скорее отражают либо изменения в олигомеризации Nesprin-2G или конформационных изменений Nesprin-2G. Изменения клеточного рН может влиять на флуоресценцию датчика и изменения измеренного FRET. Датчик Nesprin-2G HL представляет собой хороший контроль за некоторые из этих изменений (так как изменения, наблюдаемые FRET с этим датчиком, скорее всего, не связаны с силой) и межмолекулярные управляющие конструкции FRET, могут быть разработаны для оценки олигомеризации (смотри ниже). Кроме того, экспрессия nesprin-2G TS приводится в движение с помощью CMV-промотора, что приводит к избыточной экспрессии, и этот высокий уровень экспрессии может потенциально вызвать биологические артефакты. Последние достижения с сlustered регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) позволили гомологии направленного ремонта (HDR) подходит для вставки больших последовательностей ДНК в геном 21. Такой подход может быть использован для модификации эндогенного Nesprin-2G (или других белков), чтобы включать в себя TSmod. Это позволило бы обеспечить экспрессию датчика силы с использованием соответствующего эндогенного промотора, уменьшая потенциал для избыточной экспрессии артефактов.
TSmod и другие эластичный FRET зонды также могут быть использованы для разработки новых датчиков для других белков, которые затем могут быть использованы в том же протоколе, как описано в этой статье. Одной из основных проблем с развитием любого нового датчика силы является определение внутреннего сайта вставки для датчика FRET. Во-первых, участок вставки должен быть в области белка подвергается механической нагрузке. Эти участки могут быть идентифицированы путем анализа, где цитоскелет соединенных белки взаимодействуют с белком. Во-вторых, введениеиз большой (~ 50 кДа) TSmod не должны нарушать биологическую функцию белка изучается. Ранее разработанная «мини» форма Nesprin-2G показала , что актин-связывающего CH домены мостика к ВС-связывающему домену KASH были достаточными для Nesprin-2G ядерного движения в раненых монослоев 11, 19, предполагая , что введение TSmod бы не вероятно , нарушить функцию белка. Подтверждение биологической функции датчика требует функционального анализа для функции белка (в которой датчик силы можно показать, чтобы спасти определенную функцию в клетках истощенных эндогенного белка). В- третьих, изменения в белковой олигомеризации может изменить FRET между белками (называется межмолекулярного FRET 22), что привело бы к изменению FRET, которые не связаны с силой. Тщательный анализ этого часто требует специальных межмолекулярного FRET конструкции, в частности, сообщают олигомеризации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Томасом Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Memoria Trust (к DEC) и NIH грант R35GM119617 (для DEC). Конфокальный микроскоп визуализация была выполнена в VCU наноматериалы Характеристика Ядро (НКК) фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
