Abstract
سرطان الثدي هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان بين النساء في جميع أنحاء العالم. وتشارك الانبثاث في كبد تصل إلى أكثر من 30٪ من الحالات مع الانبثاث سرطان الثدي، ويؤدي إلى نتائج سيئة مع معدلات البقاء على قيد الحياة وسيطة من 4.8 - 15 شهرا. نماذج القوارض الحالية الانبثاث سرطان الثدي، بما في ذلك طعم أجنبي خلية الورم الرئيسي ونماذج ورم عفوية، نادرا ما metastasize إلى الكبد. داخل القلب ونماذج حقن داخل الطحال لا يؤدي في الانبثاث الكبد، ولكن هذه النماذج يمكن أن تتغير نتيجة ما يصاحب ذلك الموقع الثانوي ورم خبيث، أو حصانة للخطر بسبب إزالة الطحال لتجنب نمو الورم في موقع الحقن. لمعالجة الحاجة إلى تحسين نماذج ورم خبيث في الكبد، وهو الوريد البابي الفئران طريقة الحقن من شأنها أن توفر الخلايا السرطانية أولا وبشكل مباشر لوضعت الكبد. هذا النموذج يسلم الخلايا السرطانية في الكبد بدون مضاعفات الانبثاث المتزامنة في الأجهزة أو إزالة الطحال أخرى. الأراضي الفلسطينية المحتلةتوظف imized بروتوكول الوريد البابي حقن كميات صغيرة من 5-10 ميكرولتر، ≥ 32 الإبر قياس، والشاش مرقئ في موقع الحقن للسيطرة على فقدان الدم. النهج البوابة حقن الوريد في BALB / ج إناث الفئران باستخدام ثلاثة خطوط ورم الثدي مسانج متفاوتة تم اختبار إمكانية النقيلي. خلايا عالية النقيلي 4T1، خلايا D2A1 المعتدلة النقيلي، والخلايا D2.OR المنخفضة للالنقيلي. تركيزات ≤ النتائج 10000 خلية / حقن في كمون ~ 20 - 40 يوما لتطوير الانبثاث الكبد مع ارتفاع النقيلي 4T1 وD2A1 خطوط، و> 55 يوما للخط D2.OR أقل عدوانية. ويمثل هذا النموذج أداة هامة لدراسة سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد، ويمكن أن تنطبق على أنواع أخرى من السرطان أن metastasize في كثير من الأحيان إلى الكبد بما في ذلك القولون والمستقيم وسرطانات الغدد البنكرياس.
Introduction
سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد
الكبد هو موقع مشترك للالانبثاث سرطان الثدي، جنبا إلى جنب مع العظام والرئة 1-3. ورم خبيث في الكبد في المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي هو عامل النذير مستقل لنتائج سيئة للغاية 4،5، والبقاء على قيد الحياة وسيطة من مرضى سرطان الثدي مع نطاقات ورم خبيث في الكبد 4،8 حتي 15 شهرا 6-9. في المقابل، مرضى سرطان الثدي مع الرئة أو ورم خبيث العظام لديها معدلات البقاء على قيد الحياة وسيطة من 9 حتي 27،4 أشهر 8،9 و 16،3 حتي 56 شهرا 8،10-12، على التوالي. الانبثاث هي عملية متعددة الخطوات، ويشار إلى أن سلسلة النقيلي، والتي تبدأ مع نشر الخلايا السرطانية في الورم الرئيسي وينتهي فيات المرضى بسبب البذر وثمرة تعميم الخلايا السرطانية داخل الجهاز البعيد 13-15. وقد كشفت نماذج القوارض من ورم خبيث أن تتالي النقيلي غير فعالة بشكل ملحوظ، مع فقط 0.02 -٪ 10تعميم الخلايا السرطانية إنشاء الانبثاث العلني 16،17. وأملت واحد عنق الزجاجة الرئيسي لعدم الكفاءة المنتشر من قبل microenvironments الأنسجة فريدة في المواقع الثانوية، ودعا منافذ النقيلي 18، وتسليط الضوء على أهمية فهم ورم خبيث في مواقع محددة. مكانة المنتشر هي فريدة من نوعها لموقع تكرار، و، في جزء منه، تتميز ترسب متميزة البروتينات المصفوفة خارج الخلية 19،20، تسلل مختلف السكان الخلايا المناعية 21-23، وتوازن الأنسجة تغير بما في ذلك الإنتاج dysregulated العديد من السيتوكينات، كيموكينات، وعوامل النمو 15،18،24،25. وبالتالي، فهم من الأنسجة المتخصصة النقيلي محددة تسبق فهم كيفية استهداف المرض المنتشر. ومع ذلك، ونماذج قوية من ورم خبيث في الكبد ونقص. وعلاوة على ذلك، فإن نماذج محسنة من ورم خبيث في الكبد سيكون ضروريا لتحديد أهداف جديدة وعلاجات فعالة لمرضى سرطان الثدي وايالانبثاث الكبد عشر.
أنشئت نماذج لدراسة سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد
حاليا النماذج المتاحة لدراسة سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد تشمل xenografts الخلايا السرطانية البشرية في مأمن خطر الفئران. هذه النماذج عادة ما تستخدم مدروسة خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية مثل MCF-7 و MDA-MB-231 و عاري، Rag1 - / -، أو في مأمن SCID خطر المضيفين الفئران 26-29. نماذج طعم أجنبي توفر ميزة تنطوي على خطوط الخلايا السرطانية البشرية المشتقة منها، ومع ذلك، وبالنظر إلى الارتفاع الأخير للخلايا المناعية في الانبثاث 30-32 وفي المقاومة العلاجية 33-35، ودراسة ورم خبيث في مجموعة مختصة المناعة بشكل كامل أمر بالغ الأهمية. وتشمل نماذج لدراسة سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد في المضيفين المختصة المناعة حقن مثلي من خلايا الورم مسانج (على سبيل المثال، 4T1 وخطوط الخلايا D2A1) في لوحة الدهون الثديية، مع أو بدون جراحةاستئصال الورم الرئيسي، وتقييم لاحق من ورم خبيث 36-38. وتجدر الإشارة، فإن معدل ورم خبيث في الكبد من نماذج زرع مثلي منخفضة جدا أو معدومة مقارنة بالمواقع النقيلي أخرى مثل الرئة 39،40، أو يحدث بعد إنشاء ورم خبيث في الرئة، مما يعقد دراسة الكبد محدد ورم خبيث 37،39 .
إإكسبلنتس ورم من نماذج سرطان الثدي عفوية وراثيا يمكن إعادة حقن في منصات الدهون الثديية الجنود السذاجة كما الخلايا السرطانية مسانج. على سبيل المثال، أفيد مؤخرا أن الأورام عفوية من K14 لجنة المساواة العرقية ECAD و / و P53 و / الفئران F، النموذج الذي الغازية سرطان الثدي مفصص، وتطوير الأورام عند حقنه orthotopically إلى المضيفين wildtype. بعد استئصال الجراحي لهذه الأورام بمجرد وصولها إلى 15 مم 2، 18٪ من الفئران تقدمت إلى ورم خبيث في الكبد 40،41. وثمة نهج ثالث لنموذج متنفع ورم خبيث في الكبدالانبثاث عفوية في فئران معدلة وراثيا. حتى الآن، تقارير من نماذج الفئران عفوية من سرطان خبيث الثدي التي تنتشر بسهولة إلى الكبد ليست شائعة. وتشمل الاستثناءات H19-IGF2، والبروتين p53 FP / FP-MMTV لجنة المساواة العرقية الواب لجنة المساواة العرقية، وK14 لجنة المساواة العرقية ECAD و / و P53 و / و نماذج الماوس المعدلة وراثيا، حيث يتطور الانبثاث في كبد نسبة منخفضة من الفئران 38،41- 43. وهكذا، في حين تسهل نماذج الماوس المعدلة وراثيا دراسة جميع مراحل سلسلة النقيلي، وتوفير نماذج قوية وذات الصلة سريريا، فهي محدودة بسبب انخفاض معدلات ورم خبيث في الكبد 38.
عدة نماذج ورم خبيث تجاوز الخطوات الأولى من سلسلة النقيلي بما في ذلك نشر الخلايا السرطانية من الورم الرئيسي ودخول الوعاء. تسمح هذه النماذج التحقيق في خطوات لاحقة من تتالي النقيلي، من التسرب إلى إنشاء الأورام في مواقع الثانوية. كثافة العملياتracardiac نموذج حقن يسلم الخلايا السرطانية في البطين الأيسر، التي توزع الخلايا السرطانية في الدورة الدموية عن طريق الشريان الأورطي. حقن داخل القلب يتطلب الموجات فوق الصوتية الموجهة التصوير من موقع الحقن أو طرائق التصوير الأخرى مثل تلألؤ بيولوجي من وسيفيراز الموسومة خلايا لتأكيد نجاح الحقن. ورم حقن الخلايا عن طريق البطين الأيسر قد يؤدي في العظام والمخ والرئة، و / أو ورم خبيث في الكبد، من بين غيرها من الأجهزة 44-48. بسبب الانبثاث الأعضاء المتعددة، تحتاج هذه الفئران في كثير من الأحيان إلى أن يتم التخلص قبل تطور ورم خبيث في الكبد العلني، يلغي القدرة على تحقيق كامل النمو المنتشر داخل الكبد. نهج بديل أن يقلل إلى حد كبير من نمو الانبثاث في مواقع متعددة هو نموذج حقن داخل الطحال. حقن داخل الطحال يسلم الخلايا السرطانية عن طريق الوريد الطحال أن تنضم إلى الوريد المساريقي العلوي ليصبح الوريد البابي 49،50. يمكن رصد الحيوانات لoutgrowth الآفات المنتشر في الكبد لتشكيل الانبثاث في مواقع أخرى أمر نادر الحدوث، ونتيجة لذلك، يتم الحفاظ على الصحة العامة للحيوان 49،50. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن هذا النموذج داخل الطحال يتطلب استئصال الطحال لتجنب أورام الطحال 49،50، وهو الإجراء الذي آثار الوظيفة المناعية. على سبيل المثال، تتميز عضلة القلب إصابة نقص التروية ضخه نتيجة لتسلل مجموعات فرعية الوحيدات Ly6C + التي تنشأ من الطحال وهي المسؤولة عن أكلة والنشاط بروتين أثناء التئام الجروح بعد نقص التروية 51،52. مع استئصال الطحال، هناك انخفاض الملحوظ في أعداد الوحيدات التي تساعد في التئام الجروح 52. وعلاوة على ذلك، وقد تبين استئصال الطحال للحد من نمو الورم الرئيسي والانبثاث الرئة في نموذج سرطان غير زنزانة صغيرة في الرئة، وتحديدا من خلال تخفيض في عدد من تعميم وداخل الورم CCR2 + CD11b + Ly6C + myelo الوحيداتخلايا معرف 53. بالإضافة إلى ذلك، أدى استئصال الطحال بعد الحقن داخل الطحال خلايا سرطان القولون في انخفاض مستويات المضادة للورم الخلايا القاتلة الطبيعية في العقد الليمفاوية المساريقي وارتفاع ورم خبيث في الكبد 54. وباختصار، تشير هذه النتائج إلى أن استئصال الطحال يقوض دور الجهاز المناعي مع العواقب اللاحقة لمصير خلية النقيلي.
الوريد البابي نموذج حقن الكبد الانبثاث
للتحقيق في سرطان الثدي ورم خبيث في الكبد في مجموعة مختصة المناعة بشكل كامل، في ظل ظروف حيث لا خطر الفئران بسبب الانبثاث الأعضاء المتعددة، وقد تم تطوير نموذج حقن الوريد البابي. وقد استخدمت نماذج حقن Intraportal سابقا لدراسة ورم خبيث في الكبد من القولون والمستقيم 55،56 وسرطان الجلد 16 خطوط الخلايا. ونحن هنا وصف تطبيق حقن intraportal لنموذج مسانج الثدي ورم خبيث الخلايا السرطانية. هذا النموذج يمكن استخدامها لدراسةفي مراحل لاحقة من تتالي النقيلي بما في ذلك سرطان الثدي تسرب الخلايا والبذر، ورم القرارات مصير الخلية بشأن وفاة / انتشار / السكون، وثمرة في الآفات العلنية. في هذا النموذج، يتم حقن مسانج خطوط الخلايا السرطانية الثديية عبر الوريد البابي من المناعة أنثى الفئران BALB / ج المختصة، وهي طريقة من شأنها أن توفر الخلايا السرطانية أولا ومباشرة إلى الكبد دون إزالة الطحال. لتطوير هذا النموذج، واستخدام أربعة خطوط الخلايا السرطانية الثديية التي تتراوح في قدرتها النقيلي من الأعلى إلى الأقل كانوا يعملون: D2.OR، D2A1، و4T1، وقد استخدمت D2A1 ذات الكلمات الدلالية مع الأخضر بروتين فلوري (D2A1-GFP) ل التحقيق في وقت مبكر وقت نقاط بعد حقن الخلايا السرطانية. 4T1 هو خط خلية المنتشر عالية مستمدة من ورم 410.4 التي نشأت عفويا في MMTV + BALB / ج الإناث الماوس 36،37 ومستطير إلى الرئتين والكبد والدماغ والعظام من الثدي وسادة دهنية الأورام الأولية 39،57،58. الخلايا السرطانية D2A1 وره أيضا مستمدة في الأصل من ورم الثدي عفوية تنشأ في BALB / ج المضيف بعد زرع الخلايا D2 العقيدات السنخية المفرطة التصنع، وأكد أن النقيلي من الورم الأساسي إلى الرئة 59،60. الخلايا السرطانية D2.OR هي خط أخت غير المنتشر إلى خط D2A1 و، على الرغم من أنها الهروب من الورم الرئيسي والتوصل إلى المواقع الثانوية، فإنها نادرا إنشاء الانبثاث بعيدة 60،61.
بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم تجنب استخدام العقاقير إدارة الألم استخداما بما في ذلك العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (المسكنات) أثناء أو بعد العملية الجراحية. المسكنات لها النشاط المضادة للورم في بعض سرطانات الثدي 62-65، وبعض الفئات من المسكنات تزيد من خطر تسمم الكبد 66،67، يحتمل المساومة على دراسة ورم خبيث في الكبد ومكانة النقيلي الكبد. وعلاوة على ذلك، تشير الدراسات إلى أن المسكنات تؤثر تأثيرا مباشرا على المكروية الأنسجة، والحد من تحويلة الموالية للالنقيليالبروتينات مصفوفة racellular tenascin-C 68 و ييفي الكولاجين 62،65. بدلا من ذلك، استخدام أحد مشتقات المواد الأفيونية، البوبرينورفين، تم استخدامها بسبب فعاليته في إدارة الألم القوارض 69، ونظرا لعدم وجود دليل على أن المواد الأفيونية لها نشاط مضاد للورم 70. تم تحسين هذا النموذج حقن الوريد البابي لحقن كميات صغيرة من 5-10 ميكرولتر لتجنب أضرار لا داعي لها للكبد. وكان محسن نموذج أيضا لتشمل الإبر مع قطر أصغر (≥ 32 مقياس) واستخدام الشاش لوقف نزيف الدم مباشرة بعد الحقن لتقليل فقدان الدم أثناء العملية. وعلى النقيض من هذه المعلمات حقن الأمثل، ينبغي تحديد أرقام الخلية على أساس فردي، استنادا إلى إمكانية مكون للأورام من خط الخلية. ومع ذلك، ابتداء من الساعة ≤ 10000 خلية / حقن للدراسات طويلة الأجل الموصى بها. بالنسبة لنهايات أقصر (على سبيل المثال، 24 ساعة بعد الحقن) أكبر بكثير من الخلايا السرطانية (على سبيل المثال،1 × 05-01 أكتوبر × 10 6) يمكن استخدامها إذا اقتضى الأمر. وباختصار، فإن نموذج حقن الوريد البابي مفصلة هنا يمثل أداة مفيدة لدراسة الانبثاث سرطان الثدي إلى الكبد وتلتف على عدد من أوجه القصور في نماذج ورم خبيث في الكبد الأخرى. يسهل هذا النموذج دراسة تسرب الخلايا السرطانية وزرع البذور، والقرارات مصير الأولى من البقاء على قيد الحياة، وانتشار، والسكون، وثمرة المنتشر في المضيفين الفئران المختصة المناعي.
Protocol
تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية في هذه المادة والموافقة عليها من قبل ولاية أوريغون للصحة والعلوم المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
1. إعداد منطقة الجراحية والأدوات
- إعداد مقص، ملقط، ومرقئ قبل التعقيم في 124 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 1-2 أيام قبل العمليات الجراحية المخطط لها. ضمان الحصول على الفراش تعقيمها أو معقمة، أقفاص، والمواد الغذائية للانتعاش بعد الجراحة.
- إعداد المنطقة الجراحية العقيم، ويفضل أن يكون في غطاء تدفق الصفحي.
- مسح أسفل جميع الأسطح من منطقة العمليات الجراحية مع التبييض 10٪، بما في ذلك لوحة التدفئة، مصدر الضوء، وأنابيب التخدير ومخروط الأنف، وأي جزء آخر من جناح الجراحة التي ستكون على مقربة من إجراء العمليات الجراحية في حين يتم تنفيذ ذلك .
- في منطقة العمليات الجراحية العقيم، ضع وسادة التدفئة تنظيفها مع ثنى العقيمة، مصدر الضوء، وأنابيب التخدير والرؤوس، المحاقن الأنسولين، 1 مل الحقن، بوبيفكين، والدموع الاصطناعية، ملحي معقم، 2 × 2 "الإسفنج شاش معقم، 4 × 4" شاش معقم، لوقف نزيف الدم قطع الشاش إلى 0،5-1 سم 2 قطعة، مقص، ملقط، مرقئ، 4-0 خيوط vicryl مع إبرة تفتق، و 50 مل 2٪ الكلورهيكسيدين جلوكونات في وعاء تعقيمها.
- تأكد من وجود غرفة في هذا الفضاء لخلايا الورم مستعدة المخزنة على الجليد.
- على مقاعد البدلاء المتاخمة لمنطقة العمليات الجراحية، وإعداد منطقة الانتعاش مع وسادة التدفئة الثانية وأقفاص نظيفة مع الفراش العقيمة.
ملاحظة: هذه المنطقة ويمكن أيضا البنود المنزل مثل حبة تعقيم.
2. الوريد البابي حقن
- ساعة واحدة قبل الحقن المخطط لها، علاج BALB / ج إناث الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 8-15 أسابيع مع 100 ميكرولتر من 0.015 ملغ / مل البوبرينورفين، تحت الجلد، لإدارة الألم.
ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول الحقن لأي سلالة من فئران أو الذكور في أي عمر، وذلك باستخدام المناسبخطوط الخلايا لإجراء تغييرات في السلالة. - إعداد الخلايا السرطانية للحقن على أساس بروتوكولات للخط الخلوي أو الورم يزدرع في الاختيار. اختبار جميع خطوط الخلايا السرطانية قبل الإدارة لوجود مسببات الأمراض الفئران للحد من مخاطر إدخال مثل هذه الكائنات الممرضة في مستعمرة الحيوانات.
- لBALB / ج خطوط الخلايا السرطانية مسانج بما في ذلك D2A1، D2.OR، والخلايا السرطانية 4T1 الخلايا ذوبان الجليد الى 10 سم لوحة زراعة الأنسجة قبل 3 أيام من الحقن مثل أن الخلايا اليوم التالي وصلت ~ 90 - 100٪ confluency.
- 1 يوم الخلايا غسل الخلايا السرطانية بعد ذوبان الجليد مرة واحدة مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ويعرض للتريبسين الخلايا متموجة الورم باستخدام 2 مل من التربسين 0.05٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 8 مل من وسائل الإعلام كاملة (DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مم L-الجلوتامين، و1X البنسلين / الستربتومايسين) ومرور 01:10 في صحن 10 سم جديدة مع 10 مل من وسائل الإعلام كاملة.
- في يوم من الحقن، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X ورrypsinize كما هو موضح أعلاه.
- و resuspend الخلايا trypsinized في 8 مل من وسائل الإعلام كاملة، وتدور لمدة 5 دقائق في 1500 x ج، وإزالة وسائل الإعلام وresuspend في 5 مل برنامج تلفزيوني 1X.
- عد الخلايا على عدادة الكريات باستخدام الأزرق الاستبعاد التريبان لتقييم جدوى. و resuspend الخلايا للحقن في برنامج تلفزيوني 1X بتركيز محدد مسبقا والحجم.
ملاحظة: 5 - يوصى 10 ميكرولتر كما تمنع حقن كميات صغيرة الأضرار غير الضرورية إلى الكبد. - حفاظ على الخلايا على الجليد لمدة الحقن. بعد الانتهاء من الحقن، والعودة عينة من الخلايا إلى المختبرات ووضع في ثقافة في وسائل الإعلام كاملة لمدة 1 يوم لضمان قدرتها على البقاء.
- ضع الماوس تحت التخدير مع 2-2،5٪ الأيزوفلورين (2-كلورو-2- (difluoromethoxy) -1،1،1-trifluoro-الإيثان) تسليم في الأكسجين. الحفاظ على درجة حرارة الجسم باستخدام لوحة التدفئة. ضمان التخدير الكامل من خلال تقييم لرد فعل لقرصة أخمص القدمين، ومن ثم الحفاظ على anestheسيا 2 - 2.5٪ الأيزوفلورين.
ملاحظة: من المهم لمراقبة الحيوانات معدل التنفس وضبط معدل تدفق الأيزوفلورين وفقا لذلك في جميع أنحاء الداخلي. - ضع كمية صغيرة من الدموع الاصطناعية أو مرهم التعليم والتدريب المهني على كل عين لتجنب جفاف المفرط للعيون خلال العملية الجراحية.
- ضع الماوس في موقف ضعيف، على ظهرها مع البطن عرضة للخطر.
- إزالة الشعر على الجانب الأيسر البطني من القوارض من مساحة الضلع الثاني وصولا الى 4 تشرين الأربية الحلمة الغدة الثديية بمسح المنطقة مع مزيل الشعر الكيميائية. السماح لمزيل الشعر على الجلوس لمدة 1-2 دقيقة ثم إزالة تماما مع الشاش وH 2 O. ويمكن القيام بذلك خطوة 1-2 أيام مقدما لتوفير الوقت إذا تم التخطيط العديد من العمليات الجراحية.
- تأخذ واحدة 2 × 2 "الإسفنج شاش معقم (غارقة في 2٪ الكلورهيكسيدين) ومسح أسفل الماوس في الموقع لإزالة الشعر. تعقيم المنطقة المحيطة برمتها، بما في ذلك الذيل، للحد تابع البكتيريةأمينة من الصكوك.
- مسح الموقع لإزالة الشعر والمنطقة المحيطة بها إلى أسفل مع وسادة الكحول الإعدادية.
- كرر 2٪ الكلورهيكسيدين والخطوات الكحول مرة أخرى والانتهاء مع الكلورهيكسيدين النهائي يمسح أسفل ليصبح المجموع ثلاثة الكلورهيكسيدين 2٪ واثنين من يغسل الكحول وسادة الإعدادية. هل الكلورهيكسيدين النهائي يمسح هذا أن هذه المادة الكيميائية لا يقطر حول موقع الجراحية لتجنب الحصول على الكلورهيكسيدين على الأعضاء الداخلية. ملاحظة: تطبيق كميات كبيرة من الكلورهيكسيدين والكحول على الجلد والفراء المحيطة بها قد يؤدي إلى انخفاض كبير في درجة حرارة الجسم. لا تمسح مع حجم الفائض خلال الخطوات 2،7-2،9. الحفاظ على درجة حرارة الجسم مع وسادة التدفئة.
- استخدام قفازات معقمة ومشرط معقم مع شفرة معقمة، وجعل واحد 1 بوصة شق في الجلد بين الطائرات المتوسطة والسهمي على الجانب الأيسر من الفأرة، بدأت للتو تحت الأضلاع وتنتهي فقط فوق الطائرة من الاربية الرابع الثديية غدة حلمة.
- باستخدام مقص وملقط تعقيمها أو حبة تعقيم، وجعل مماثل 1 بوصة شق في الغشاء البريتوني. تجنب قطع في لوحة الدهون الثديية وضمان عدم قطع الأمعاء والكبد، أو الحجاب الحاجز.
- وضع 4 × 4 "الشاش غارقة في المياه المالحة عقيمة على الجانب الأيسر من الفأرة، حيث تم شق، مثل أن الأعضاء الداخلية يمكن وضعها على الشاش ولا تتلامس مع الجلد المحيطة أو منطقة العمليات الجراحية.
- إعداد الخلايا السرطانية من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات كما الخلايا السرطانية سوف يستقر خلال إعداد الماوس. إعداد 25 ميكرولتر القابلة للإزالة إبرة حقنة وإبرة 32 عيار مع الخلايا السرطانية. دفع على حقنة حتى الخلايا السرطانية هي في رأس الإبرة والمكبس هو في حجم مناسب للحقن. تجنب حقن فقاعات الهواء.
- مسح خارج إبرة مع لوحة الكحول معقمة لإزالة أي خلايا الورم الخارجية. توخي الحذر لتجنب وخز الإبر.
- عقد سيد متوسط(ه) من شق، بما في ذلك الجلد وبطانة البريتوني، جانبا مع ملقط واستخدام ممسحة قطنية معقمة لسحب بعناية الأمعاء الكبيرة والصغيرة خارج، وضعها على شاش معقم غارقة في المياه المالحة عقيمة. سحب الأمعاء الكبيرة والصغيرة حتى يتم تصور الوريد البابي.
- تغطية الأعضاء الداخلية في المياه المالحة غارقة الشاش للحفاظ على الرطوبة الداخلية والعقم.
- هل لديك مساعد، وارتداء القفازات المعقمة أيضا، عقد الأمعاء ملفوفة في المياه المالحة غارقة الشاش بلطف للخروج من الطريق مع القطن المعقم يميل مسحة للكشف تماما الوريد البابي. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الضروري استخدام مرقئ تعقيمها أو ملقط لعقد الأنسجة جانبا على الجانب متوسط شق.
- ادخال الإبرة محملة ورم الخلايا ~ 3-5 ملم في الوريد البابي ~ 10 مم أسفل الكبد في زاوية <5 درجات إلى الوريد، مع شطبة مواجهة. حقن ببطء حجم كامل يحتوي على الخلايا السرطانية. تسمح للدم بالتدفق الماضي الإبرة حهيئة البيئة لعدة ثوان لتجنب العودة تدفق الخلايا السرطانية من الوريد. تقليل تحريك الإبرة في الوريد خلال الحقن. مرة أخرى، يجب توخي الحذر لتجنب وخز الإبر.
يتم التصور من الوريد البابي بدون تكبير، ولكن المجهر ستيريو يمكن أن تستخدم إذا كان يفضل: ملاحظة. - إزالة الإبرة في حين وضع في وقت واحد العقيمة قضيب من القطن طرف على المنوال مع الضغط. مع مساعد زالت تحتجز الأمعاء جانبا وضع قطعة واحدة من 0،5-1 سم 2 مرقئ الشاش على مكان الحقن في الوريد.
ملاحظة: مسحوق مرقئ تمت محاولة أيضا لهذه الخطوة في البروتوكول ولكن لم يكن فعالا في وقف فقدان الدم الوريدي بعد الحقن. - عقد الشاش لوقف نزيف الدم في موقع الحقن مع الضغط من المعقم قضيب من القطن طرف لمدة 5 دقائق.
- تقييم إغلاق الوريد عن طريق رفع بعناية الشاش لوقف نزيف الدم، وإذا كانت العصي الشاش إلى الأنسجة المحيطة، وكمية صغيرة من STERILالبريد المالحة يمكن استخدامها لامتصاص ورفع الشاش.
- إذا كان يحدث فقدان الدم في هذا الوقت، ضع قطعة إضافية من الشاش لوقف نزيف الدم في الموقع مع الضغط لمدة 5 دقائق إضافية. عندما تدفق الدم قد توقفت تماما، وإزالة الشاش من الماوس.
ملاحظة: فقدان الدم أثناء العملية الجراحية يجب تقييمها بعناية، وإذا تم استيفاء مجموعه يسمح حجم خسارة الدم أو تجاوز (على أساس إجراءات التشغيل القياسية التنظيمية لمجالس المراجعة المؤسسية المحقق) يجب أن يتم التخلص الماوس أثناء تحت التخدير عن طريق نضح القلب. - مرة واحدة يعتبر موقع الحقن سليمة، مع عدم وجود الدم مغادرة موقع الحقن، ووضع الأعضاء الداخلية بلطف مرة أخرى إلى تجويف البطن.
- خياطة بطانة البريتوني ثم الجلد العقيمة مع خياطة 4-0 vicryl وإبرة تفتق باستخدام المستمر أو المتقطع نمط خياطة بسيطة. عادة، وإغلاق شق يتطلب 10-15 الغرز.
- ضخ 100 ميكرولتر من bupivacaine (5 ملغ / مل) على موقع شق لإدارة الألم المحلية باستخدام حقنة الأنسولين. ضخ 0.5 مل من تحت الجلد ملحي معقم باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة عيار 26 لترطيب. عملية جراحية تستغرق 15-25 دقيقة لإكمال.
- للحفاظ على ظروف معقمة طوال الجراحة، والتأكد من أن جميع الأدوات والمواد القادمة في اتصال مع الماوس، بما في ذلك اليدين القفاز، يتم تنظيفها بطريقة مناسبة قبل الاتصال. حيث احتمال استخدام المواد وقفازات معقمة، أو الحد الأدنى من الاستفادة من حل الإيثانول 70٪ أو 10٪ من محلول التبييض لتنظيف.
- إذا تم التخطيط لجراحات متعددة لدورة واحدة إعادة تشكيل المنطقة الجراحية الأولية مع ثنى جديدة معقمة، والمحاقن الأنسولين، 1 مل الحقن، ملحي معقم، "الإسفنج شاش معقم، 4 × 4" 2 × 2 شاش معقم، وقطع الشاش لوقف نزيف الدم إلى 0.5 - 1 سم 2 قطعة، 4-0 خيوط vicryl مع إبرة تفتق، و 2٪ الكلورهيكسيدين. حبة تعقيم مقص، ملقط، ومرقئ بين العمليات الجراحية والسماحلتبريد كاف لإعادة استخدامها مسبق.
3. الانتعاش والرصد القوارض الصحة، وتحليلات نقطة النهاية
- بعد العملية الجراحية كاملة، والحفاظ على الفئران على وسادة التدفئة للتعافي، أقفاص نظيفة خالية من الفراش مدة لا تقل عن 20 دقيقة. الفئران عادة ما يستغرق 2-4 دقيقة إلى الاستيقاظ من التخدير.
- لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للمشاركة في سكن مع غيرها من الحيوانات حتى أنه قد تعافى تماما من التخدير. لا تترك حيوان غير المراقب في حين أنه يستعيد وعيه، ورصد حتى الحيوان استعاد القدرة على الحفاظ على نفسها في الاستلقاء القصية.
- إعطاء الفئران 0،05-،1 ملغم / كغم البوبرينورفين لإدارة الألم في كل 6-12 ساعة بعد الجراحة، لمدة تصل إلى 72 ساعة.
- تحقق الغرز يوميا لضمان أن تبقى على حالها خلال الشفاء. في حالة أن الغرز يأتي التراجع، ضع الماوس تحت التخدير، وإزالة الغرز المتبقية، واستبدال. في حالة الإصابة أو inflammأوجه استشارة الموظفين البيطري.
لم اجه العدوى أو الالتهابات مع هذا البروتوكول: ملاحظة. - للدراسات ورم خبيث، نفذ الفحوصات الطبية اليومية حتى يتم ملاحظة إشارات خارجية من المرض المنتشر بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر:> 10٪ فقدان الوزن / مكسب، القذارة، وفقدان الانتباه إلى المناطق المحيطة بها، في البطن وذمة / استسقاء، عيون شاحبة والأذنين، أو موقف منحنية.
ملاحظة: فحوصات طبية يومية لها أهمية خاصة عند وضع نموذج للاستخدام مع خط خلية جديدة أو تركيز الخلية حتى يفهم جدول زمني لورم خبيث أيضا. - في دراسة نقطة النهاية، الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم.
ملاحظة: طرق بديلة للقتل الرحيم افقت لجنة الإشراف المحققين يمكن استخدامها، بما في ذلك نضح مع برنامج تلفزيوني 1X في حين تحت التخدير. يتم تنفيذ نضح من الكبد عن طريق cannulating الوريد البابي، القص الوريد الأجوف السفلي، ودفع ال برنامج تلفزيوني 1Xالخام الأوعية الدموية الكبد بمعدل 4 مل / دقيقة لمدة 1-2 دقيقة لإزالة تعميم الدم والكريات البيض.
ملاحظة: اعتمادا على نقطة النهاية للدراسة، خط الخلية، والتركيز المستخدم، العلني ورم خبيث في الكبد قد تكون أو لا تكون واضحة في التشريح. يمكن كشف الآفات Micrometastatic مع التحليل النسيجي للكبد. سوف تختلف النهاية على أساس تصميم الدراسة. - استخراج الكبد مع مقص وملقط عن طريق إزالة أولا المرارة، ثم قطع طريق الوريد الأجوف السفلي متفوقة على الكبد. قطع طريق الوريد الأجوف، الوريد البابي والشريان الكبدي وأقل شأنا من الكبد.
- إزالة الكبد كله برفق ويغسل 5X في برنامج تلفزيوني 1X.
- فصل الكبد إلى اليسار، فصوص الحق، الوسيط، والمذنبة.
- الفورمالين الكبد الإصلاح في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لمدة 48 ساعة في حين تهتز في درجة حرارة الغرفة. عملية الأنسجة من خلال سلسلة من الكحول في زيادة التركيز والزيلين. تضمين البارافين الأنسجة ثابتة 71 ملاحظة: بدلا من ذلك، والكبد ويمكن المفاجئة المجمدة عن طريق وضع الأنسجة في cryomold مع أفضل درجة حرارة القطع صيغة (أكتوبر) وتجميد على كريات الثلج الجاف غارقة في الايثانول 95٪.
- باستخدام مبضع للفحص المجهري، مقطعة إلى كتلة الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من هذا القبيل أن حجم مباراة الرأس من الأنسجة كشف.
- قطع خمسة أقسام التسلسلية 4 ميكرون، وهذا يشكل المستوى الأول للتحليل.
- قطع طريق 250 ميكرون من الأنسجة، ورمي هذه المقاطع في النفايات.
- في 250 ميكرون خفض مستوى ثان من خمسة أقسام التسلسلية 4 ميكرون.
- كرر حسب الضرورة إلى القسم عن طريق الكبد كله. الهيماتوكسيلين وصمة عار يوزين القسم الأول من كل مستوى لتقييم لورم خبيث 72.
ملاحظة: للحصول على الأنسجة المفاجئة المجمدة استخدام ناظم البرد لخفض أقسام.
ملاحظة: الكشف عن مرض micrometastatic تتطلب الخلايا السرطانية تلطيخ محددة.
- إزالة الفئران من الدراسة إذا كان هناك نمو الورم في شق الجلوسه، وهذا يدل على تسرب الخلايا السرطانية في التجويف البريتوني بعد الحقن.
ملاحظة: لم يتم ملاحظة هذه المشكلة.
Representative Results
نموذج حقن الوريد البابي، والتي يتم تسليمها الخلايا السرطانية مباشرة إلى الكبد عن طريق عملية جراحية، ويسمح لحقن الخلايا السرطانية في الوريد البابي. في ظل ظروف مطهر، في الماوس تخدير، يتم شق جراحي ل~ 1 بوصة على الجانب الأيسر للفأرة بين الوسيط والسهمي الطائرات، بدأت للتو فوق مستوي رابع الأربية حلمة الغدة الثديية وتنتهي فقط تحت الأضلاع . يتم سحب الأمعاء الكبيرة والصغيرة بلطف من خلال شق لتقديم التصور من الوريد البابي (الشكل 1A). تحديد التشريحي الدقيق لالوريد البابي ونجاح الحقن داخل البوابة ويمكن التأكد من خلال ممارسة بروتوكول حقن مع الهند الحبر أو صبغة مشابهة. وحقن الصحيح عبر الوريد البابي يؤدي إلى الحبر يجري تسليمها فورا وعلى وجه التحديد إلى الكبد، ولن يؤدي في الهند الحبر انتشر في الرئة (فيقوإعادة 1B). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الماوس D2A1 الخلايا السرطانية الثديية ذات الكلمات الدلالية مع GFP، تشتت الخلايا السرطانية في جميع أنحاء الكبد هو واضح في تسعين دقيقة بعد الحقن، مؤكدا بوابة تسليم حقن الوريد إلى الكبد (الشكل 1C). في أعلى التكبير يصبح من الواضح أن في 90 دقيقة بعد الحقن، تم العثور على الخلايا السرطانية داخل الجيوب، وكذلك داخل لحمة الكبد على مقربة من الثلاثيات بوابة، حيث يدخل الدم البابي للكبد (الشكل 1C). وتشير هذه البيانات إلى أن نشط تسرب الخلايا السرطانية قد تحدث في 90 دقيقة بعد ورم حقن الخلايا. مجتمعة، وتؤكد هذه البيانات أن النموذج حقن الوريد البابي يسلم حجم الحقن مباشرة إلى الكبد، مع الحبر أو ورم خلايا متناثرة في جميع أنحاء الكبد وجود وسائل نقل ملموس من حجم الحقن إلى الرئة.
لتقييم متانة الوريد البابي نموذج الحقن، وثلاثة separأكلت تم اختبار مسانج الماوس الثدي خطوط الخلايا السرطانية في إناث البالغات الفئران BALB / ج. تم اختيارهم بناء هذه السطور ورم الثدي على سلوك يتسم في نماذج منصة الدهون الثديية وتشمل خط عدوانية للغاية والنقيلي 4T1 الخلية، وأقل عدوانية خط D2A1 النقيلي، وانخفاض خط D2.OR / غير المنتشر 37،61،73 (74 عاما). تم اختبار 2000 و 10،000 الخلايا في الحقن مع عدم وجود فروق ملحوظة في وقت لنمو الانبثاث العلني مع هذه التركيزات خلية منخفضة. لهذه الدراسات تم استخدام علامات بديلة من ورم خبيث مثل عدم وجود الاستمالة، وشحوب، وفقدان الوزن لتبرير التشريح، والذي تم بمقتضاه أكدت وجود أو عدم وجود نقائل الكبد عن طريق تقييم البصرية الكبد وغيرها من الأجهزة لتأكيد التسليم داخل البوابة . وتؤكد هذه البيانات تقارير سابقة أن خطوط الخلايا 4T1 وD2A1 تمثل خطوط ورم الثدي أكثر عدوانية، كما لوحظ أقصر ورم خبيث معدلات البقاء على قيد الحياة الحرة بالمقارنة مع الفئران التي حقنتمع خط D2.OR أقل عدوانية (الشكل 2A). الفئران حقنها بخلايا 4T1 أو D2A1 الورم المتقدمة ورم خبيث في الكبد العلني التي كتبها ~ 30 - 40 أيام بعد الحقن، وبعض ضعت ورم خبيث في أقرب وقت 18 أيام بعد الحقن (الشكل 2A)، في حين الماوس واحد فقط حقنها بخلايا D2.OR زيارتها المتقدمة ورم خبيث في الكبد العلني في نهاية الدراسة، والتي كانت 60-65 يوما بعد ورم حقن الخلايا. وأكد الانبثاث في وقت لاحق من قبل باجتزاء من خلال الكبد في 250 ميكرون المستويات وتحليل الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) المقاطع الملون (الشكل 2B-D).
بالإضافة إلى الكشف عن الآفات النقيلي العلنية في الكبد الماوس، يمكن أيضا أن تستخدم نموذج الوريد البابي لدراسة الأحداث السابقة في تتالي النقيلي بما في ذلك الكشف عن خلايا واحدة / مجموعات الخلايا التالية التسرب، وتشكيل الآفات الصغيرة النقيلي. تم استخدام تعدد الإرسال المناعي تلطيخللكشف عن 4T1، D2A1، وD2.OR الخلايا السرطانية الثديية في الكبد عندما كانت موجودة كما الخلايا واحد أو الآفات الصغيرة المنتشر، كما H & E غير كافية لتأكيد وجود الآفات الصغيرة. ويبين الشكل 3A على BALB / ج الماوس الكبد التمثيلي مع بؤر micrometastatic المفترض من خلايا الورم D2A1 التي هي ايجابية للCK18 قرنين الظهارية، سلبية للCD45 علامة عموم المناعي، والسلبية للعلامة الكبدية Heppar-1. خلايا الكبد أيضا وصمة عار إيجابية لCK18، مما يستلزم استخدام Heppar-1 في هذا الفريق تلطيخ. واحد ملاحظة هامة هي أن ظهارة القناة الصفراوية والسلف خلايا الكبد وصمة عار إيجابية لCK18، الأمر الذي يتطلب تمييز دقيق بين الخلايا السرطانية والقناة الصفراوية، وخاصة عند تقييم المناطق حول الأوعية البابية (الشكل 3A). كبديل لتعدد المناعي لتحديد خلايا نشر واحدة وبؤر micrometastatic هو الاستفادة مسانج خطوط ورم الثدي الكلمات الدلالية مع تعزيز الفلورية الخضراءبروتين (EGFP) و / أو وسيفيراز وأداء IHC للعلامة (الشكل 1C). ويرجع ذلك إلى المناعية للEGFP، وسيفيراز، والبروتينات الأخرى، لا بد من استخدام نماذج الماوس التي tolerized لهذه البروتينات، مثل المناعة المختصة "متوهجة رئيس" الماوس الرواية التي تعبر عن EGFP ووسيفيراز في الغدة النخامية الأمامية 75. لتحديد الآفات macrometastatic خطوط مسانج لازال مثل خط D2A1 الورم، والمناعي تعدد الإرسال CK18 / Heppar-1 / CD45 مثالية (الشكل 3B).
الشكل 1: الوريد البابي حقن يسلم الخلايا السرطانية مباشرة إلى الكبد. أ) البوابة حقن الوريد. يتم إجراء شق بين الوسيط والطائرات السهمي اليسرى من فوق الطائرة من الرابعة الأربية حلمة الغدة الثديية وتنتهي أسفل ري ب القفص. ب) BALB / ج الكبد مع حقن برنامج تلفزيوني (يسار). بعد الهند حقن الحبر عبر الوريد البابي، والكبد (وسط) ولكن ليس في الرئة (يمين) يستغرق الحبر. C) التمثيلية الصور قسم رقيقة من D2A1 الماوس الخلايا السرطانية الثديية ذات الكلمات الدلالية مع GFP في BALB / ج الماوس الكبد في 90 دقيقة بعد الحقن من 1 × 10 6 الخلايا السرطانية عن طريق الوريد البابي. والأكباد الفورمالين ثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ، مقطوع، وملطخة الأجسام المضادة لمكافحة GFP للكشف عن الخلايا السرطانية. وتظهر اللوحة العلوية البني زنازين مظلمة الملون ورم (السهام) المنتشرة في جميع أنحاء الكبد، النجمة يدل تلطيخ الكبدية غير محددة حول الأوردة المركزية؛ شريط مقياس = 300 ميكرون. لوحات السفلي تظهر الصور ممثل الخلايا السرطانية في 90 دقيقة بعد الحقن لا يزال يرتبط بشكل وثيق مع الأوعية الدموية. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 2: ثمرة من الماوس الثدي خطوط ورم الخلايا في الكبد بعد الوريد البابي حقن. أ) منحنى كابلان ماير تظهر معدلات البقاء على قيد الحياة خالية من ورم خبيث في الفئران حقن مع 2،000-10،000 خلايا 4T1، D2A1، أو D2.OR الماوس الثدي السرطانية. تم حقن الفئران بخلايا الورم ومراقبة بحثا عن علامات على ورم خبيث بما في ذلك عدم وجود الاستمالة، عيون شاحبة، وتغيرات الوزن. وأكد ورم خبيث في وقت التشريح وH & E على أقسام النسيجية للكبد. N = 2 4T1 2000 الخلايا. 2 4T1 10،000 الخلايا. N = 2 D2A1 2000 الخلايا. 3 D2A1 10،000 الخلايا. N = 3 D2.OR 2000 الخلايا. 3 D2.OR 10،000 الخلايا. ممثل H & E صور B) 4T1 الآفات في 21 أيام بعد الحقن من 10000 الخلايا، C) الآفات D2A1 في 26 أيام بعد الحقن من 10،000 الخلايا السرطانية، وD) الآفات D2.OR في59 أيام بعد الحقن من 10،000 خلايا. الحانات النطاق = 75 ميكرون. ولوحظت إصابات مشابهة عندما تم حقن الخلايا 2000 4T1 أو D2A1 الورم. تم الكشف عن أي آفات مع 2000 خلايا D2.OR. كان لا يوجد دليل على ورم خبيث في أجهزة أخرى أو في موقع شق جراحي واضح في أي الماوس على هذه الدراسات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: الكشف عن خلايا واحدة والنقيلي الآفات في كبد الفأر باستخدام المتعددة المناعي. أ) المناعي متعدد الممثل الخلايا D2A1 ورم في BALB / ج الماوس الكبد في 90 دقيقة بعد الحقن باستخدام نموذج حقن الوريد البابي. وقد تم تلوين باستخدام مجموعة متعددة. من اليسار إلى اليمين يظهر دابي. CD45 بمناسبة الكريات البيض. Heppar-1 لمارك خلايا الكبد. وCK18 بمناسبة الخلايا السرطانية، خلايا الكبد، وظهارة القناة الصفراوية. وتظهر الصورة المدمجة مجموعة المفترضة للCK18 + Heppar-1 - الخلايا السرطانية D2A1 المرتبطة بشكل وثيق مع ثالوث المدخل - CD45. السهم = خلايا الورم D2A1، النجمة = القناة الصفراوية ظهارة. شريط النطاق = 25 ميكرون. ب) D2A1 علنية آفة المتنقل تمثيلية باستخدام نفس لوحة تلطيخ كما هو الحال في خلايا الورم A. هي CK18 + في حين خلايا الكبد المجاورة هي CK18 + Heppar-1 +. شريط النطاق = 25 ميكرون. تم القبض على الصور على المجهر مع 20 × 0.8، 40 × 1.3، و60 × 1.4 الأهداف وكاميرا CCD، وذلك باستخدام برنامج المجهر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يسمح BALB / ج البوابة الماوس نموذج حقن الوريد دراسة الآفات السرطانية الثديية في الكبد في حالة عدم وجود التباس ورم خبيث الأعضاء المتعددة ومجموعة المختص المناعة بالكامل. بروتوكول لدينا هو النهوض العمليات الجراحية التي تم نشرها مسبقا التي تسمح بالوصول إلى الوريد البابي لحقن الخلايا السرطانية مباشرة إلى الكبد 16،55،56. واحد تقدم لدينا هي لخفض كبير في عدد الخلايا السرطانية حقن من ≥ 1 × 10 5 خلية / حقن 16،55،56 الى ≤ 10000 الخلايا السرطانية / الحقن. قمنا بتوسيع أيضا نموذجا للدراسة الانبثاث سرطان الثدي إلى الكبد. باستخدام هذا البروتوكول، واثنين من خطوط الخلايا السرطانية الثديية مع إمكانية النقيلي المعروفة تطوير الانبثاث الكبد مع الكمون أقصر من خط الخلايا السرطانية الثديية أكثر هامدة. وعلاوة على ذلك، في نقاط زمنية مبكرة، ويتم توزيع الخلايا السرطانية في جميع أنحاء لحمة الكبد كمجموعات واحدة أو صغيرة من اوربا واحدLLS بعد حقن الخلايا السرطانية. تستعد نموذج لمعالجة مسائل الكفاءة المنتشر بما في ذلك ورم الخلايا التسرب، بقاء الخلية، السكون، وانتشار - جميع الظواهر التي تساهم في تطوير المرض المنتشر الصغير المنتشر والعلني في الكبد.
من المهم أن تنظر في جوانب عديدة من بروتوكول حقن الوريد البابي قبل بدء الدراسة. تقرر بعناية على خطوط الخلايا، وتركيز خلية، ومجموع عدد الخلايا، ونهاية النقاط المثيرة للاهتمام على أساس دراسات استكشافية أصغر ينصح بشدة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الجنود المختصة المناعة، وخطوط الخلايا مسانج أمر في غاية الأهمية لفهم التفاعلات الخلية المضيفة للورم. وضعت حديثا "متوهجة رئيس" الماوس التي تعبر عن EGFP ووسيفيراز من الغدة النخامية الأمامية أداة هامة للقضاء على الردود تستضيف خارجي EGFP ووسيفيراز والبروتينات غالبا ما تستخدم لوضع علامة خطوط الثدي ورم 75
من المهم أن نلاحظ أن نموذج حقن الوريد البابي لا تكرار سلسلة النقيلي كاملة، ولكن يقتصر على دراسة تسرب الخلايا السرطانية، الورم التفاعلات خلية المتخصصة التالية التسرب ونمو الورم. النماذج التي تحاكي بدقة تتالي النقيلي كامل للكبد، مثلما يحدث في المرضى، وهناك حاجة ماسة. قيود إضافية من طراز حقن الوريد البابي هو أن مرتبك ذلك بسبب تأثير الجراحة على المضيف، مع التئام الجروح المعروف أن يؤثر تطور المرض 76،77.
يمثل نموذج حقن الوريد البابي تحسنا على حقن الآخريننماذج لدراسة ورم خبيث في الكبد، بما في ذلك داخل القلب ونماذج داخل الطحال. على وجه التحديد، ونموذج حقن الوريد البابي يسمح لدراسة مجموعة أكبر من تطور المرض من النموذج داخل القلب، والتي غالبا ما تكون محدودة بواسطة الانبثاث مصاحبة في الأنسجة الأخرى. وعلاوة على ذلك، ليست معقدة نموذج الوريد البابي عن طريق إزالة الطحال، كما هو الحال في النموذج داخل الطحال.
قد يكون نموذج حقن الوريد البابي أداة مفيدة لدراسة ورم خبيث في الكبد بشكل عام. الكبد ورم خبيث هو الموقع الأكثر شيوعا من ورم خبيث في الأورام الغدية بشكل عام، مع معدلات مرتفعة بشكل خاص في سرطان البنكرياس (85٪ من الانبثاث هي للكبد) والقولون وسرطانات الغدد الشرجية (> 70٪)، وكذلك في المعدة والمريء (> 30 ٪) 1. على الرغم من العفوية ومثلي نماذج ورم الأولية من سرطانات الغدد البنكرياس والقولون metastasize بسهولة أكبر إلى الكبد 78،79، قد الأقليم في الوريد البابي نموذج حقنالبريد مفيدا لفهم عملية النقيلي من هذه السرطانات كما التسليم المراقب من الخلايا السرطانية يسمح تقييمات بيوكيميائية، الجزيئية والنسيجية في أوقات محددة بعد وصوله الخلايا السرطانية. وخلاصة القول، يمثل نموذج حقن الوريد البابي تحسنا هاما على نماذج ورم خبيث في الكبد المتاحة من سرطان الثدي، ويمكن أيضا أن تكون قابلة للتطبيق في الميدان ورم خبيث في الكبد بشكل عام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
| Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously |
| Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site |
| anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
| Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
| Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
| Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
| anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
| Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
| DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
| Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
| Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
| Heating Pad, x 2 - 3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
| Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
| Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
| Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
| Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
| Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
| Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
| Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
| Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
| Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
| Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
| Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
| Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
| Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
| Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
| Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
| Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
| Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
| Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
| Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |
References
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
- Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
- Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
- Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
- Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
- Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
- Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
- Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
- Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
- Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer--a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
- Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature reviews. Cancer. 4, 448-456 (2004).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
- Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
- Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
- Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489 (2014).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15, 73-86 (2015).
- Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
- Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
- Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
- Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
- Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
- Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
- Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
- Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
- Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. , e4260 (2012).
- Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
- Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
- Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677 (2014).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469 (2015).
- Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
- Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
- Coligan, J. E., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
- Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
- Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
- Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
- Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
- Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960 (2015).
- Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35 (2016).
- Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
- Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
- O'Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
- Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
- Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
- Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
- Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
- Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
- Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18, 1286-1294 (2012).
- Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32, 39-61 (2013).
