Abstract
Brystkræft er den hyppigste årsag til kræft-relateret dødelighed hos kvinder på verdensplan. Levermetastaser er involveret i op mod 30% af tilfældene med brystkræft metastaser, og resulterer i dårlige resultater med median overlevelse på kun 4,8 til 15 måneder. Aktuelle gnavermodeller for brystkræft metastase, herunder primær tumorcelle xenograft og spontane tumormodeller, sjældent metastaserer til leveren. Intracardiel og milten injektion modeller resulterer i levermetastaser, men disse modeller kan beskæmmes ved samtidig sekundær-site metastase eller ved kompromitteret immunitet på grund af fjernelse af milten for at undgå tumorvækst på injektionsstedet. For at imødekomme behovet for forbedrede levermetastaser modeller, en muse portal vene injektion metode, der leverer tumorceller først og direkte til leveren blev udviklet. Denne model leverer tumorceller til leveren uden komplikationer af samtidige metastaser i andre organer eller fjernelse af milten. optimized portal vene protokol beskæftiger små injektionsvolumener på 5 - 10 pi, ≥ 32 gauge nåle, og hæmostatisk gaze på injektionsstedet til at kontrollere for blodtab. Portåren injektion tilgang i Balb / C hunmus under anvendelse af tre syngene brysttumor linier af varierende metastatisk potentiale blev testet; høj-metastatisk 4T1 celler, moderat-metastatiske D2A1 celler og lav metastatiske D2.OR celler. Koncentrationer på ≤ 10.000 celler / injektion resulterer i en latenstid på ~ 20 - 40 dage for udvikling af levermetastaser med de højere metastatisk 4T1 og D2A1 linjer, og> 55 dage for mindre aggressiv D2.OR linje. Denne model er et vigtigt redskab til at studere brystkræft metastaser til leveren, og kan gælde for andre kræftformer, der ofte metastaserer til leveren, herunder kolorektal og pancreas adenokarcinomer.
Introduction
Breast Cancer metastaser til leveren
Leveren er et fælles sted for brystkræft metastase, sammen med knoglen og lunge 1-3. Levermetastaser hos brystkræftpatienter er en uafhængig prognostisk faktor for meget dårlige resultater 4,5, som median overlevelse brystkræftpatienter med levermetastaser varierer fra 4,8 til 15 måneder 6-9. I modsætning hertil brystkræftpatienter med lunge eller knoglemetastaser har median overlevelse på 9 til 27,4 måneder 8,9 og 16,3 til 56 måneder 8,10-12 hhv. Metastase er en flertrinsproces, benævnt metastatisk kaskade, som begynder med formidling tumorcelle i den primære tumor og slutter med dødelighed patient på grund af såning og udvækst af cirkulerende tumorceller i et fjernt organ 13-15. Gnavermodeller for metastase har afsløret, at den metastatiske kaskade er bemærkelsesværdigt ineffektivt, med blot 0,02 - 10%af cirkulerende tumorceller oprettelse åbenlys metastase 16,17. En væsentlig flaskehals af metastatisk ineffektivitet er dikteret af de unikke væv mikromiljøer på sekundære sites, kaldet metastatiske nicher 18, fremhæver betydningen af forståelse stedsspecifik metastaser. Den metastatiske niche er unikt til stedet for tilbagefald, og er til dels karakteriseret ved aflejring af forskellige ekstracellulære matrixproteiner 19,20, infiltration af forskellige immun cellepopulationer 21-23, og ændret vævshomeostase herunder dysreguleret produktion af talrige cytokiner, kemokiner og vækstfaktorer 15,18,24,25. Således er en forståelse af den vævsspecifikke metastatisk niche forud en forståelse af, hvordan man målretter metastatisk sygdom. Imidlertid er robuste modeller af levermetastaser mangler. Desuden vil forbedrede modeller for levermetastaser være afgørende for at identificere nye mål og effektive behandlinger for brystkræftpatienter with levermetastaser.
Etableret modeller til at studere Breast Cancer Metastase til leveren
For øjeblikket tilgængelige modeller til at studere brystkræft metastaser til leveren omfatter menneskelige kræftceller xenografter i immunkompromitterede mus. Disse modeller anvender typisk velundersøgte humane brystcancercellelinier såsom MCF-7 og MDA-MB-231 og Nude, RAG1 - / -, eller SCID immunsvækkede murine værter 26-29. Xenograftmodeller giver den fordel at inddrage menneskelige afledt kræft cellelinjer, men i betragtning af den seneste påskønnelse for immunceller i metastaser 30-32 og i terapeutisk modstand 33-35, studiet af metastaser i et helt immun kompetent vært er altafgørende. Modeller til at studere brystkræft metastase til leveren i immunkompetente værter indbefatter ortotopisk injektion af syngene tumorceller (f.eks 4T1 og D2A1 cellelinier) i brystfedtpuden, med eller uden kirurgiskresektion af den primære tumor, og efterfølgende vurdering af metastase 36-38. Notatet hastigheden af levermetastaser fra ortotopisk transplantation modeller er meget lav eller ikke-eksisterende i forhold til andre metastatiske steder såsom lunge 39,40, eller sker efter lunge metastase er etableret, komplicerer undersøgelse af lever-specifik metastaser 37,39 .
Tumor eksplanteret fra spontane gensplejsede brystkræft modeller kan re-injiceres i yverfedt puder af naive værter som syngene tumorceller. For eksempel blev det for nylig rapporteret, at spontane tumorer fra K14 Cre ECAD f / f P53 f / F mus, hvilken model invasive luftrør mammacancer, udvikle tumorer når orthotopisk indsprøjtes i vildtype værter. Efter kirurgisk resektion af disse tumorer, når de når 15 mm 2, 18% af musene skred til levermetastaser 40,41. En tredje fremgangsmåde til at modellere levermetastaser udnytterspontan metastase i genetisk modificerede mus. Til dato rapporter om spontane murine modeller af brystkræft metastase, som let spredes til leveren er ualmindelige. Undtagelser omfatter H19-IGF2, p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre, og K14 Cre ECAD f / f P53 f / f gensplejsede musemodeller, hvor levermetastaser udvikler i en lav procentdel af mus 38,41- 43. Således, mens gensplejsede musemodeller lette undersøgelsen af alle stadier af metastatisk kaskade, der giver stærke og klinisk relevante modeller, er de begrænset på grund af lave levermetastaser 38.
Adskillige metastase modeller omgå de indledende trin i den metastatiske kaskade herunder formidling af tumorceller fra den primære tumor og intravasation. Disse modeller tillader undersøgelse de senere trin i den metastatiske kaskade, fra ekstravasation til etablering af tumorer på sekundære sites. intracardiac injektion model leverer tumorceller i den venstre ventrikel, som fordeler tumorceller i kredsløbssystemet via aorta. Intrakardial injektion kræver ultralydvejledt billeddannelse af injektionsstedet eller andre billeddiagnostiske modaliteter såsom bioluminescens af luciferase mærkede celler for at bekræfte vellykket injektion. Tumorcelleinjektion via den venstre ventrikel kan resultere i knogler, hjerne, lunge, og / eller levermetastaser, blandt andre organer 44-48. På grund af multi-organ metastaser, disse mus ofte skal aflives før udvikling af åbenlys levermetastaser, bevirke, at evnen til fuldt ud at undersøge metastatisk vækst i leveren. En alternativ metode, der væsentligt minimerer udviklingen af multi-site metastaser er den milten injektion model. Milten injektion leverer tumorceller via milten vene, der slutter med den overlegne mesenteriske vene til at blive portalen vene 49,50. kan overvåges Dyr for outgrowth af metastatiske læsioner i leveren, fordi dannelsen af metastaser ved andre steder er sjældne, og som et resultat, er dyrets generelle sundhed opretholdes 49,50. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at milten model kræver splenektomi at undgå milt tumorer 49,50, en procedure, der påvirker immunforsvar. For eksempel er myocardial iskæmisk reperfusionsbeskadigelse karakteriseret ved infiltration af Ly6C + monocyt delmængder, der stammer fra milten og er ansvarlige for fagocytisk og proteolytisk aktivitet i løbet af sårheling efter iskæmi 51,52. Med splenektomi, der er en observeret reduktion i monocyt populationer, der hjælpe med sårheling 52. Endvidere har splenektomi vist sig at reducere primær tumor vækst og lungemetastaser i en ikke-småcellet lungekræft model, specielt gennem en reduktion i antallet af cirkulerende og intra-tumor CCR2 + CD11 + Ly6C + monocytisk myeloid celler 53. Derudover splenektomi efter milten injektion af coloncancerceller resulterede i reducerede niveauer af anti-tumor naturlige dræberceller i mesenteriske lymfeknuder og forhøjet levermetastaser 54. I sum, disse resultater tyder på, at splenektomi kompromiser immunsystemets rolle med efterfølgende konsekvenser for metastatisk celle skæbne.
Portal Vein Injection Model af levermetastaser
For at undersøge brystkræft metastase til leveren i en helt immun kompetent vært, under betingelser, hvor mus ikke er kompromitteret på grund af multi-organ metastaser, blev en portal vene injektion model udviklet. Intraportal injektion modeller er tidligere blevet anvendt til at studere levermetastaser af colorektal 55,56 og melanom 16 cellelinier; her beskriver vi anvendelsen af intraportal injektion for at modellere syngen brystkirtler tumorcellemetastase. Denne model kan anvendes til at studerede senere stadier af metastatisk kaskade herunder brystkræft celle ekstravasation og såning, tumor celle skæbne beslutninger om døden / spredning / vækstdvale, og udvækst i åbenlyse læsioner. I denne model er syngene brysttumorcellelinier injiceret via portåren af immunkompetente Balb / c-hunmus, en fremgangsmåde, der leverer tumorceller først og direkte til leveren uden fjernelse af milten. At udvikle denne model, brug af fire brysttumorcellelinier, der varierer i deres metastatiske kapacitet fra lav til høj var ansat: D2.OR, D2A1, og 4T1, og har ansat D2A1 mærket med grønt fluorescerende protein (D2A1-GFP) til undersøge tidlig tid-point efter tumorceller injektion. 4T1 er en meget metastatisk cellelinie afledt fra 410,4 tumor, som spontant opstod i en MMTV + Balb / c hunmus 36,37 og metastaserer til lunge, lever, hjerne og knogle fra brystfedtpude primære tumorer 39,57,58. D2A1 tumorceller were ligeledes oprindeligt stammer fra en spontan brysttumor hidrører fra en Balb / c-vært efter transplantation af D2 hyperplastiske alveolære knuder celler og bekræftet at være metastatisk fra den primære tumor til lungen 59,60. D2.OR tumorceller er en ikke-metastatisk søster linje til D2A1 linje og, selvom de undslippe den primære tumor og ankommer til sekundære steder, de sjældent etablere fjerne metastaser 60,61.
Desuden er det vigtigt at undgå brugen af almindeligt anvendte smertebehandling lægemidler, herunder ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) under eller efter den kirurgiske procedure. NSAID har anti-tumor aktivitet i visse brystcancere 62-65, og nogle klasser af NSAID øger risikoen for hepatotoksicitet 66,67, potentielt kompromittere studiet af levermetastaser og leveren metastatisk niche. Yderligere undersøgelser tyder på, at NSAID direkte indflydelse vævet mikromiljø, reducerer pro-metastatisk extracellular matrixproteiner tenascin-C 68 og fibrillært collagen 62,65. Alternativt brug af en opioid-derivat, buprenorphin, blev brugt på grund af dens effektivitet i smerte gnaver styring 69 og på grund af manglende beviser, at opioider har antitumoraktivitet 70. Denne portal vene injektion model blev optimeret til mindre injektionsvolumener på 5 - 10 pi at undgå unødig skade på leveren. Modellen blev også optimeret til at omfatte nåle med mindre diameter (≥ 32 gauge) og anvendelse af hæmostatisk gaze umiddelbart efter injektion for at minimere blodtabet under proceduren. I modsætning til disse optimerede injektion parametre bør celleantal bestemmes på individuel basis, baseret på det tumorigene potentiale cellelinie. Dog starter ved ≤ 10.000 celler / injektion for langtidsstudier anbefales. For kortere endepunkter (f.eks 24 timer efter injektion) betydeligt flere tumorceller (f.eks,1 x 10 5 - 1 x 10 6) kan anvendes, hvis berettiget. Sammenfattende portåren injektion model beskrevet her betegner et nyttigt værktøj til undersøgelse af brystkræft metastase til leveren og omgår en række begrænsninger andre levermetastaser modeller. Denne model letter undersøgelse af tumorceller ekstravasation, såning, tidlige skæbne beslutninger for overlevelse, proliferation og vækstdvale, og metastatisk udvækst i immunkompetente murine værter.
Protocol
Alle dyreforsøg i denne artikel er revideret og godkendt af Oregon Health & Science University Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Forberedelse af kirurgiske område og instrumenter
- Forbered saksen, pincet og hæmostat ved autoklavering ved 124 ° C i 30 minutter, 1 - 2 dage før de planlagte operationer. Sikre adgang til autoklaveret eller steril strøelse, bure, og mad til post-kirurgisk opsving.
- Forbered en aseptisk kirurgiske område, helst i en laminar flow hætte.
- Tør alle overflader af det kirurgiske område med 10% blegemiddel, herunder varmepuden, lyskilde, anæstesi slanger og næsekegle, og andre dele af den kirurgiske pakke, der vil være i tæt nærhed til den kirurgiske procedure, mens den bliver udført .
- I den aseptiske kirurgiske område, skal du placere den rensede varmepude med sterilt afdækningsstykke, lyskilde, anæstesi slanger og næsekegle, insulininjektionssprøjter, 1 ml sprøjter, bupivacain, kunstige tårer, sterilt saltvand, 2 x 2 "sterile gaze svampe, 4 x 4" steril gaze, hæmostatisk gaze cut i 0,5-1 cm 2 stykker, sakse, pincet, hæmostat, 4-0 Vicryl suturer med tilspidsning nål, og 50 ml 2% chlorhexidingluconat i en autoklaveret beholder.
- Sørg for, at der er plads i dette rum for tilberedte tumorceller lagret på is.
- På bænken ved siden af kirurgiske område, forberede opsving område med en anden varmepude og rene bure med sterilt strøelse.
BEMÆRK: dette område kan også hus elementer såsom en perle sterilisator.
2. Portal Vein Injection
- En time forud for de planlagte injektioner, behandle Balb / c hunmus i alderen 8 - 15 uger med 100 pi 0,015 mg / ml buprenorphin, subkutant, til smertebehandling.
BEMÆRK: Denne injektion protokol kan anvendes på enhver stamme af kvindelig eller mandlig mus på alle alderstrin, anvendelse af den passendecellelinier til ændringer af stammen. - Forbered tumorcellerne til injektion baseret på protokoller for cellelinjen eller tumor eksplantat af valg. Teste alle tumorcellelinier før administration for tilstedeværelsen af murine patogener for at mindske risikoen for at indføre sådanne patogener i dyret koloni.
- For syngene Balb / c tumorcellelinier herunder D2A1, D2.OR, og 4T1-tumorceller, tø celler i en 10 cm vævskulturplade 3 dage før injektion, således at den følgende dag celler er på -90 - 100% sammenflydning.
- 1 dag efter tumorcelle tø udvaskede celler én gang med 1x phosphatpufret saltvand (PBS) og Trypsinisér de sammenflydende tumorceller 2 ml 0,05% trypsin ved 37 ° C i 5 minutter. Tilsæt 8 ml komplette medier (DMEM høj glucose, 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin og 1 x penicillin / streptomycin) og passage 01:10 i en frisk 10 cm skål med 10 ml komplet medium.
- På dagen for injektionerne, vaske celler en gang med 1 x PBS og trypsinize som beskrevet ovenfor.
- Resuspender trypsinerede celler i 8 ml komplet medier spin for 5 minutter ved 1500 xg, fjern mediet og resuspender i 5 ml 1x PBS.
- Tæl celler på et hæmocytometer hjælp trypanblåteksklusion til vurdering levedygtighed. Resuspender celler til injektion i 1x PBS ved en forudbestemt koncentration og volumen.
BEMÆRK: 5 - 10 pi anbefales som mindre injektionsvolumener forhindre unødig skade på leveren. - Hold celler på is for varigheden af injektionerne. Efter gennemførelse af injektioner, returnere en prøve af celler til laboratoriet og anbring i kultur i komplet medium i 1 dag for at sikre levedygtigheden.
- Placer musen under anæstesi til 2 - 2,5% isofluran (2-chlor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethan) leveres i oxygen. Oprethold kropstemperatur ved hjælp varmepuden. Sikre fuldstændig bedøvelse ved at vurdere om en reaktion på en tå knivspids, og derefter opretholde anesthesia 2 - 2,5% isofluran.
BEMÆRK: Det er vigtigt at overvåge dyrene vejrtrækning og juster isofluran flow-rate i overensstemmelse hermed under hele proceduren. - Placer en lille mængde af kunstige tårer eller dyrlæge salve over hvert øje for at undgå overdreven udtørring af øjnene under den kirurgiske procedure.
- Placer musen i en liggende stilling, på ryggen med maven udsatte.
- Fjerne hår på den ventrale venstre side af gnaver fra den anden ribbe plads ned til 4 th lyske- brystkirtel nippel ved at tørre området med kemiske hårfjerningsmidler. Lad rigtige spørgsmål til at sidde i 1 - 2 min og derefter fjerne helt med gaze og H 2 O. Dette trin kan gøres 1 - 2 dage i forvejen for at spare tid, hvis der er planlagt en lang række operationer.
- Tag en 2 x 2 "steril gaze svamp (opblødt i 2% chlorhexidin) og tørre ned musen på stedet for hårfjerning. Sterilisere hele det omkringliggende område, herunder halen, for at minimere bakteriel contaminering af instrumenter.
- Tør stedet for hårfjerning og omegn ned med en alkohol prep pad.
- Gentag 2% Chlorhexidin og alkohol trin en gang flere og slut af med en endelig Chlorhexidin tørre ned for i alt tre 2% Chlorhexidin og to alkohol prep pad vaske. Har den endelige Chlorhexidin tørre sådan, at kemikaliet ikke drypper omkring operationsstedet at undgå at få Chlorhexidin på indre organer. BEMÆRK: Anvendelse af store mængder klorhexidin og alkohol til huden og omgivende pels kan resultere i et markant fald i kropstemperaturen. Tør ikke med overskydende volumen under trin 2,7-2,9. Oprethold kropstemperaturen med en varmepude.
- Brug af sterile handsker og en steriliseret skalpel med sterilt klinge, foretage en enkelt 1-inch incision i huden mellem median og sagittalplanet på venstre side af musen, der starter lige under ribbenene og slutter lige over planet for den fjerde lyske- brystkirtel patte.
- Hjælp autoklaveres eller perle steriliserede saks og pincet, lave en lignende 1- tomme snit i peritoneum. Undgå at skære ind i brystfedtpuden og sikre ikke at skære tarmene, leveren, eller mellemgulv.
- Placer en 4 x 4 "gaze vædet i sterilt saltvand i venstre side af musen, hvor indsnit, således at indre organer kan placeres på gaze og ikke kommer i kontakt med huden omkring eller kirurgiske område.
- Forbered tumorceller ved pipettering op og ned flere gange som tumorceller vil nøjes under fremstilling af musen. Forbered en 25 pi aftagelig kanyle sprøjte og 32-gauge kanyle med tumorceller. Skub på sprøjten, indtil tumorceller er ved spidsen af nålen, og stemplet er på det passende volumen til injektion; undgå injektion af luftbobler.
- Tør nålen med en steril alkoholserviet for at fjerne eventuelle eksterne tumorceller. Vær forsigtig for at undgå nålestik.
- Hold median side af snittet, herunder hud og peritoneal foring, til side med pincet og bruge en steril vatpind til forsigtigt at trække de store og små tarme ud, placere dem på steril gaze dyppet i sterilt saltvand. Træk tyktarmen og tyndtarmen, indtil portvenen visualiseres.
- Dæk de indre organer i saltvand gaze at opretholde den interne fugtighed og sterilitet.
- Har en assistent, også iført sterile handsker, holde tarmene indpakket i saltvand gennemblødt gaze forsigtigt ud af vejen med en steril bomuld tippes vatpind til fuldt ud at afsløre portalen vene. Derudover kan det være nødvendigt at anvende den autoklaveret hæmostat eller pincet til at holde væv til side på medianen side af snittet.
- Stik nålen påfyldt med tumor celler ~ 3 - 5 mm ind i portåren ~ 10 mm under leveren i en vinkel <5 ° til venen, med facet opad. Injicer langsomt fuld volumen indeholdende tumorceller. Lad blodet strømme forbi nålen hEAD i flere sekunder for at undgå tilbagestrømning af tumorceller ud af venen. Minimere bevæge nålen i venen under injektionen. Igen, vær forsigtig for at undgå nålestik.
BEMÆRK: Visualisering af portvenen sker uden forstørrelse, men et stereomikroskop kan anvendes, hvis det foretrækkes. - Fjern kanylen samtidig placere en steril vatpind på venen med tryk. Med assistenten stadig holder tarmene til side placere et stykke 0,5-1 cm 2 hæmostatisk gaze over injektionsstedet på venen.
BEMÆRK: hæmostatiske pulver blev også forsøgt til dette trin i protokollen, men var ikke effektive i at stoppe venøse blodtab efter injektion. - Hold den hæmostatiske gaze på injektionsstedet med pres fra en steril vatpind i 5 min.
- Vurdere lukning af venen ved forsigtigt at løfte den hæmostatiske gaze, hvis gaze sticks til det omgivende væv, en lille mængde sterile saltvand kan anvendes til at suge og løfte gaze.
- Hvis blodtab opstår på dette tidspunkt, placere en ekstra stykke hæmostatisk gaze på stedet med presset for yderligere 5 min. Når blodgennemstrømningen er ophørt helt, fjerne gaze fra musen.
BEMÆRK: Blodtab under den kirurgiske procedure, skal vurderes nøje, og hvis det samlede tilladte blodtab volumen er opfyldt eller overskredet (baseret på regulatoriske standardprocedurer for undersøgerens institutionelle anmeldelse boards) musen skal aflives, mens under anæstesi ved hjerteperfusion. - Når injektionsstedet anses intakt, med ingen blod forlader injektionsstedet, placere de indre organer forsigtigt tilbage i bughulen.
- Sutur den peritoneale foring og derefter huden med steril 4-0 Vicryl sutur og tilspidsning nål under anvendelse af en simpel kontinuert eller afbrudt sutur mønster. Typisk lukker snittet kræver 10-15 suturer.
- Indsprøjtes 100 ul Bupivacaine (5 mg / ml) langs snittet site for lokal smertebehandling ved anvendelse af en insulinsprøjte. Injicer 0,5 ml sterilt saltvand subkutant ved anvendelse af en 1 ml sprøjte med 26-gauge nål til hydrering. Kirurgiske indgreb tage 15 - 25 min at fuldføre.
- For at opretholde sterile forhold i hele operationen, sikre, at alle værktøjer og materialer, der kommer i kontakt med musen, herunder behandskede hænder, rengøres passende forud for kontakt. Hvor det er muligt brug sterile materialer og handsker, eller minimalt udnytte en 70% ethanol opløsning eller 10% blegemiddel løsning at rengøre.
- Hvis flere operationer er planlagt for en enkelt session omdannede indledende kirurgiske område med frisk sterilt drapere, insulininjektionssprøjter, 1 ml sprøjter, sterilt saltvand, 2 x 2 "steril gaze svampe, 4 x 4" steril gaze, hæmostatisk gaze skæres i 0,5 - 1 cm 2 stykker, 4-0 Vicryl suturer med koniske nål, og 2% klorhexidin. Perle-sterilisere saks, pincet og hæmostat i mellem operationer og tilladei tilstrækkelig grad afkøle før genbrug.
3. Recovery, Overvågning gnaver Sundhed og endepunkt Analyser
- Efter den kirurgiske procedure er afsluttet, vedligeholde mus på en varmepude til nyttiggørelse i strøelse-fri, rene bure i mindst 20 min. Mus typisk tage 2 - 4 min til at vågne op fra bedøvelsen.
- Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået operation for at co-beboelse med andre dyr, indtil den er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi. Lad ikke et dyr uden opsyn, mens den er genvundet bevidstheden og overvåge, indtil dyret har genvundet evnen til at opretholde sig selv i brystleje.
- Giv mus 0,05 - 0,1 mg / kg buprenorphin til smertebehandling hver 6-12 timer efter operation, i op til 72 timer.
- Check suturer dagligt for at sikre, at de forbliver intakte under heling. I tilfælde af at suturer kommer fortrydes, placere musen under anæstesi, fjerne de resterende suturer, og erstatte. I tilfælde af infektion eller Inflammation konsultere dyrlæge personale.
BEMÆRK: Infektion eller betændelse er ikke stødt på med denne protokol. - For metastase undersøgelser, udføre daglige helbredstjek indtil ydre tegn på metastatisk sygdom observeres herunder, men ikke begrænset til:> 10% vægttab / gevinst, scruffiness, tab af opmærksomhed på omgivelserne, abdominal ødem / ascites, blege øjne og ører, eller en foroverbøjet stilling.
BEMÆRK: Daglige sundhedstjek er især vigtigt, når udviklingen af modellen til brug med en ny cellelinje eller koncentration celle indtil tidslinjen af metastaser er godt forstået. - Ved undersøgelsens endepunkt, aflive mus ved CO 2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation.
BEMÆRK: Alternative metoder til aktiv dødshjælp er godkendt af efterforskernes tilsyn udvalg kan anvendes, herunder perfusion med 1x PBS, mens under anæstesi. Perfusion af leveren udføres ved kanylering portåren, snipping inferior vena cava, og skubbe 1x PBS thru leveren vaskulatur ved en hastighed på 4 ml / min for 1 - 2 min for at fjerne cirkulerende blod og leukocytter.
BEMÆRK: Afhængigt af endpoint for undersøgelsen, den cellelinje, og den anvendte koncentration, åbenlys levermetastaser måske eller måske ikke være synlige ved obduktion. Mikrometastatiske læsioner kan blive afsløret med histologisk analyse af leveren. Endepunkter vil variere baseret på undersøgelsens design. - Uddrag leveren med saks og pincet ved først at fjerne galdeblæren, derefter skære gennem nedre hulvene overlegen til leveren. Skære gennem vena cava, portåren, og hepatiske arterie ringere end leveren.
- Fjern hele leveren forsigtigt og vask 5x i 1x PBS.
- Adskil leveren til venstre, højre, median, og putamen lapper.
- Formalin fix lever i 10% neutral bufret formalin i 48 timer under omrystning ved stuetemperatur. Proces væv gennem en række alkoholer i stigende koncentration og xylen; paraffin indlejre fikseret væv 71 BEMÆRK: Alternativt leveren kan snap-fryses ved at placere væv i en kryoformen med optimal skære temperatur (OLT) formel og frysning på tørispellets nedsænket i 95% ethanol.
- Ved hjælp af en mikrotom, skåret i paraffin indlejret væv blok, således at et match-hovedstørrelse af væv afsløres.
- Skær fem 4-micron serielle snit, dette udgør det første niveau til analyse.
- Skær gennem 250 mikron væv, smide disse sektioner i affaldet.
- Ved 250 mikron skære en andet niveau på fem 4-um serielle snit.
- Gentag om nødvendigt til snit gennem hele leveren. Hematoxylin og eosin pletten den første del af hvert niveau for at vurdere for metastaser 72.
BEMÆRK: snap-frosne væv bruge en kryostat at skære sektioner.
BEMÆRK: Påvisning af mikrometastatisk sygdom vil kræve tumorcelle specifik farvning.
- Fjern mus fra undersøgelsen, hvis der er tumorvækst ved indsnit siddee, da det indikerer tumorcelle lækage ind i bughulen efter injektion.
BEMÆRK: er ikke blevet observeret Dette problem.
Representative Results
Portåren injektion model, hvor tumorceller leveres direkte til leveren via en kirurgisk procedure, giver mulighed for tumorcelle injektion i portåren. Under antiseptiske betingelser i en bedøvet mus, er en ~ 1-inch kirurgisk indsnit på venstre side af musen mellem median og sagittalplanet, begyndende lige over planet for den fjerde lyske- mælkekirtel patten og slutter lige under ribbenene . De store og små tarme bliver forsigtigt trukket gennem snittet for at tilvejebringe visualisering af portåren (figur 1A). Nøjagtig anatomisk identifikation af portåren og vellykket intra-portal injektion kan bekræftes ved at praktisere injektionsprotokollen med tusch eller et lignende farvestof. Korrekt injektion via portåren vil resultere i trykfarven bliver leveret øjeblikkeligt og specifikt til leveren, og vil ikke resultere i tusch spredning til lungerne (Figure 1B). Yderligere, ved anvendelse D2A1 musebrysttumor celler mærket med GFP, spredning af tumorceller i hele leveren er tydelig ved halvfems minutter efter injektion, hvilket bekræfter portal vene injektion levering til leveren (figur 1C). Ved højere forstørrelse viser sig, at ved 90 min efter injektion, tumorceller inden sinuskurver, såvel som inden for leverparenkym i umiddelbar nærhed af portal triader, hvor portåren blod ind i leveren (figur 1C). Disse data antyder, at aktiv tumorcelle ekstravasation forekommer ved 90 minutter efter tumorcelleinjektion. Tilsammen bekræfter disse data, at portalen vene injektion model leverer injektionsvolumen direkte til leveren, med blæk eller tumorceller dispergeret i hele leveren og ingen mærkbar transport af injektionsvolumen til lungen.
For at vurdere robustheden af portalen vene injektion model, tre separspiste syngene mus brysttumorcellelinier blev testet i voksne Balb / c-mus. Disse mammae tumor linier blev udvalgt på grundlag af deres karakteriseret adfærd i brystfedtpude modeller og omfatter den meget aggressive og metastatisk 4T1 cellelinje, jo mindre aggressive metastatisk D2A1 linje, og det lave / ikke-metastatisk D2.OR linje 37,61,73 , 74. 2.000 og 10.000 celler pr injektion blev testet med nogen bemærkelsesværdige forskelle i tid til udvikling af åbenlys metastaser med disse lave koncentrationer celle. Til disse undersøgelser surrogatmarkører for metastase blev anvendt som manglende grooming, bleghed, og vægttab at retfærdiggøre obduktion, hvorpå tilstedeværelsen eller fraværet af levermetastaser blev bekræftet ved visuel vurdering af leveren og andre organer til at bekræfte intra-portal levering . Disse data bekræfter tidligere rapporter, at 4T1 og D2A1 cellelinjer repræsenterer mere aggressive brystkirtler tumor linjer, som kortere metastase gratis overlevelsesrater observeres i forhold til mus injiceretmed mindre aggressive D2.OR linje (figur 2A). Mus injiceret med 4T1 eller D2A1 tumorceller udviklet åbenlys levermetastaser ved ~ 30 - 40 dage efter injektion, og nogle udviklede metastase så tidligt som 18 dage efter injektion (figur 2A), hvorimod kun en mus injiceret med D2.OR celler havde udviklede åbenlys levermetastaser ved undersøgelsens afslutning, som var 60 - 65 dage efter tumorcelleinjektion. Metastaser blev efterfølgende bekræftet ved sektionering gennem leveren i 250 um niveauer og analysere hematoxylin og eosin (H & E) farvede snit (figur 2B-D).
Foruden påvisning af åbenlyse metastatiske læsioner i muselever, kan portåren modellen også anvendes til at studere tidligere begivenheder i den metastatiske kaskade herunder påvisning af enkelt celler / celleklynger efter ekstravasation, og dannelse af mikro-metastatisk læsioner. Multiplex immunfluorescens-farvning blev anvendtat detektere 4T1, D2A1, og D2.OR brysttumorceller i leveren, når de er til stede som enkelte celler eller mikroorganismer metastatisk læsioner, som H & E ikke er tilstrækkeligt til at bekræfte tilstedeværelsen af små læsioner. Figur 3A viser et repræsentativt Balb / c-mus lever med en formodet mikrometastatisk foci af D2A1 tumorceller, der er positive for epithelial keratin CK18, negative for pan-immune markør CD45, og negativ for hepatocyt markør Heppar-1. Hepatocytter også farvet positive for CK18, hvilket nødvendiggør anvendelse af Heppar-1 i denne farvning panel. Én vigtig bemærkning er, at galdegang epitel og lever stamceller pletten positive for CK18, der kræver omhyggelig forskelsbehandling mellem tumorceller og galdegange, især ved vurderingen periportale regioner (figur 3A). Et alternativ til multiplex immunofluorescens at identificere enkelte disseminerede celler og mikrometastatisk foci er at anvende syngene brysttumor linjer mærket med forstærket grønt fluorescerendeprotein (eGFP) og / eller luciferase og udfører IHC for mærket (figur 1C). På grund immunogenicitet eGFP, luciferase, og andre proteiner, er det vigtigt at anvende musemodeller, der er gjort tolerante for disse proteiner, såsom hidtil ukendte immune kompetente "glødende hoved" mus, der udtrykker eGFP og luciferase i hypofyseforlappen 75. Til identifikation af macrometastatic læsioner af ukodede syngene linjer såsom D2A1 tumor linje, den CK18 / Heppar-1 / CD45 multiplex immunfluorescens er ideel (figur 3B).
Figur 1: Portal Vein Injection Leverer tumorceller Direkte til leveren. A) portåren injektion; snittet er foretaget mellem median og venstre sagittalplanet, fra over planet for den fjerde lyske- mælkekirtel patten og slutter lige under riB bur. B) Balb / c leveren med PBS injektion (venstre). Efter Indien blæk injektion via portåren, leveren (midten), men ikke i lungen (højre) optager blæk. C) Repræsentative Tyndslib billeder af D2A1 musebrysttumor celler mærket med GFP i en Balb / c-muselever ved 90 min efter injektion af 1 x 10 6 tumorceller via portåren. Leverne blev fikseret i formalin, indlejret i paraffin, snittet og farvet med anti-GFP-antistof til tumor- celle-detektion. Top panel viser mørkebrune farvede tumorceller (pile) spredt over hele leveren, stjerne angiver uspecifik hepatocyt farvning omkring centrale vener; skala bar = 300 um. Lavere paneler viser repræsentative billeder af tumorceller ved 90 min efter injektion stadig tæt forbundet med vaskulaturen; skala bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: udvækst af Mouse brysttumorcellelinier i leveren og følger Portal Vein Injection. A) Kaplan-Meier kurve, der viser metastase-fri overlevelse i mus injiceret med 2000-10000 4T1, D2A1 eller D2.OR musebryst tumorceller. Mus blev injiceret med tumorceller og overvåges for tegn på metastase, herunder mangel på grooming, blege øjne, og vægtændringer. Metastase blev bekræftet på tidspunktet for obduktion og af H & E på histologiske snit af leverne. N = 2 4T1 2.000 celler; 2 4T1 10.000 celler. N = 2 D2A1 2000 celler; 3 D2A1 10.000 celler. N = 3 D2.OR 2000 celler; 3 D2.OR 10.000 celler. Repræsentativ H & E billeder af B) 4T1 læsioner på 21 dage efter injektion af 10.000 celler, C) D2A1 læsioner på 26 dage efter injektion af 10.000 tumorceller, og D) D2.OR læsioner på59 dage efter injektion af 10.000 celler; skala barer = 75 um. Lignende læsioner observeres, når 2.000 4T1 eller D2A1 tumorceller blev injiceret. Ingen læsioner blev detekteret med 2.000 D2.OR celler. Intet bevis for metastase i andre organer eller på det kirurgiske indsnit webstedet var tydelig i nogen mus på disse studier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Påvisning af enkelte celler og metastaselæsioner i Mouse Lever hjælp Multiplex Immunofluorescens. A) repræsentant multiplex immunofluorescens af D2A1 tumorceller i en Balb / c-muselever ved 90 min post-injektion under anvendelse portåren injektion model. Farvning blev udført under anvendelse af en multiplex-kit. Fra venstre mod højre viser DAPI; CD45 at markere leukocytter; Heppar-1 til mark hepatocytter; og CK18 at markere tumorceller, hepatocytter og galdegang epitel. Flettet billede viser en formodet klynge af CK18 + Heppar-1 - CD45 - D2A1 tumorceller tæt forbundet med en portal triade. Pil = D2A1 tumorceller, stjerne = galdegang epitel; skala bar = 25 um. B) En repræsentant åbenlys D2A1 metastatisk læsion ved hjælp af den samme farvning panel som i A. tumorceller CK18 + mens tilstødende hepatocytter er CK18 + Heppar-1 +; skala bar = 25 um. Billeder blev indfanget på et mikroskop med 20 x 0,8, 40 x 1,3, og 60 x 1,4 mål og CCD-kamera, ved hjælp af mikroskop software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Balb / c-mus portal vene injektion model tillader studiet af brystkræftcellers læsioner i leveren i fravær af confounding multiorgansystemer metastase og i en helt immun kompetent vært. Vores protokol er en fremrykning af tidligere offentliggjorte kirurgiske procedurer, der tillader adgang til portåren til injektion af tumorceller direkte ind i leveren 16,55,56. Et avancement vi har gjort, er at reducere antallet af injicerede tumorceller fra ≥ 1 x 10 5 celler / injektion 16,55,56 ned til ≤ 10.000 tumorceller / injektion. Vi har også udvidet modellen for studiet af brystkræft metastase til leveren. Ved hjælp af denne protokol, to mammae cancer cellelinjer med kendt metastatisk potentiale udvikle levermetastaser med kortere ventetid end en mere hvilende brystkirtler tumor cellelinje. Endvidere ved tidlige tidspunkter, tumorceller fordelt over hele leverparenkym som enkelte eller små grupper af enkelt ceLLS efter tumorcelleinjektion. Modellen er klar til at behandle spørgsmål af metastatisk effektivitet herunder tumorceller ekstravasation, celleoverlevelse, hviletilstand, og proliferation - alle fænotyper, der bidrager til udviklingen af mikro-metastatisk og åbenlys metastatisk sygdom i leveren.
Det er vigtigt at overveje mange aspekter af den inden der påbegyndes undersøgelser portal vene injektionsprotokol. Omhyggeligt træffes beslutning om cellelinjer, koncentration celle, total celle nummer, og de endelige interessepunkter baseret på mindre forundersøgelser er stærkt anbefales. Endvidere er anvendelsen af immunkompetente værter og syngene cellelinjer er af største betydning for forståelsen vært-tumor celle-interaktioner. Den nyudviklede "glødende hovedet" mus, der udtrykker eGFP og luciferase fra den forreste hypofyse er et vigtigt redskab til at fjerne vært reaktioner på eksogene eGFP og luciferase, proteiner ofte bruges til at mærke brysttumor linier 75
Det er vigtigt at bemærke, at portåren injektion model ikke replikere hele metastatisk kaskade, men er begrænset til studiet af tumorcellen ekstravasation, tumor celle-niche interaktioner efter ekstravasation og tumorvækst. Modeller, der præcist replikerer den fulde metastatisk kaskade til leveren, såsom forekommer i patienter, der er et presserende behov for. En yderligere begrænsning af portalen vene injektion model er, at den er forstyrret af virkningen af kirurgi på værten, med sårheling vides at påvirke sygdommens progression 76,77.
Portalen vene injektion model repræsenterer en forbedring på anden injektionmodeller til at studere levermetastaser, herunder intrakardiale og milten modeller. Specifikt portåren injektion model giver mulighed for studiet af et større udvalg af sygdomsprogression end intrakardial model, som ofte begrænset af samtidige metastaser i andre væv. Endvidere er portåren modellen ikke kompliceres ved fjernelse af milten, som det sker i den milten model.
Portalen vene injektion model kan vise sig et nyttigt redskab for studiet af levermetastaser i almindelighed. Levermetastaser er den hyppigste sted for metastase i adenocarcinomer samlet, med særligt høje frekvenser i pancreascancer (85% af metastaser er til leveren), colon og rektal adenocarcinomer (> 70%), samt mave og esophageal (> 30 %) 1. Selvom spontane og ortotopisk primære tumor modeller af pancreas og colon adenokarcinomer lettere metastaserer til leveren 78,79, kan portalen vene injektion model prove nyttigt at forstå den metastatiske proces af disse kræftformer kontrolleret levering af tumorceller tillader biokemiske, molekylære og histologiske vurderinger på bestemte tidspunkter efter tumor celle ankomst. Sammenfattende portalen vene injektion model repræsenterer en vigtig forbedring på tilgængelige levermetastaser modeller af brystkræft, og kan også være gældende for den levermetastaser område i almindelighed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
| Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously |
| Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site |
| anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
| Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
| Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
| Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
| anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
| Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
| DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
| Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
| Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
| Heating Pad, x 2 - 3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
| Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
| Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
| Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
| Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
| Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
| Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
| Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
| Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
| Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
| Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
| Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
| Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
| Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
| Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
| Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
| Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
| Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
| Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
| Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |
References
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
- Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
- Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
- Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
- Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
- Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
- Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
- Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
- Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
- Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer--a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
- Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature reviews. Cancer. 4, 448-456 (2004).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
- Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
- Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
- Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489 (2014).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15, 73-86 (2015).
- Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
- Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
- Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
- Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
- Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
- Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
- Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
- Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
- Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. , e4260 (2012).
- Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
- Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
- Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677 (2014).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469 (2015).
- Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
- Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
- Coligan, J. E., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
- Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
- Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
- Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
- Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
- Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960 (2015).
- Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35 (2016).
- Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
- Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
- O'Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
- Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
- Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
- Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
- Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
- Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
- Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18, 1286-1294 (2012).
- Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32, 39-61 (2013).
