Abstract
Brustkrebs ist die häufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle bei Frauen weltweit. 15 Monate - Lebermetastasen wird in nach oben von 30% der Fälle mit Brustkrebs-Metastasen und führt zu schlechten Ergebnissen mit einer medianen Überlebensrate von nur 4,8 beteiligt. Aktuelle Nagetiermodellen von Brustkrebs Metastasen, einschließlich der Primärtumorzelle Xenotransplantat und spontane Tumormodellen, selten in die Leber metastasieren. Intrakardialer und intralienale Injektion Modelle haben zur Folge Lebermetastasen, aber diese Modelle durch die gleichzeitige Sekundär Ort Metastasierung verwechselt werden kann, oder durch eines geschwächten Immunsystems aufgrund der Entfernung der Milz Tumorwachstum an der Injektionsstelle zu vermeiden. Um der Notwendigkeit einer verbesserten Lebermetastasen Modelle, eine murine Pfortader Injektionsverfahren, das zunächst Tumorzellen liefert und direkt in die Leber entwickelt wurde. Dieses Modell liefert Tumorzellen in die Leber ohne Komplikationen von gleichzeitigen Metastasen in anderen Organen oder Entfernung der Milz. Die Optimierte Pfortader Protokoll verwendet kleine Einspritzmengen von 5 bis 10 & mgr; l, ≥ 32 Gauge-Nadeln und hämostatischen Gaze an der Injektionsstelle zu steuern, um den Blutverlust. Die Pfortader Injektions Ansatz in Balb / c weiblichen Mäusen unter Verwendung von drei syngenen Brusttumorlinien unterschiedlicher metastatischen Potential getestet wurde; Hoch metastasierendem 4T1 Zellen, moderate metastasiertem D2A1 Zellen und niedrigem metastatischen D2.OR Zellen. Die Konzentrationen von ≤ 10.000 Zellen / Injektion führt zu einer Latenzzeit von ~ 20 bis 40 Tage Entwicklung von Lebermetastasen mit den höheren metastasierendem 4T1 und D2A1 Linien und> 55 Tage für die weniger aggressive D2.OR Linie. Dieses Modell stellt ein wichtiges Instrument Brustkrebs Metastasen in der Leber zu studieren, und kann auch auf andere Krebsarten anwendbar sein, die in die Leber darunter Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsen Adenokarzinome häufig metastasieren.
Introduction
Brustkrebs Metastasierung in die Leber
Die Leber ist eine gemeinsame Website von Brustkrebs Metastasen, zusammen mit Knochen und Lunge 1-3. Lebermetastasen bei Brustkrebspatientinnen ist ein unabhängiger prognostischer Faktor für die sehr schlechte Ergebnisse 4,5, als mediane Überleben von Brustkrebspatienten mit Lebermetastasen im Bereich von 4,8 bis 15 Monate 6-9. Im Gegensatz dazu haben Brustkrebs Patienten mit Lungen- oder Knochenmetastasen mediane Überlebensraten von 9 zur 27,4 Monate 8,9 und 16,3 zu 56 Monate 8,10-12 sind. Metastasierung ist ein mehrstufiges Verfahren, bezeichnet als der metastatischen Kaskade, die mit Tumorzelldissemination im Primärtumor beginnt und endet mit Patientensterblichkeit aufgrund der Aussaat und Auswachsen der Tumorzellen innerhalb eines entfernten Organs 13-15 zirkuliert. Nagetiermodellen von Metastasen haben ergeben, dass die metastatischen Kaskade bemerkenswert ineffizient ist, mit nur 0,02 bis 10%zirkulierender Tumorzellen Festlegung manifester Metastasierung 16,17. Ein wesentlicher Engpass von metastasierendem Ineffizienz wird durch die einzigartige Gewebemikroumgebungen an sekundären Standorten diktiert, metastasierendem Nischen 18 genannt, was die Bedeutung des Verständnisses ortsspezifische Metastasierung. Die metastatischen Nische zum Ort des erneuten Auftretens einzigartig ist, und wird teilweise durch Ablagerung von verschiedenen extrazellulären Matrixproteinen 19,20, Infiltration verschiedener Immunzellpopulationen 21-23, und veränderte Gewebshomöostase einschließlich dysregulated Produktion zahlreicher Zytokinen, Chemokine und Wachstumsfaktoren 15,18,24,25. Somit voran ein Verständnis der gewebsspezifische metastatic Nische zu verstehen, wie Metastasen abzuzielen. Allerdings robuste Modelle von Lebermetastasen fehlen. Des Weiteren wird eine verbesserte Modelle von Lebermetastasen zu Identifizierung neuer Ziele und wirksame Behandlungen für Brustkrebspatienten wi wesentlich seinth Lebermetastasen.
Etablierte Modelle Metastasierung von Brustkrebs in die Leber zu studieren
Derzeit verfügbare Modelle Metastasierung von Brustkrebs zu untersuchen, um die Leber menschlichen Krebszelle Xenotransplantate in immungeschwächten Mäusen enthalten. Diese Modelle verwenden in der Regel gut untersuchten menschlichen Brustkrebszelllinien wie MCF-7 und MDA-MB-231 und Nude, Rag1 - / - oder SCID immungeschwächten Maus - Wirte 26-29. Xenograft - Modelle bieten den Vorteil der Menschen abgeleitet Krebszelllinien beteiligt, aber die jüngste Aufwertung für Immunzellen bei der Metastasierung gegeben 30-32 und in der therapeutischen Widerstand 33-35, die Untersuchung der Metastasierung in einem vollständig immunkompetenten Wirt ist von größter Bedeutung. Modelle für Brustkrebs Metastasen in der Leber in immunkompetenten Wirten umfassen orthotope Injektion von syngenen Tumorzellen (zB 4T1 und D2A1 Zelllinien) in das Brustfettpolster, mit oder ohne chirurgischen studierenResektion des Primärtumors und die anschließende Beurteilung der Metastasierung 36-38. Zu beachten ist , ist die Rate von Lebermetastasen aus orthotope Transplantation Modelle sehr gering oder gar nicht vorhanden im Vergleich zu anderen metastatischen Stellen wie Lunge 39,40, oder tritt nach ist Lungenmetastasen festgestellt, die Untersuchung der leberspezifischen Metastasierung zu verkomplizieren 37,39 .
Tumor-Explantate von spontanen gentechnisch veränderten Brustkrebs-Modelle können in die Brustfettpolster von naiven Wirte als syngenen Tumorzellen wieder injiziert werden. Zum Beispiel wurde kürzlich berichtet , dass die spontane Tumoren von K14 Cre ECAD f / f P53 f / f Mäuse, die Modell - invasiven lobulären Mammakarzinom, Tumoren entwickeln , wenn orthotop in Wildtyp- Wirte injiziert. Nach chirurgischer Resektion dieser Tumoren , wenn sie 15 mm 2 erreicht, 18% der Mäuse fortgeschritten , um Lebermetastasen 40,41. Ein dritter Ansatz Lebermetastasen nutzt zu modellierenspontane Metastasierung in gentechnisch veränderten Mäusen. Bis heute Berichte von spontanen murine Modelle von Brustkrebs Metastasen, die leicht auf die Leber ausgebreitet sind selten. Ausnahmen schließen die H19-IGF2, die p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre und die K14 Cre eCAD f / f P53 f / f gentechnisch veränderte Maus - Modellen, in denen Lebermetastasen in einem geringen Prozentsatz von Mäusen entwickelt 38,41- 43. Während also genetisch veränderte Mausmodelle die Untersuchung von allen Stadien der metastatischen Kaskade und bietet leistungsfähige und klinisch relevante Modelle zu erleichtern, sind sie aufgrund der niedrigen Raten von Lebermetastasen 38 begrenzt.
Mehrere Metastasierung Modelle umgehen die ersten Schritte der metastatischen Kaskade einschließlich der Verbreitung von Tumorzellen aus dem Primärtumor und intravasation. Diese Modelle erlauben Untersuchung in die späteren Schritte der metastatischen Kaskade von Extravasation Einrichtung von Tumoren an sekundären Standorten. Der intracardiac Injektions Modell liefert Tumorzellen in den linken Ventrikel, die über die Aorta Tumorzellen in das Kreislaufsystem verteilt. Intrakardial erfordert Ultraschall-geführte Bildgebung der Injektionsstelle oder andere bildgebende Verfahren wie Biolumineszenz von Luciferase-Zellen getaggt erfolgreich Injektion zu bestätigen. Die Tumorzellinjektion über den linken Ventrikel kann in Knochen führen, Gehirn, Lunge und / oder Lebermetastasen unter anderen Organen 44-48. Aufgrund der Multi-Organ Metastasen, müssen diese Mäuse häufig vor der Entwicklung einer manifesten Lebermetastasen eingeschläfert werden, negiert die Fähigkeit zur vollständigen Metastasenwachstum in der Leber zu untersuchen. Ein alternativer Ansatz, der die Entwicklung von Multi-Site-Metastasierung signifikant minimiert, ist die intralienale Injektion Modell. Intralienale Injektion liefert über die Milzvene Tumorzellen , die mit der mesenterica superior verbindet 49,50 die Pfortader zu werden. Die Tiere können für outgr überwacht werdenowth von Metastasen in der Leber , da die Bildung an anderen Standorten von Metastasen ist selten, und als Ergebnis, den allgemeinen Gesundheitszustand des Tieres 49,50 gehalten. Allerdings ist es wichtig , dass das intralienale Modell Splenektomie Milztumoren 49,50, ein Verfahren , die Auswirkungen auf die Immunfunktion zu vermeiden , erfordert zu beachten. So wird beispielsweise myokardiale Ischämie Reperfusionsverletzung durch Infiltration von Ly6C + Monocyten Teilmengen aus , die aus der Milz und sind verantwortlich für die phagozytische und proteolytischen Aktivität während der Wundheilung nach Ischämie 51,52 stammen. Mit Splenektomie, gibt es eine beobachtete Reduktion der Monozyten - Populationen, die in Wundheil 52 unterstützen. Ferner wurde Splenektomie Primärtumorwachstum und Lungenmetastasen in einem nicht-kleinzelligen Lungenkrebs - Modell, und zwar durch eine Verringerung der Anzahl von zirkulierenden und Intratumor CCR2 + CD11b + Ly6C + monozytären myelo zu reduzieren gezeigtid Zellen 53. Zusätzlich führte Splenektomie folgende intralienale Injektion von Kolonkarzinomzellen in reduzierten Mengen an Anti-Tumor - natürlichen Killerzellen in mesenterischen Lymphknoten und erhöhte Lebermetastasen 54. In Summe legen diese Ergebnisse nahe, dass Splenektomie das Immunsystem die Rolle mit weiteren Folgen für metastatischen Zellschicksal Kompromisse.
Pfortader Injection Modell von Lebermetastasen
Um Brustkrebs Metastasen in der Leber in einem vollständig immunkompetenten Wirt, unter Bedingungen, bei denen Mäuse nicht beeinträchtigt werden durch Multi-Organmetastasen, eine Pfortader Injektion Modell untersuchen entwickelt. Intraportale Injektion Modelle wurden zuvor zu studieren Lebermetastasen von kolorektalen 55,56 und Melanom 16 Zelllinien verwendet werden; wir hier Anwendung der intraportale Injektion beschreiben zu syngenen Brusttumorzelle Metastasen modellieren. Dieses Modell kann verwendet werden, um zu studierendie späteren Stadien der metastatischen Kaskade einschließlich Brustkrebs-Zell Extravasation und Säen, Tumorzellschicksal Entscheidungen in Bezug auf den Tod / Proliferation / dormancy und Auswuchs in offene Läsionen. In diesem Modell werden syngenen Brusttumorzelllinien über die Pfortader von immunkompetenten Balb / c weibliche Mäuse, ein Verfahren injiziert , die zunächst Tumorzellen liefert und direkt in die Leber ohne Entfernung der Milz. Um dieses Modell zu entwickeln, die Verwendung von vier Brusttumorzelllinien, die von niedrig bis hoch in ihre metastatische Fähigkeit reichen wurden eingesetzt: D2.OR, D2A1 und 4T1, und haben D2A1 getaggt mit grün fluoreszierende Protein (D2A1-GFP) eingesetzt untersuchen frühen Zeitpunkten nach der Injektion der Tumorzellen. 4T1 ist ein hochmetastatisch vom 410,4 Tumor abgeleitete Zelllinie , die in einem MMTV + weibliche Balb / c Maus 36,37 entstanden spontan und metastasiert auf Lunge, Leber, Gehirn und Knochen von Brust 39,57,58 Primärtumoren Fettpolster. D2A1 Tumorzellen WERe auch ursprünglich aus einem spontanen Mammatumor abgeleitet in einer Balb / c - Host nach der Transplantation von D2 hyperplastischen alveolaren Knötchen Zellen entstehen, und bestätigt aus dem Primärtumor in die Lunge 59,60 metastatic sein. D2.OR Tumorzellen sind eine nicht-metastasierten Schwester Linie auf die D2A1 Linie , und obwohl sie den Primärtumor zu entkommen und an sekundären Standorten kommen, aber nur selten Fernmetastasen 60,61 etablieren.
Darüber hinaus ist es wichtig, die Verwendung von allgemein verwendeten Schmerz Arzneimittel, einschließlich nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs) während oder nach dem chirurgischen Eingriff zu vermeiden. NSAIDs haben Antitumor-Aktivität in bestimmten Brustkrebs 62-65, und einige Klassen von NSAIDs erhöhen das Risiko für Hepatotoxizität 66,67, möglicherweise die Studie von Lebermetastasen zu beeinträchtigen und die Leber metastasiertem Nische. Ferner Studien deuten darauf hin, dass direkt das Gewebe Mikroumgebung beeinflussen NSAIDs, pro-metastatischen ext reduziertracellular Matrixproteine Tenascin-C 68 und fibrillärem Kollagen 62,65. Alternativ wurde wegen seiner Wirksamkeit in rodent Schmerzmanagement 69 und aufgrund des Mangels an Beweisen die Verwendung eines Opioid - Derivat, Buprenorphin, verwendet , dass Opioide 70 Antitumoraktivität aufweisen. Diese Injektion Modell Pfortader wurde für kleinere Injektionsvolumina von 5 optimiert - 10 & mgr; l, um unnötige Schäden an der Leber zu vermeiden. Das Modell wurde auch Nadeln optimiert umfassen mit kleinerem Durchmesser (≥ 32 gauge) und die Verwendung von hämostatischen Gaze unmittelbar nach der Injektion der Blutverlust während des Verfahrens zu minimieren. Im Gegensatz zu diesen optimierten Einspritzparameter, die Zellzahlen sollte auf individueller Basis bestimmt werden, bezogen auf das tumorigene Potential der Zelllinie. Jedoch für Langzeitstudien bei ≤ 10.000 Zellen / Injektion beginnend empfohlen. Für kürzere Endpunkten (beispielsweise 24 h post-Injektion) erheblich mehr Tumorzellen (zB1 × 10 5 - 1x 10 6) kann , falls erforderlich auch verwendet werden. Zusammengefasst detailliert die Pfortader Injektion Modell stellt hier ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Brustkrebs Metastasen in der Leber und umgeht eine Reihe von Einschränkungen anderer Lebermetastasen Modelle. Dieses Modell ermöglicht Untersuchung der Tumorzelle Extravasation, Säen, frühe Schicksal Entscheidungen des Überlebens, Proliferation und Dormanz und metastatischen Auswuchs in immunkompetenten Maus-Hosts.
Protocol
Alle tierischen Verfahren in diesem Artikel wurden von der Oregon Health & Science University Institutional Animal Care und Use Committee überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung der OP-Bereich und Instrumente
- Bereiten Sie die Scheren, Zangen und hemostat durch Autoklavieren bei 124 ° C für 30 min, 1 - 2 Tage vor der geplanten Operationen. Achten Sie darauf, den Zugang zu autoklavierten oder sterilen Betten, Käfige, und Lebensmittel für postoperative Genesung.
- Bereiten Sie eine aseptische OP-Bereich, vorzugsweise in einem Laminar-Flow-Haube.
- Wischen Sie alle Oberflächen des OP-Bereich mit 10% Bleichmittel, einschließlich des Heizkissen, Lichtquelle, Anästhesie Schlauch und Nasenkegel und einem anderen Teil des chirurgischen Suite, die in unmittelbarer Nähe zu dem chirurgischen Eingriff sein wird, während es wird durchgeführt .
- In der aseptischen OP-Bereich, stellen Sie das gereinigte Heizkissen mit sterilen Tuch, Lichtquelle, Anästhesie Schläuche und nosecone, Insulinspritzen, 1 ml Spritzen, Bupivacain, künstliche Tränen, steriler Kochsalzlösung, 2 x 2 "steriler Gaze Schwämme, 4 x 4" steriler Gaze, hämostatische Gaze Schnitt in 0,5 bis 1 cm 2 Stück, Scheren, Pinzetten, hemostat, 4-0 Vicryl Nähten mit Kegel Nadel und 50 ml 2% Chlorhexidingluconat in einem autoklavierten Behälter.
- Stellen Sie sicher, dass es Raum in diesem Raum für vorbereitete Tumorzellen auf Eis gelagert ist.
- Auf der Bank neben dem OP-Bereich, bereiten Sie die Recovery-Bereich mit einem zweiten Heizkissen und saubere Käfige mit sterilen Betten.
HINWEIS: In diesem Bereich können auch Hausgegenstände wie einen Wulst Sterilisator.
2. Portal Veneninjektion
- Eine Stunde vor der geplanten Injektionen behandeln weibliche Balb / c-Mäuse im Alter von 8 bis 15 Wochen lang mit 100 & mgr; l von 0,015 mg / ml Buprenorphin, subkutan, für die Schmerztherapie.
Hinweis: Dieses Injektionsprotokoll in jedem Alter zu jeder Stamm von weiblichen oder männlichen Maus angewendet werden kann, unter Verwendung der entsprechendenZelllinien für die Änderungen an den Stamm. - Bereiten Sie die Tumorzellen für die Injektion basierend auf Protokolle für die Zelllinie oder Tumor Explantation der Wahl. Testen Sie alle Tumorzelllinien, bevor auf die Anwesenheit von Maus-Krankheitserreger auf die Verabreichung das Risiko der Einführung solcher Pathogene in die Tierkolonie zu reduzieren.
- Für syngenen Balb / c-Tumorzelllinien, einschließlich D2A1, D2.OR und Tumorzellen 4T1, Tauwetter Zellen in eine 10 cm-Gewebekulturplatte 3 Tage vor der Injektion, so dass die folgenden Tag-Zellen bei ~ 90 sind - 100% Konfluenz.
- 1 Tag nach der Tumorzell thaw wash Zellen einmal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), und die konfluent Tumorzellen unter Verwendung von 2 ml 0,05% Trypsin bei 37 ° C für 5 min trypsinize. In 8 ml Vollmedium (DMEM hohe Glucose, 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin) und Passage 01.10 in ein frisches 10-cm-Schale mit 10 ml komplettem Medium.
- Am Tag der Injektionen, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und trypsinize wie oben beschrieben.
- Resuspendieren trypsiniert Zellen in 8 ml komplettem Medium, Spin für 5 min bei 1500 × g, entfernen Sie die Medien und resuspendieren in 5 ml 1x PBS.
- Zählen von Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss für Rentabilitätsprüfung. Die Zellen für die Injektion in 1x PBS bei einer vorbestimmten Konzentration und Volumen.
HINWEIS: 5 - 10 & mgr; l wird empfohlen, da kleinere Injektionsvolumina unnötige Schäden an der Leber zu verhindern. - Halten Zellen auf Eis für die Dauer der Einspritzungen. Nach Beendigung der Injektionen, Rückkehr einer Probe von Zellen ins Labor und in Kultur in Komplettmedium für 1 Tag Lebensfähigkeit zu gewährleisten.
- Platzieren Sie die Maus unter Anästhesie mit 2-2,5% Isofluran (2-Chlor-2- (Difluormethoxy) -1,1,1-Trifluor-Ethan) in Sauerstoff geliefert. Pflegen Körpertemperatur das Heizkissen verwenden. Stellen Sie sicher, komplette anesthetization für eine Reaktion durch die Bewertung zu einer Zehe Prise, und dann halten anesthesia bei 2 - 2,5% Isofluran.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Tiere die Atemfrequenz zu überwachen und die Isofluran Flussrate entsprechend während des gesamten Verfahrens einzustellen. - Legen Sie eine kleine Menge von künstlichen Tränen oder Tierarzt Salbe über jedem Auge ein übermäßiges Austrocknen der Augen während des chirurgischen Eingriffs zu vermeiden.
- Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf dem Rücken mit Bauch ausgesetzt.
- Entfernen Haare auf der ventralen linken Seite des Nagetier aus der zweiten Rippenraum bis zum 4. inguinal Nippel Brustdrüse durch den Bereich mit chemischen Enthaarungscreme Abwischen. Lassen Sie das Enthaarungsmittel für 1 zu sitzen - 2 min und entfernen Sie dann vollständig mit Gaze und H 2 O. Dieser Schritt kann 1 erfolgen - 2 Tage im Voraus , Zeit zu sparen , wenn zahlreiche Operationen geplant.
- Nehmen Sie eine 2 x 2 "steriler Gaze Schwamm (getränkt in 2% Chlorhexidin) und wischen Sie die Maus an der Stelle der Haarentfernung. Sterilisieren Sie die gesamte Umgebung, einschließlich der Schwanz, bakterielle cont zu minimierenAminierung von Instrumenten.
- Wischen Sie die Website der Haarentfernung und Umgebung nach unten mit einem Alkoholtupfer.
- Wiederholen Sie 2% Chlorhexidin und Alkohol Schritte noch einmal und beenden mit einem abschließenden Chlorhexidin abzuwischen für insgesamt drei 2% Chlorhexidin und zwei Alkoholtupfer wäscht. Sie die endgültige Chlorhexidin wischen, so dass die Chemikalie nicht um die Operationsstelle tropft immer Chlorhexidin auf die inneren Organe zu vermeiden. HINWEIS: Anwendung von großen Mengen an Chlorhexidin und Alkohol auf die Haut und die umgebenden Fell in einem signifikanten Abfall der Körpertemperatur führen kann. Nicht mit überschüssiges Volumen während der Schritte 2,7-2,9 wischen. Pflegen Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen.
- Mit einer sterilen Handschuhe und ein sterilisiertes Skalpell mit sterilen Klinge, machen einen einzelnen 1-Zoll-Schnitt in die Haut zwischen den mittleren und Sagittalebene auf der linken Seite der Maus starten, gerade unterhalb der Rippen und knapp oberhalb der Ebene der vierten Leistenende Brustdrüse Zitze.
- Mit autoklaviert oder Wulst Schere und Pinzette sterilisiert, machen eine ähnliche 1-Zoll-Schnitt in das Peritoneum. Vermeiden Sie in das Brustfettpolster schneiden und gewährleisten nicht den Darm, Leber oder Membran zu schneiden.
- Legen Sie eine 4 x 4 "Mullbausch getränkt in steriler Kochsalzlösung auf der linken Seite der Maus, wo der Schnitt gemacht wurde, so dass die inneren Organe können auf die Gaze gelegt werden und nicht in Kontakt mit der umgebenden Haut oder Operationsbereich.
- Bereiten Tumorzellen durch Auf- und Abpipettieren mehrmals als Tumorzellen während der Herstellung der Maus absetzen. Bereiten Sie eine 25 & mgr; l abnehmbare Nadelspritze und 32-Gauge-Nadel mit Tumorzellen. Schieben auf der Spritze, bis Tumorzellen an der Spitze der Nadel und der Kolben ist auf der geeigneten Volumen für die Injektion; vermeiden Injektion von Luftblasen.
- Wischen Sie die Außenseite der Nadel mit einem sterilen Alkoholtupfer alle externen Tumorzellen zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, Nadelstiche zu vermeiden.
- Halten Sie die mittlere side des Einschnitts, einschließlich Haut und Peritonealüberzug, beiseite mit der Zange und ein steriles Wattestäbchen vorsichtig die Dick- und Dünndarm zu ziehen, so dass sie auf dem steriler Gaze Platzierung in steriler Kochsalzlösung getränkt. Ziehen Sie Dick- und Dünndarm, bis die Pfortader sichtbar gemacht wird.
- Decken Sie die inneren Organe in der Salz getränkten Gaze interne Feuchtigkeit und zur Aufrechterhaltung der Sterilität.
- Haben Sie einen Assistenten, auch sterile Handschuhe tragen, halten die in der Kochsalzlösung getränkten Gaze gehüllt Darm sanft aus dem Weg mit einem sterilen Wattetupfer vollständig die Pfortader offenbaren. Zusätzlich kann es notwendig sein, die autoklaviert hemostat oder Zange zu verwenden Gewebe zu halten beiseite auf der medialen Seite des Einschnitts.
- Führen Sie die Nadel mit Tumorzellen ~ 3 geladen - 5 mm in die Pfortader ~ 10 mm unterhalb der Leber in einem Winkel <5 ° zur Ader, mit Fase nach oben zeigt. injizieren Sie langsam das volle Volumen Tumorzellen enthält. Das Blut an der Nadel vorbei h fließenead für mehrere Sekunden Fluss von Tumorzellen aus der Vene zu vermeiden zurück. Minimieren Sie die Nadel in die Vene während der Injektion zu bewegen. Auch hier seien Sie vorsichtig, Nadelstiche zu vermeiden.
HINWEIS: Die Visualisierung der Pfortader wird ohne Vergrößerung getan, aber ein Stereomikroskop, wenn sie bevorzugt verwendet werden. - Entfernen Sie die Nadel, während gleichzeitig eine sterile Wattestäbchen auf die Vene mit Druck zu setzen. Mit noch der Assistent den Darm hält beiseite legen ein Stück von 0,5 bis 1 cm 2 hämostatische Gaze über der Injektionsstelle auf der Vene.
HINWEIS: hämostatische Pulver wurde auch für diesen Schritt im Protokoll versucht, war aber beim Stoppen venösen Blutverlust nach der Injektion nicht wirksam. - Halten Sie die hämostatische Gaze an der Injektionsstelle mit Druck aus einer sterilen Wattestäbchen für 5 min.
- Beurteilen Verschluss der Vene durch vorsichtiges die hämostatische Gaze, wenn die Gaze haftet an dem umgebenden Gewebe, eine kleine Menge Steril Hebee Salzlösung kann verwendet werden, um die Gaze zu tränken und zu heben.
- Wenn der Blutverlust zu diesem Zeitpunkt auftritt, stellen ein zusätzliches Stück hämostatische Gaze an der Stelle mit dem Druck für weitere 5 min. Wenn der Blutfluss vollständig aufgehört hat, entfernen Sie die Gaze von der Maus.
HINWEIS: Der Blutverlust während der Operation muss sorgfältig geprüft werden und wenn die Gesamt erlaubt Blutverlust Volumen erreicht oder überschritten wird (basierend auf regulatorischen Standard-Betriebsverfahren für die Institutional Review Boards des Prüfers) die Maus muss, während unter durch Herzperfusion Narkose eingeschläfert werden. - Sobald die Injektionsstelle intakt gehalten wird, ohne dass Blut an der Injektionsstelle zu verlassen, legen Sie die inneren Organe in der Bauchhöhle sanft zurück.
- Suture die Peritonealüberzug und dann die Haut mit sterilem 4-0 Vicryl Naht und Kegel Nadel eine einfache kontinuierliche oder unterbrochene Nahtmuster verwendet. Typischerweise erfordert die Inzision zu schließen 10-15 Fäden.
- Inject 100 ul BUPIvacaine (5 mg / ml), die entlang der Einschnittstelle für das Management lokale Schmerzen eine Insulinspritze. Injizieren von 0,5 ml steriler Kochsalzlösung subkutan mit einer 1-ml-Spritze mit 26-Gauge-Nadel für Feuchtigkeit. Operationen nehmen 15 bis 25 min zu vervollständigen.
- Um sterile Bedingungen während der Operation erhalten, sicherzustellen, dass alle Werkzeuge und Materialien in Kontakt mit der Maus kommen, einschließlich der behandschuhten Hände, werden in geeigneter Weise vor gereinigt zu kontaktieren. Wo es möglich ist die Verwendung sterilen Materialien und Handschuhe oder minimal eine 70% ige Ethanollösung oder 10% Bleichlösung zu reinigen verwenden.
- Wenn mehrere Operationen für eine einzige Sitzung geplant Remake des ursprünglichen OP-Bereich mit frischen sterilen Tuch, Insulinspritzen, 1 ml Spritzen, sterile Kochsalzlösung, 2 x 2 "steriler Gaze Schwämme, 4 x 4" steriler Gaze, hämostatische Gaze in 0,5 geschnitten - 1 cm 2 Stück, 4-0 Vicryl Nähte mit Kegel Nadel und 2% Chlorhexidin. Bead-sterilisieren die Scheren, Zangen und hemostat zwischen Operationen und ermöglichenvor dem erneuten Gebrauch ausreichend abzukühlen.
3. Wiederherstellung, Nagetier Health Monitoring und End-Punkt-Analysen
- Nach dem chirurgischen Eingriff abgeschlossen ist, halten Mäuse auf einem Heizkissen für die Verwertung in der Bettwäsche freie, saubere Käfige für mindestens 20 min. Die Mäuse nehmen in der Regel 2 bis 4 min aus der Narkose aufwachen.
- Nicht ein Tier zurück, die Operation zu Kohabitation mit anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig aus der Narkose erholt hat. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, während sie das Bewußtsein wiederzugewinnen und zu überwachen, bis das Tier die Fähigkeit wiedererlangt hat sich in Brustlage zu halten.
- Geben Mäuse 0,05 bis 0,1 mg / kg Buprenorphin für die Schmerztherapie alle 6-12 Stunden nach der Operation, für bis zu 72 Stunden.
- Überprüfen Sie Nähte täglich, um sicherzustellen, sie während der Heilung intakt bleiben. Im Falle, dass Nähte rückgängig gemacht werden, legen Sie die Maus unter Narkose, entfernen Sie restlichen Nähte und zu ersetzen. Im Falle einer Infektion oder Inflammation konsultieren Tierarzt Personal.
HINWEIS: Die Infektion oder Entzündung wurde nicht mit diesem Protokoll festgestellt. - Für Metastasierung Studien durchführen, tägliche Gesundheitschecks bis äußeren Anzeichen von Metastasen einschließlich beobachtet werden, aber nicht beschränkt auf:> 10% Gewichtsverlust / Gewinn, scruffiness, Verlust der Aufmerksamkeit für die Umgebung, Bauch Ödeme / Aszites, hellen Augen und Ohren, oder eine gebeugte Position.
HINWEIS: Tägliche Gesundheitskontrollen besonders wichtig sind, wenn das Modell für die Verwendung mit einer neuen Zelllinie oder Zellkonzentration, bis die Timeline der Metastasierung ist gut verstanden zu entwickeln. - Bei Studienendpunkt, einschläfern Mäuse durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte.
HINWEIS: Alternative Methoden der von der Ermittler Aufsichtsgremium genehmigt Euthanasie verwendet werden können, einschließlich Perfusion mit 1x PBS während der Narkose. Perfusion der Leber wird durch Kanülierung der Pfortader, schnippeln die untere Hohlvene und drücken 1x PBS th durchgeführtrau die Gefäße der Leber mit einer Geschwindigkeit von 4 ml / min mit 1 - 2 Minuten zu entfernen, Blut und Leukozyten zirkulieren.
HINWEIS: Je nach dem Endpunkt für die Studie, die Zelllinie, und der verwendeten Konzentration, offene Lebermetastasen bei der Obduktion kann oder auch nicht offensichtlich sein. Mikrometastatische Läsionen können mit histologischen Untersuchung der Leber enthüllt werden. Endpunkte auf das Studiendesign variieren. - Extrahieren, die Leber mit einer Schere und Pinzette, indem zuerst die Gallenblase zu entfernen, dann durch die inferior vena cava superior schneiden in die Leber. Schnitt durch die Hohlvene, Pfortader und Leberarterie schlechter als die Leber.
- Entfernen Sie die ganze Leber sanft und waschen 5x in 1x PBS.
- Trennen Sie die Leber in links, rechts, Median und Nucleus caudatus Lappen.
- Formalin fix Leber in 10% neutral gepuffertem Formalin für 48 Stunden, während Schütteln bei Raumtemperatur. Verfahren Geweben durch eine Reihe von Alkoholen in steigender Konzentration und Xylol; Paraffin einbetten fixiertem Gewebe 71 HINWEIS: Alternativ kann die Leber, indem Gewebe in einem cryomold mit optimalen Schnitttemperatur (OCT) Formel und das Einfrieren auf Trockeneispellets unter Wasser in 95% Ethanol schockgefroren werden.
- Mit einem Mikrotom geschnitten in das Paraffin eingebetteten Gewebeblock, so dass ein Spiel-Kopfgröße von Gewebe offenbart.
- Schneiden Sie fünf 4-Mikron-Serienschnitte, stellt diese die erste Ebene für die Analyse.
- Schnitt durch 250 & mgr; m von Gewebe, diese Abschnitte in den Abfall werfen.
- Bei 250 & mgr; m geschnitten, um eine zweite Ebene von fünf 4-Mikron-Serienschnitte.
- Bei Bedarf wiederholen, um Schnitt durch die gesamte Leber. Hämatoxylin und Eosin - Färbung der erste Abschnitt jeder Ebene für 72 Metastasierung zu beurteilen.
HINWEIS: Für schockgefroren Gewebe eines Kryostaten verwenden Abschnitte zu schneiden.
Hinweis: Der Nachweis von micrometastatic Krankheit wird von Tumorzellen spezifische Färbung erfordern.
- Entfernen Mäuse aus der Studie, wenn das Tumorwachstum bei den Einschnitt ist sitzene, so zeigt dies an, nach der Injektion von Tumorzellen Leckage in die Bauchhöhle.
Hinweis: Dieses Problem wurde nicht beobachtet.
Representative Results
Die Pfortader Injektionsmodell, bei dem Tumorzellen direkt in die Leber über ein chirurgisches Verfahren geliefert werden, ermöglicht die Injektion der Tumorzellen in die Pfortader. knapp über der Ebene des vierten inguinal Brustdrüse Zitze und endet knapp unterhalb der Rippen unter antiseptische Bedingungen in einer anästhesierten Maus, ein ~ 1 Zoll chirurgischen Einschnitt auf der linken Seite der Maus zwischen den mittleren und sagittalen Ebenen gemacht, ausgehend . Die Dick- und Dünndarm werden durch den Einschnitt sanft gezogen Visualisierung der Pfortader zu liefern (1A). Genaue anatomische Identifizierung der Pfortader und erfolgreiche intra Portal Injektion können durch Praktizieren der Injektionsprotokoll mit Tusche oder einem ähnlichen Farbstoff bestätigt werden. Korrekte Injektion über die Pfortader in der Tinte führen , dass sofort und gezielt auf die Leber geliefert und wird in Indien Tintenverteilung in der Lunge führen (Figure 1B). Des Weiteren ist mit D2A1 Maus - Brusttumorzellen markiert mit GFP, Ausbreitung von Tumorzellen in der gesamten Leber bei 90 Minuten nach einer Injektion auf , Pfortader Injektion Lieferung in die Leber (1C) bestätigt. Bei höherer Vergrößerung wird es bei 90 min nach der Injektion von Tumorzellen innerhalb von Sinusoiden gefunden sowie im Leberparenchym in unmittelbarer Nähe zum Portal Triaden, wo das Pfortaderblut tritt in die Leber (1C) ersichtlich , daß. Diese Daten legen nahe, dass eine aktive Tumorzelle Extravasation auftritt bei 90 min nach der Injektion der Tumorzellen. Zusammengenommen bestätigen diese Daten, dass die Pfortader Injektionsmodell das Injektionsvolumen direkt an die Leber, mit Tinte oder Tumorzellen in der gesamten Leber und ohne nennenswerte Transport von Injektionsvolumen der Lunge verteilt liefert.
Zur Beurteilung der Robustheit der Pfortader Injektion Modell, drei separsyngenen Maus-Mammatumorzelllinien ate wurden in erwachsenen weiblichen Balb / c-Mäusen getestet. Diese Brusttumorlinien wurden auf ihre gekennzeichnet Verhalten in Brustfettpolster Modelle ausgewählt basieren und die hochaggressive und metastatischen 4T1 - Zelllinie, die weniger aggressiven metastasierenden D2A1 Linie, und die niedrig / nicht-metastasierten D2.OR Linie 37,61,73 , 74. 2.000 und 10.000 Zellen pro Injektion wurden keine nennenswerten Unterschiede in der Zeit für die Entwicklung einer manifesten Metastasen mit diesen niedrigen Zellkonzentrationen getestet. Für diese Untersuchungen von Metastasen Surrogatmarker wurden wie Mangel an Pflege verwendet, Blässe und Gewichtsverlust der Obduktion zu rechtfertigen, auf die das Vorhandensein oder Fehlen von Lebermetastasen durch visuelle Beurteilung der Leber und anderen Organen bestätigt wurden intra-Portal Lieferung zu bestätigen . Diese Daten bestätigen frühere Berichte, dass die 4T1 und D2A1 Zelllinien aggressiver Brusttumorlinien darstellen, wie kürzere Metastasierung freie Überlebensrate beobachtet werden, im Vergleich zu Mäusen injiziertmit dem weniger aggressiven D2.OR Linie (2A). Mäuse injiziert mit 4T1 oder D2A1 Tumorzellen entwickelt manifester Lebermetastasen von ~ 30 - 40 Tage nach der Injektion, und einige Metastasen entwickelt bereits 18 Tage nach der Injektion (2A), wohingegen nur eine Maus mit Zellen injiziert hatte D2.OR entwickelte offene Lebermetastasen durch Studienende, die 60 war - Injektion 65 Tage nach der Tumorzelle. Metastasen wurden anschließend durch Schneiden durch die Leber in 250 & mgr; m Ebenen und Analyse Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt Abschnitte (2B-D) bestätigt.
Neben dem Nachweis einer manifesten metastatischen Läsionen in der Mausleber kann die Pfortader Modell auch frühere Ereignisse in der metastatischen Kaskade einschließlich der Erkennung von einzelnen Zellen / Zellclustern folgenden Extravasation und die Bildung von Mikro-Metastasen zu untersuchen genutzt werden. Multiplex-Immunfärbung wurde verwendet,4T1, D2A1 und D2.OR Brusttumorzellen in der Leber zu erkennen, wenn sie vorhanden sind, als einzelne Zellen oder Mikro metastatischen Läsionen, wie H & E nicht ausreichend ist, um die Anwesenheit von kleinen Läsionen zu bestätigen. 3A zeigt eine repräsentative Balb / c Mausleber mit einem putative micrometastatic Herde D2A1 Tumorzellen, die für das Epithel - Keratin CK18 positiv, negativ für die pan-Immunmarker CD45 und negativ für den Hepatozyten - Marker Heppar-1. Hepatozyten Fleck auch positiv für CK18, die Verwendung von Heppar-1 in dieser Färbung Platte erforderlich macht. Ein wichtiger Hinweis ist , dass Gallengang Epithel und Lebervorläuferzellen für CK18 positive beflecken, erfordern eine sorgfältige Unterscheidung zwischen Tumorzellen und Gallenwege, vor allem bei der Beurteilung periportalen Regionen (3A). Eine Alternative zu multiplexen Immunofluoreszenz einzelne disseminierte Zellen und micrometastatic Brennpunkte zu identifizieren syngenen Brusttumorlinien markiert mit enhanced green fluorescent zu nutzenProtein (eGFP) und / oder die Luciferase und führen IHC für das Tag (Abbildung 1C). Durch die Immunogenität von eGFP, Luciferase und andere Proteine, ist es wichtig , Mausmodelle zu verwenden , die gegen diese Proteine, wie zum Beispiel die neue immunkompetenten "glühenden Kopf" Maus tolerisiert werden , die eGFP und Luciferase in der vorderen Hypophyse 75 zum Ausdruck bringt. Zur Identifizierung von macrometastatic Läsionen von unmarkiert syngenen Linien wie die D2A1 Tumorlinie, die CK18 / Heppar-1 / CD45 - Multiplex - Immunfluoreszenz ist ideal (3B).
Abbildung 1: Portal Veneninjektion liefert Tumorzellen direkt in die Leber. A) Portal Veneninjektion; Der Schnitt wird zwischen dem Median und linken Sagittalebene, von oberhalb der Ebene der vierten inguinal Brustdrüse Zitze und endet knapp unterhalb der ri gemachtb Käfig. B) Balb / c Leber mit PBS - Injektion (links). Folgende Tusche Injektion über die Pfortader der Leber (Mitte), aber nicht der Lunge (rechts) nimmt Tinte. C) Repräsentative dünne Schnittbilder von D2A1 Mauszellen - Brusttumor markiert mit GFP in einer Balb / c - Maus Leber bei 90 min nach der Injektion von 1 × 10 6 Tumorzellen über die Pfortader. Lebern wurden mit Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Anti-GFP-Antikörper zur Tumorzelldetektion gefärbt. Top Panel zeigt dunkelbraun gefärbten Tumorzellen (Pfeile) in der gesamten Leber verteilt, Sternchen bezeichnet unspezifische Hepatozyten Färbung um den zentralen Venen; Maßstabsbalken = 300 & mgr; m. Untere Platten zeigen repräsentative Bilder von Tumorzellen bei 90 min nach der Injektion noch eng mit Gefäßsystem verbunden ist; Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Auswuchs von Maus - Mammatumorzelllinien in der Leber über Portal Veneninjektion. A) Kaplan-Meier - Kurve metastasenfreie Überlebensrate bei Mäusen zeigen , injiziert mit 2.000-10.000 4T1, D2A1 oder D2.OR Maus - Brusttumorzellen. Die Mäuse wurden mit Tumorzellen injiziert und auf Anzeichen von Metastasen einschließlich des Mangels an Pflege, blassen Augen überwacht und Gewichtsveränderungen. Metastase wurde zum Zeitpunkt der Obduktion und von H & E auf histologischen Schnitten von der Leber bestätigt. N = 2 4T1 2000 Zellen; 2 4T1 10.000 Zellen. N = 2 D2A1 2000 Zellen; 3 D2A1 10.000 Zellen. N = 3 D2.OR 2000 Zellen; 3 D2.OR 10.000 Zellen. Representative H & E - Bilder von B) 4T1 Läsionen bei 21 Tage nach der Injektion von 10.000 Zellen, C) D2A1 Läsionen bei 26 Tage nach der Injektion von 10.000 Tumorzellen, und D) D2.OR Läsionen an59 Tage nach der Injektion von 10.000 Zellen; Maßstabsbalken = 75 & mgr; m. Ähnliche Läsionen beobachtet, wenn 2,000 4T1 oder D2A1 Tumorzellen injiziert wurden. Keine Läsionen wurden mit 2000 D2.OR Zellen nachgewiesen. Kein Nachweis von Metastasen in anderen Organen oder an der chirurgischen Einschnittstelle war in jeder Maus auf diesen Studien deutlich. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Nachweis von Einzelzellen und Metastasen in der Mausleber mit Multiplex Immunofluoreszenz. A) Repräsentative multiplex Immunofluoreszenz von D2A1 Tumorzellen in einer Balb / c Mausleber bei 90 min nach der Injektion der Pfortader Injektionsmodell. Die Färbung wurde unter Verwendung eines Multiplex-Kit durchgeführt. Von links nach rechts zeigt DAPI; CD45 Leukozyten zu markieren; Heppar-1 mark Hepatozyten; und CK18 Tumorzellen, Hepatozyten und Gallengang Epithel zu markieren. Zusammengeführt Bild zeigt ein mutmaßliches Cluster von CK18 + Heppar-1 - CD45 - D2A1 Tumorzellen eng mit einem Portal Triade verbunden. Pfeil = D2A1 Tumorzellen, Stern = Gallengang Epithel; Maßstabsbalken = 25 & mgr; m. B) Ein Vertreter offenkundigen D2A1 metastasiertem Läsion die gleiche Färbung Tafel wie in A. Tumorzellen unter Verwendung sind CK18 + während benachbarte Hepatozyten sind CK18 + Heppar-1 +; Maßstabsbalken = 25 & mgr; m. Bilder wurden mit 20 x 0,8 auf einem Mikroskop aufgenommenen, 40 x 1,3 und 60 x 1.4 Ziele und CCD-Kamera, die Mikroskop-Software. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Die Balb / c-Maus Pfortader Injektions Modell erlaubt die Untersuchung von Brustkrebs Läsionen in der Leber in der Abwesenheit von Störfaktoren Multiorganmetastasen und in einem vollständig immunkompetenten Wirt. Unser Protokoll ist eine Weiterentwicklung der bisher chirurgische Verfahren veröffentlicht , die zur Injektion von Tumorzellen 16,55,56 direkt in die Leber Zugriff auf die Pfortader ermöglichen. Eine Weiterentwicklung wir gemacht haben , ist signifikant die Anzahl der injizierten Tumorzellen reduzieren von ≥ 1 x 10 5 Zellen / Injektion 16,55,56 unten 10.000 Tumorzellen auf ≤ / Injektion. Wir haben auch das Modell für die Untersuchung von Brustkrebs Metastasen in der Leber erweitert. Mit diesem Protokoll, zwei Brustkrebszelllinien mit bekannten Metastasepotential Lebermetastasen mit kürzerer Latenz als eine Ruhebrusttumorzelllinie zu entwickeln. Ferner werden zu frühen Zeitpunkten, Tumorzellen in der gesamten Leberparenchym als einzelne oder kleine Gruppen von Einzel ce verteiltenlls nach der Tumorzellinjektion. Das Modell ist bereit, Fragen von metastasierendem Effizienz einschließlich Tumorzelle Extravasation, das Überleben der Zellen, Dormanz und Proliferation zu adressieren - alle Phänotypen, die zur Entwicklung von Mikro-metastatischen und offene Metastasen in der Leber beitragen.
Es ist wichtig, zahlreiche Aspekte der Pfortader Injektionsprotokoll vor Beginn der Studien zu berücksichtigen. Sorgfältig Entscheidung über Zelllinien, Zellkonzentration wird die Gesamtzellzahl und Endpunkte von Interesse basierend auf kleineren Sondierungsstudien sehr zu empfehlen. Ferner ist die Verwendung von immunkompetenten Wirten und syngenen Zelllinien von größter Bedeutung Wechselwirkungen Wirtszelle, Tumor für das Verständnis. Der neu entwickelte "glühenden Kopf" Maus , die eGFP und Luciferase aus der vorderen Hypophyse ausdrückt , ist ein wichtiges Instrument Host Reaktionen auf exogene eGFP und Luciferase zur Eliminierung von Proteinen verwendet häufig Brusttumorlinien 75 zu markieren ,
Es ist wichtig zu beachten, dass die Pfortader Injektion Modell nicht die volle metastatischen Kaskade repliziert, wird aber auf die Untersuchung von Tumorzellen Extravasation, Tumorzellnische Wechselwirkungen folgenden Extravasation und das Tumorwachstum begrenzt. Modelle, die die volle metastatic cascade zur Leber genau nachzubilden, wie beispielsweise bei Patienten auftritt, werden dringend benötigt. Eine zusätzliche Einschränkung des Injektionsmodell Pfortader ist , dass es durch die Auswirkungen der Operation auf dem Host, mit der Wundheilung bekannt auszuwirken Krankheitsprogression 76,77 verwechselt wird.
Die Pfortader Injektion Modell stellt eine Verbesserung gegenüber anderen InjektionsModelle Lebermetastasen, einschließlich intrakardialer und intralienale Modelle zu studieren. Insbesondere ermöglicht die Pfortader Injektions Modell für die Untersuchung eines größeren Bereichs der Krankheitsprogression als der intrakardialen Modell, das oft durch gleichzeitige Metastasen in anderen Geweben beschränkt ist. Ferner wird die Pfortader Modell durch Entfernung der Milz nicht kompliziert, wie in der intralienale Modell durchgeführt wird.
Die Pfortader Injektionsmodell kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Lebermetastasen im allgemeinen erweisen. Lebermetastasen ist die häufigste Ort der Metastasierung in Adenokarzinomen insgesamt mit besonders hohen Raten in Bauchspeicheldrüsenkrebs (85% der Metastasen in der Leber), Kolon und Rektum-Adenokarzinome (> 70%), sowie Magen und Speiseröhre (> 30 %) 1. Obwohl spontan und orthotoper primären Tumormodellen von Pankreas- und Kolon - Adenokarzinome schneller in die Leber metastasieren 78,79 kann die Pfortader Injektion Modell prove nützlich, um den metastatischen Prozess dieser Krebsarten zu verstehen, wie kontrollierte Abgabe von Tumorzellen ermöglicht, biochemische, molekulare und histologischen Beurteilungen zu bestimmten Zeiten nach der Tumorzellenankunft. Zusammenfassend stellt die Pfortader Injektionsmodell eine wichtige Verbesserung gegenüber verfügbaren Lebermetastase Modelle von Brustkrebs, und auch auf die Lebermetastasen Gebiet allgemein anwendbar sein.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
| Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously |
| Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site |
| anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
| Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
| Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
| Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
| anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
| Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
| DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
| Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
| Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
| Heating Pad, x 2 - 3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
| Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
| Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
| Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
| Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
| Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
| Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
| Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
| Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
| Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
| Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
| Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
| Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
| Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
| Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
| Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
| Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
| Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
| Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
| Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |
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