Cancer Research

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Published: December 26, 2016 doi: 10.3791/54903

Erica T. Goddard¹, Jacob Fischer¹, Pepper Schedin¹

¹Department of Cell, Developmental and Cancer Biology, Oregon Health and Science University

Abstract

סרטן השד הוא הגורם המוביל לתמותה מסרטן בנשים ברחבי העולם. גרורות בכבד מעורב למעלה מ 30% מהמקרים עם גרורות סרטן השד, וכתוצאה מכך תוצאות העניים עם שיעורי ההישרדות החציוני של רק 4.8 - 15 חודשים. במודלים של מכרסמים הנוכחיים של גרורות סרטן השד, כולל xenograft תא גידול הראשוני ומודלי גידול ספונטניים, לעתים רחוקות גרורים בכבד. Intracardiac ומודלים הזרקת intrasplenic אל לגרום גרורות בכבד, אולם ניתן מבולבל מודלים אלה על ידי גרורות המשני באתר במקביל, או על ידי חסינות נפגעת כתוצאה הסרת הטחול להימנע צמיחת גידולים באזור הזריקה. כדי לענות על הצורך של מודלים גרורים בכבד השתפרו, שיטת הזרקת murine פורטל וריד המספקת תאים סרטניים ראשית וישירות אל כבד פותחתה. מודל זה מספק תאים סרטניים בכבד ללא סיבוכים של גרורות בו-זמניות באיברים אחרים או הסרה של הטחול. ההצטרפותפרוטוקול פורטל וריד imized מעסיק כרכי הזרקה קטנים של 5 - 10 μl, ≥ 32 מחטי מד, ו גזה עוצר דמום באזור הזריקה לשלוט על אובדן דם. גישת ההזרקה לוריד פורטל Balb / c עכברות באמצעות שלוש שורות גידול חלב syngeneic משתנה פוטנציאל גרורתי נבדק; תאי 4T1 גבוהים גרורתי, מתון-גרורתי תאי D2A1, ותאי D2.OR נמוכים גרורתי. ריכוזי ≤ 10,000 תאים / תוצאות ההזרקה חביון של ~ 20 - 40 ימים לפיתוח של גרורות בכבד עם קווי גרורתי 4T1 ו D2A1 גבוה, ו> 55 ימים עבור הקו D2.OR פחות אגרסיבי. מודל זה מייצג כלי חשוב ללמוד גרורות סרטן השד אל הכבד, ועשויים לחול על סוגי סרטן אחרים כי גרורות לעיתים קרובות אל הכבד כולל המעי הגס וסרטן הלבלב אדנוקרצינומה.

Introduction

סרטן שד גרור אל הכבד

הכבד הוא אתר משותף של גרורות סרטן השד, יחד עם עצם וריאות ^1-3. גרורה בכבד בחולי סרטן השד הוא גורם פרוגנוסטי בלתי תלוי לתוצאות עניות מאוד ^4,5, כמו חציון הישרדות של חולות סרטן השד עם גרורות טווחי כבד מפני 4.8 עד 15 חודשים ^6-9. לעומת זאת, חולות סרטן שד עם ריאות או גרורות בעצמות בעלי סיכויי הישרדות חציוני של 9 עד 27.4 חודשים ^8,9 ו 16.3 כדי 56 חודשים ^8,10-12, בהתאמה. גרורה היא תהליך רב שלבים, המכונה מפל גרורתי, אשר מתחיל עם הפצת תאים סרטניים ב הגידול הראשוני ונגמר תמותה חולה בשל זריעת התולדה של מחזורי גידול תאים בתוך איבר רחוק ^13-15. במודלים של מכרסמים של גרורות חשפו כי המפל גרורתי הוא יעיל להפליא, עם אך ורק 0.02 - 10%תאים סרטניים במחזור הקמת גרורות גלויות ^16,17. אחת צוואר בקבוק עיקרי של יעילות גרורתי מוכתב על ידי microenvironments הרקמה הייחודי אתרים משניים, בשם נישות גרורתי ^18, המדגיש את החשיבות של גרורות אתר ספציפי הבנה. הנישה גרורתי הוא ייחודי באתר להישנות, והוא, בין היתר, המאופיינת בתצהיר של חלבונים תאי מטריקס ברורים ^19,20, חדירה של אוכלוסיות תאים חיסוניים שונים ^21-23, הומאוסטזיס רקמות שינו כולל ייצור dysregulated של ציטוקינים רבים, כמוקינים, ואת גורמי גדילה ^15,18,24,25. לכן, הבנה של הנישה גרורתי הרקמות הספציפית מקדימה הבנה של איך למקד מחלה גרורתית. עם זאת, מודלים חזקים של גרורות בכבד חסרים. יתר על כן, מודלים משופרים של גרורות בכבד יהיו חיוניים לזיהוי מטרות רומן וטיפולים יעילים עבור wi חולות סרטן השדגרורות בכבד ה.

הוקם מודלים לחקר סרטן שד גרור אל הכבד

כיום דגמים זמינים ללמוד הופעת גרורות סרטן השד אל הכבד כולל xenografts תאים סרטניים האנושי בעכברים נפגעים חיסוניים. מודלים אלה משתמשים בדרך כלל שורות תאי סרטן שד אנושיים-למד היטב כגון MCF-7 ו מד"א- MB-231 ו עירום, Rag1 ^{- / -,} או המארחים murine נפגעת SCID החיסונית ^26-29. מודלי xenograft לספק את היתרון של מעורבי שורות תאים אנושיים שמקורם הסרטן, עם זאת, בהתחשב הייסוף האחרון עבור תאים חיסוניים גרור ^30-32 ובהתנגדות טיפולית ^33-35, בחקר גרורות שורה מוסמכת חיסונית מלא הוא בעל חשיבות עליון. מודלים ללמוד גרורות סרטן שד בכבד מארחים מוסמכים חיסוניים כוללים הזרקת orthotopic של תאים סרטניים syngeneic (למשל, 4T1 שורות תאי D2A1) לתוך כרית שומן החלב, עם או בלי כירורגיתכריתה של הגידול הראשוני, והערכה הבאה של גרורות ^36-38. מן ראוי לציין כי שיעור גרורות בכבד ממודלי השתלת orthotopic הוא נמוך מאוד או לא קיים בהשוואה לאתרים גרורתי אחרים כגון ריאות ^39,40, או מתרחש לאחר גרורות ריאות היא הוקמו, שמסבך בחקר הגרור בכבד ספציפי ^37,39 .

explants הגידול ממודלים סרטן השד ספונטנית מהונדסים גנטית ניתן מחדש מוזרק לתוך רפידות שומן החלב של המארחים תמימים תאים סרטניים syngeneic. לדוגמא, נמסר לאחרונה כי גידולים ספונטניים מעכברי K14 ^Cre ECad ^{f / f} P53 ^{f / f,} איזה דגם פולשני סרטן השד לובולרי, לפתח גידולים כאשר הוא מוזרק orthotopically לתוך מארחי wildtype. בעקבות כריתה כירורגית של גידולים אלה ברגע שהם מגיעים 15 מ"מ ^2, 18% מהעכברים התקדמו כבד גרור ^40,41. גישה שלישית מודל שימושים גרורות בכבדגרורות ספונטניות בעכברים מהונדסים גנטי. עד כה, דיווחים של מודלים בעכברים ספונטניים של גרורות סרטן שד שהתפשטו בקלות אל הכבד אינם שכיחים. יוצאים מן הכלל הן H19-IGF2, את p53 ^{FP / FP} MMTV-Cre Wap-Cre, ואת P53 K14 ^Cre ECad ^{f / f} ^{f / f} במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, שבו גרורות בכבד מפתחת אצל אחוז נמוך של עכברים ^{38,41- 43.} וכך, בעוד מודלי עכברים מהונדסים גנטי להקל על המחקר של כל השלבים של המפל גרורתי, מתן מודלי עצמה רלוונטיים קליני, הם מוגבלים בשל שיעורים נמוכים של גרורות בכבד ^38.

מודלים גרורים כמה לעקוף את השלבים הראשוניים של מפל גרורתי לרבות הפצת תאים סרטניים מהגידול הראשוני ו intravasation. מודלים אלה מאפשרים חקירת השלבים המאוחרים של המפל גרורתי, מן extravasation להקמת גידולים באתרים משניים. intמודל הזרקת racardiac מספק תאים סרטניים לתוך החדר השמאלי, אשר מפיץ תאים סרטניים לתוך מערכת הדם באמצעות האאורטה. הזרקת intracardiac דורש הדמיה אולטרסאונד מונחה של הזריקה או שיטות הדמיה אחרות כגון פליטת אור בלוציפראז מתויג תאים כדי לאשר זריקה מוצלחת. הזרקת תאים סרטנית באמצעות החדר השמאלי עלולה לגרום עצם, מוח, ריאות, ו / או גרורה בכבד, בקרב גופים אחרים ^44-48. בגלל גרורות רבות-איבר, עכברים אלה זקוקים לעתים קרובות כדי להיות מורדמים לפני ההתפתחות גרורה בכבד גלוי, שלילת היכולת לחקור צמיחת גרורתי מלאה בתוך הכבד. גישה חלופית באופן משמעותי מצמצמת את ההתפתחות גרורה רב באתר היא מודל הזרקת intrasplenic. הזרקת Intrasplenic מספק תאים סרטניים דרך וריד הטחול המתחבר עם וריד מצע המעי העליון להפוך את וריד שער ^49,50. ניתן לנטר בעלי חיים עבור outgrowth של גרורות בכבד בגלל היווצרות של גרורות באתרים אחרים היא נדירה, וכתוצאה מכך, את הבריאות הכללית של החיה נשמרת ^49,50. עם זאת, חשוב לציין כי המודל intrasplenic דורש כריתת טחול להימנע גידולים הטחול ^49,50, הליך אשר משפיע תפקוד מערכת החיסון. לדוגמא, פגיעת reperfusion איסכמיה לבבית מאופיינת חדיר תת מונוציטים Ly6C ⁺ שמקורן הטחול אחראי phagocytic ופעילות פרוטאוליטים במהלך ריפוי הפצע הבא איסכמיה ^51,52. עם כריתת טחול, קיימת ירידה שנצפתה אוכלוסיות מונוציטים המסייעים איחוי פצעים ^52. יתר על כן, כריתת טחול הוכח להפחית את צמיחת הגידול הראשוני וגרורות ריאות במודל סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים, במיוחד באמצעות צמצום מספר מחזורי התוך הגידול CCR2 ⁺ CD11b ⁺ Ly6C ⁺ myelo monocyticid תאים ^53. בנוסף, כריתת טחול לאחר ההזרקה intrasplenic של תאי סרטן המעי הגס הביא רמות נמוכות של תאי הרג טבעיים אנטי סרטניים בבלוטות הלימפה mesenteric ו ^-54 גרורות בכבד גבוהות. לסיכום, ממצאים אלה מראים כי כריתת טחול פוגעת התפקיד של מערכת החיסון עם השלכות מאוחרות גורל תא גרורתי.

פורטל וריד דגם הזרקה של כבד גרור

כדי לחקור גרורות סרטן שד בכבד שורה מוסמכת חיסונית באופן מלא, בתנאי שבה עכברים אינם נמצאים בסיכון עקב גרורות רבות-איבר, מודל הזרקה לוריד פורטל פותחתה. מודלי הזרקת Intraportal שמשו בעבר כדי ללמוד גרורות בכבד של שורות תאי המעי גס ^55,56 ומלנומה ^16; כאן אנו מתארים יישום של זריקת intraportal מודל גרורות תאים סרטניים חלב syngeneic. ניתן להשתמש במודל זה כדי ללמודבשלבים מאוחרים יותר של מפל גרורתי כולל extravasation תאי סרטן השד וזריעה, החלטות גורל תאים סרטניים לגבי מוות / התפשטות / תרדמת, ואת תולדה לתוך נגעים גלוי. במודל זה, שורות תאים סרטניים חלב syngeneic מוזרקות דרך וריד הפורטל של עכברות חיסוניות מוסמכות Balb / c, שיטה המספק תאים סרטניים ראשית וישירות אל הכבד ללא הסרת הטחול. כדי לפתח מודל זה, השימוש של שורות תאים סרטניים ארבעה החלב כי טווח יכולת גרורתי שלהם מהנמוך לגבוה הועסקו: D2.OR, D2A1, ו 4T1, ו מועסקים D2A1 מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (D2A1-GFP) כדי לחקור מוקדם בזמן נקודות לאחר הזרקת תאים סרטניים. 4T1 היא שורת תאים גרורתי מאוד נגזר הגידול 410.4 שהתעוררו ספונטני עכבר MMTV ⁺ Balb / c נקבה ^36,37 גרורות אל הריאות, הכבד, המוח, ואת עצם גידולים ראשוניים כרית שומן החלב ^39,57,58. D2A1 תאים סרטניים werהדואר גם במקור נגזר גידול חלב ספונטני לארח Balb / c לאחר ההשתלה של תאי גולת המכתשית hyperplastic D2, והם אשרו להיות גרורתי מן הגידול הראשוני אל הריאות ^59,60. D2.OR תאים סרטניים הם קו אחותו הלא-גרורתי לקו D2A1, ואף שהם לברוח הגידול הראשוני ומגיעים אתרים משניים, שהם כמעט ולא להקים גרורות מרוחקות ^60,61.

בנוסף, חשוב להימנע שימוש בתרופות לטיפול בכאב מועסק בדרך כלל כולל תרופות סטרואידיות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) במהלך או לאחר ההליך הכירורגי. יש NSAIDs פעילות אנטי גידולית בסרטן השד מסוימים ^62-65, וכמה סוגים של NSAIDs מעלה את הסיכון לרעילות כבדית ^66,67, פוטנציאל להתפשר בחקר גרורות בכבד ואת נישה גרורתי בכבד. יתר על כן, מחקרים מראים כי NSAIDs משפיע ישירות על המיקרו-סביבת הרקמות, הפחתת שלוחה פרו-גרורתיחלבונים מטריצה racellular tenascin-C ⁶⁸ ו קולגן סיבי ^62,65. לחלופין, את השימוש של נגזר אופיואידים, עצירות, שימש בגלל יעילותו בניהול מכרסם כאב ⁶⁹ ובשל חוסר ראיות שיש אופיואידים פעילות אנטי גידולית ^70. מודל הזרקת פורטל וריד זו הוטב כרכי הזרקה קטנים של 5 - 10 μl כדי למנוע ניזק מיותר אל הכבד. המודל היה מותאם גם לכלול מחטים עם קוטר קטן יותר (≥ 32 מד) ושימוש גזה עוצר דמום מיד לאחר ההזרקה כדי להקטין את איבוד הדם במהלך ההליך. בניגוד פרמטרי הזרקה המותאם אלה, מספרים סלולריים צריכים להיקבע על בסיס פרטני, מבוססים על פוטנציאל tumorigenic של הקו הסלולרי. עם זאת, החל מ ≤ 10,000 תאים / הזרקה עבור מחקרים ארוך טווח מומלץ. עבור נקודות קצה קצרות (למשל, 24 שעות לאחר הזרקה) הרבה יותר תאים סרטניים (למשל,1 x 10 ⁵ - 1 x 10 ⁶⁾ ניתן להשתמש אם מוצדק. לסיכום, מודל ההזרקה לוריד פורטל המפורט כאן מהווה כלי שימושי לחקר גרורות סרטן השד בכבד עוקף מספר המגבלות של מודלים גרורים בכבד אחרים. מודל זה הופך לפשוט מחקר של extravasation תאים סרטניים, זריעה, החלטות גורל מוקדמות של הישרדות, התפשטות, תרדמת, ואת תולדה גרורתית מארחי murine מוסמכות חיסוניים.

Protocol

הנהלים כל חיה במאמר זה היו נבדקה ואושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע ועדת שימוש.

1. הכנה של אזור מכשירי הניתוח

הכן את המספריים, מלקחיים, hemostat על ידי אידוי ב 124 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 1 - 2 ימים לפני הניתוחים המתוכננים. ודא גישת מצעי autoclaved או סטרילי, כלובים ומזון לבעלי התאוששות לאחר ניתוח.
כן אזור ניתוח מזוהם, רצוי במנדף זרימה למינרית.
1. נגבו את כל המשטחים של אזור הניתוח עם 10% אקונומיקה, כולל כרית חימום, מקור האור, צינורות הרדמה חרטומו, וכל חלק אחר של לחדרי הניתוח כי יהיה בסמיכות ההליך הכירורגי בזמן שהוא ביצע .
2. בתחום כירורגית ספטית, למקם את כרית החימום לנקות עם וילון סטרילית, מקור אור, צינורות הרדמה nosecone, מזרקי אינסולין, 1 מ"ל מזרקים, bupivacaine, דמעות מלאכותיות, מלח סטרילית, 2 x 2 "ספוגים גזה סטרילי, 4 x 4" גזה סטרילי, לחתוך גזה עוצר דמום לתוך 0.5 - 1 ס"מ ² חתיכות, מספריים, מלקחיים, hemostat, 4-0 תפרים vicryl עם להתחדד מחט, גלוקונאט כלורהקסידין 50 מ"ל 2% במיכל autoclaved.
3. ודא כי יש מקום במרחב הזה עבור תאים סרטניים מוכנים מאוחסנים על קרח.
4. על הספסל הסמוך לאזור כירורגית, להכין את אזור ההתאוששות עם כרית חימום שנייה וכלובים נקיים עם מצעים סטרילי.
  הערה: אזור זה יכול גם פריטים לבית כגון מעקר חרוז.

2. הזרקת Portal Vein

One-שעה לפני הזריקות המתוכננות, לטפל Balb / c עכברות בן 8 - 15 שבועות עם 100 μl של 0.015 מ"ג / מיליליטר עצירות, תת עורי, לניהול כאב.
הערה: פרוטוקול הזרקה זה עשוי להיות מיושם על כל זן של עכבר נקבה או זכר בכל גיל, באמצעות מתאיםשורות תאים לשינויים לזן.
כן התאים הסרטניים להזרקה המבוסס על פרוטוקולים עבור הקו הסלולרי או explant גידול של בחירה. בחן את כל שורות תאים סרטניים לפני מתן לנוכחות של פתוגנים בעכברים כדי להפחית את הסיכון של החדרת פתוגנים כאלה לתוך המושבה החי.
1. לקבלת syngeneic Balb / c שורות תאים סרטניים כולל D2A1, D2.OR, ותאים סרטניים 4T1, תאים ההפשרה לתוך צלחת תרבות 10 ס"מ רקמות 3 ימים לפני הזריקה כך התאים למחרת נמצאים ~ 90 - 100% confluency.
2. 1 יום תאים סרטניים בעקבות הפשרה לשטוף תאי פעם עם בופר פוספט 1x (PBS) ו trypsinize התאים הסרטניים ומחובר באמצעות 2 מיליליטר של טריפסין 0.05% ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסף 8 מיליליטר של מדיה מלאה (גלוקוז DMEM הגבוה, 10% בסרום שור עוברי, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין) ומעבר 01:10 לתוך צלחת מתוקה 10 סנטימטרים עם 10 מיליליטר של מדיה מלאה.
3. ביום של זריקות, לשטוף תאים פעם עם PBS 1x ו trypsinize כמתואר לעיל.
4. Resuspend תאים trypsinized ב 8 מ"ל של מדיה מלאה, ספין במשך 5 דקות ב 1500 XG, להסיר את המדיה ו resuspend ב 5 מ"ל 1x PBS.
5. ספירת תאים על hemocytometer באמצעות הרחקת trypan הכחולה להערכה כדאית. Resuspend תאים להזרקה 1x PBS בריכוז ונפח שנקבע מראש.
  הערה: 5 - 10 μl מומלצים כמו כרכי הזרקה קטנים למנוע ניזק מיותר אל הכבד.
6. שמור את התאים על קרח למשך של זריקות. בעקבות השלמת זריקות, לחזור דגימת תאים למעבדה ומקום בתרבות במדיה המלא ל 1 יום כדי להבטיח את יכולת הקיום.
מניחים את העכבר תחת הרדמה עם 2 - 2.5 isoflurane% (2-כלורו-2- (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-אתאן) נמסר חמצן. לשמור על טמפרטורת הגוף באמצעות כרית חימום. ודא הרדמה מלאה על ידי הערכה לתגובת קמצוץ בוהן, ולאחר מכן לשמור anestheSIA ב 2 - 2.5% isoflurane.
הערה: חשוב לעקוב אחר בעלי החיים קצב הנשימה ולהתאים את בספיקה isoflurane בהתאם לאורך כל ההליך.
מניחים כמות קטנה של דמעות מלאכותיות או משחה הווטרינר מעל כל עין כדי למנוע ייבוש יתר של העיניים במהלך ההליך הכירורגי.
מניחים את העכבר במצב שכיבה, על גבו עם הבטן חשוף.
הסרת שיער בצד שמאל הגחון של המכרסם ממרחב הצלע השני למטה אל הפטמה בלוטת חלב מפשעתי 4 ^th על ידי מנגב את האזור עם מקריח כימי. אפשר מקריח לשבת 1 - 2 דקות ולאחר מכן להסיר לחלוטין עם גזה ו- H ₂ O. שלב זה יכול להיעשות 1 - 2 ימים מראש כדי לחסוך זמן אם ניתוחים רבים מתוכננים.
קח אחד 2 x 2 "ספוג גזה סטרילי (שהושרו 2% כלורהקסידין) ולנגב את העכבר באתר של הסרת שיער. לחטא את האזור שמסביב, כולל הזנב, כדי למזער המשך חיידקיamination של מכשירים.
נגב את האתר של הסרת שיער וסביבתה למטה עם כרית הכנת אלכוהול.
חזור על 2% כלורהקסידין וצעדי אלכוהול פעם יותר ולסיים עם כלורהקסידין סופי לנגב עבור סכום כולל של שלושה כלורהקסידין 2% והשני שוטף כרית הכנת אלכוהול. האם כלורהקסידין הסופי לנגב כך הכימי אינו מטפטף סביב האתר כירורגית כדי למנוע כלורהקסידין מקבל על איברים פנימיים. הערה: יישום של כמויות גדולות של כלורהקסידין ואלכוהול לעור ופרווה סביב עלול לגרום לירידה משמעותית בטמפרטורת הגוף. אין לנגב עם נפח עודף במהלך השלבים 2.7-2.9. לשמור על טמפרטורת גוף עם כרית חימום.
שימוש בכפפות סטריליות ו אזמל מעוקר עם להב סטרילי, לעשות חתך 1 אינץ יחיד לתוך העור בין מטוסי חציון sagittal בצד השמאלי של העכבר, החל ממש מתחת לצלעות וכלה בדיוק מעל למישור של מפשעתי הרביעית פטמת בלוטת חלב.
בעזרת מספריים autoclaved או חרוז מעוקרים מלקחיים, לעשות חתך 1 אינץ דומה לתוך הצפק. הימנע חיתוך לתוך כרית שומן החלב ולהבטיח שלא לחתוך את המעיים, הכבד, או הסרעפת.
הניחו כרית גזה "4 x 4 ספוגה תמיסת מלח סטרילית בצד השמאלי של העכבר, שבו החתך נעשה, כך האיברים הפנימיים ניתן למקם על גזה ולא באים במגע עם העור שמסביב או אזור הניתוח.
כן תאים סרטניים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים כמו תאים סרטניים יישבו במהלך תקופת ההכנה של העכבר. הכן מזרק מחט נשלף 25 μl ומחט 32 מד עם תאים סרטניים. לדחוף את הבוכנה עד תאים סרטניים נמצאים קצה המחט ואת הבוכנה היא בווליום המתאים להזרקה; למנוע הזרקת בועות אוויר.
נגב את החלק החיצוני של המחט עם כרית אלכוהול סטרילי כדי להסיר כל תאים סרטניים חיצוניים. היזהר כדי למנוע מקלות מחט.
החזק את sid החציונידואר של החתך, כולל עור והצפק, הצידה עם מלקחיים ולהשתמש מקלון צמר גפן סטרילי כדי למשוך את המעי הגס בזהירות קטן החוצה, הצבתם על גזה סטרילי טבול תמיסת מלח סטרילית. משוך את מעי גס והקטן עד וריד השער הוא מדמיין.
מכסים את האיברים הפנימיים של גזה ספוג מלח כדי לשמור על לחות פנימית ועקרות.
יש עוזר, גם לובשים כפפות סטריליות, להחזיק את המעיים עטופים הגזה המלוחה ספוג בעדינות מהדרך עם צמר גפן סטרילי הטה ספוגית כדי לחשוף את וריד השער מלא. בנוסף, ייתכן שיהיה צורך להשתמש hemostat autoclaved או מלקחיים להחזיק רקמות הצידה בצד החציוני של החתך.
הכנס את המחט טעון עם תאים סרטניים ~ 3 - 5 מ"מ לתוך וריד שער ~ 10 מ"מ מתחת הכבד בזווית <5 ° אל הווריד, עם שיפוע כלפי מעלה. לאט לאט להזריק את הווליום המכיל תאים סרטניים. מאפשר לדם לזרום בעבר המחט hEAD במשך כמה שניות כדי למנוע חזרה זרימת תאים סרטניים מתוך הווריד. מזער הזזת המחט בווריד במהלך ההזרקה. שוב, לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע מקלות מחט.
הערה: ויזואליזציה של וריד השער נעשתה ללא גדלה, אולם מיקרוסקופ סטריאו עשוי לשמש אם מועדף.
הסר את המחט תוך שימת זמנית המוליך טיפ גפן סטרילי על הווריד עם הלחץ. עם עוזר עדיין מחזיק את המעיים בצד למקם חתיכה אחת של 0.5 - גזה עוצר דמום 1 ס"מ ² על הזריקה על הווריד.
הערה: אבקת עוצר דמום נוסתה גם על שלב זה בפרוטוקול אבל לא היה יעיל בעצירת איבוד דם ורידי לאחר ההזרקה.
החזק את הגזה עוצרת דמום במקום ההזרקה עם לחץ מצד המוליך טיפ גפן סטרילי במשך 5 דקות.
להעריך סגירת וריד על ידי הרמת גזה עוצר דמום בזהירות, אם מקלות גזה אל הרקמה שמסביב, כמות קטנה של sterilמלוח דואר יכול לשמש כדי להשרות הרים את התחבושת.
אם איבוד הדם מתרחש בשלב זה, למקם פיסה נוספת של גזה עוצרת דמום באתר עם הלחצים 5 דקות נוספות. כאשר זרימת הדם חדל לגמרי, להסיר את התחבושת מעל העכבר.
הערה: איבוד דם במהלך ההליך הכירורגי צריך להיבדק בקפידה אם נפח איבוד דם מותר הכולל נפגש או חריגה (מבוסס על נהלי עבודה סטנדרטיים רגולטורי לעניין לוחות הסקירה המוסדיים של החוקר) העכבר חייב להיות מורדם לאחר הרדמה ידי זלוף לב.
לאחר הזריקה נחשבת ללא פגע, ללא דם עוזב את הזריקה, למקם את האיברים הפנימיים בעדינות בחזרה לתוך חלל הבטן.
לתפור את והצפק ולאחר מכן את העור עם מחט 4-0 vicryl תפר וחידוד סטרילי באמצעות דפוס תפר מתמשך או קטע פשוט. בדרך כלל, סגירת החתך דורשת 10-15 תפרים.
להזריק 100 μl של bupivacaine (5 מ"ג / מ"ל) לאורך באתר חתך לניהול כאב מקומי באמצעות מזרק אינסולין. להזריק 0.5 מ"ל של תת-עורית מלח סטרילית באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26-מד לחות. ניתוחים לקחת 15 - 25 דקות כדי להשלים.
כדי לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל הניתוח, להבטיח כי כל הכלים והחומרים הבאים במגע עם העכבר, כולל בידיים עטויות כפפות, מנקים לפני כראוי לפנות. איפה שימוש אפשרי חומרים וכפפות סטריליות, או מינימלית לנצל פתרון אתנול 70% או 10% פתרון אקונומיקה לניקוי.
אם מספר ניתוחים מתוכננים בפגישה אחת לסדר את אזור הניתוח הראשוני עם וילון סטרילי טרי, מזרקים אינסולין, 1 מ"ל מזרקים, מלח סטרילית, 2 x 2 "ספוגים גזה סטרילי, 4 x 4" גזה סטרילי, גזה עוצר דמום וחותכים 0.5 - 1 ס"מ ² חתיכות, 4-0 תפרים vicryl עם מחט להתחדד, ו -2% כלורהקסידין. חרוזים לעקר את המספריים, מלקחיים, hemostat בין ניתוחים ולאפשרלהתקרר לפני שימוש חוזר כראוי.

שחזור 3., ניטור בריאות מכרסמת, ו ניתוח נקודות קצה

לאחר ההליך הכירורגי הושלמה, לשמור על עכברים על כרית חימום להתאוששות בכלובים מצעים ללא, נקי למשך תקופה מינימלית של 20 דקות. עכברים בדרך כלל לוקחים 2 - 4 דקות להתעורר מן ההרדמה.
אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לשתף למגורים עם בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. אל תשאירו חיה ללא השגחה בזמן שהוא שב להכרתו ולפקח עד שהחיה יש חזר היכולת לקיים את עצמה שכיבה sternal.
תן עכברים 0.05 - 0.1 מ"ג / ק"ג עצירות לניהול כאב בכל ניתוח 6-12 שעות הבאים, לתקופה של עד 72 שעות.
בדקו תפרים יומיים כדי להבטיח שהם יישארו ללא פגע במהלך ריפוי. במקרה כי תפרים נפרמו, הצב את העכבר בהרדמה, להסיר תפרים נותרים, ולהחליף. במקרה של זיהום או inflammation להתייעץ צוות וטרינר.
הערה: זיהום או דלקת לא נחשף אליהן עם פרוטוקול זה.
עבור מחקרים גרורים, לבצע בדיקות תקינות מדי יום עד שעת סימנים חיצוניים של מחלה גרורתית הם נצפו כולל, אך לא רק:> 10% ירידה במשקל / רווח, scruffiness, אובדן תשומת הלב לסביבה, בצקת בטן / מיימת, עיניו בהירות ואוזניים, או עמדה שפופה.
הערה: בדיקות תקינות יומיות חשובות במיוחד בעת פיתוח המודל לשימוש עם קו סלולארי חדש או ריכוז תא עד הציר הזמן של גרורות מובנות היטב.
בסוף נקודות מחקר, להרדים עכברים משאיפת CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם.
הערה: שיטות חלופיות של המתת חסד אושרה על ידי ועדת הביקורת של החוקרים עשויים לשמש, כולל זלוף עם 1x PBS לאחר הרדמה. זלוף של הכבד מתבצע על ידי cannulating וריד השער, לגזום את הווריד הנבוב הנח, ודוחף ה 1x PBSכלי הדם בכבד מחוספס בשיעור של 4 מ"ל / דקה 1 - 2 דקות כדי להסיר במחזור הדם לויקוציטים.
הערה: בהתאם הקצה לחקר, הקו הסלולרי, ואת הריכוז בשימוש, גרורה בכבד גלוי עשויים או לא עשוי להיות נראה לעין necropsy. נגעי Micrometastatic עשויים להתגלות עם ניתוח היסטולוגית של הכבד. נקודות קצה ישתנה בהתאם לצורת המחקר.
חלץ את הכבד עם מספרי מלקחיים על ידי הסרת כיס המרה הראשונה, ולאחר מכן לחתוך את הווריד הנבוב הנח מעולה אל הכבד. חותך דרך הווריד הנבוב, וריד שער, ואת כבד עורק נח אל הכבד.
הסר את הכבד כולו בעדינות ולשטוף 5x ב 1x PBS.
הפרד את הכבד לתוך שמאלה, ימינה, חציון, ואת האונות caudate.
הכבד לתקן פורמלין ב 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין למשך 48 שעות תוך רעד בטמפרטורת החדר. תהליך רקמות באמצעות סדרה של כהלים לגידול בריכוזיות קסילן; פרפין להטביע את הרקמה הקבועה ⁷¹ הערה: לחילופין, הכבד ניתן snap-קפוא על ידי הצבת רקמה cryomold עם חיתוך הטמפרטורה האופטימלית (OCT) הנוסחה והקפאת על כדורי קרח יבש שקוע 95% אתנול.
1. באמצעות microtome, וחותכים את גוש רקמות מוטבע פרפין כך גודל של רקמות התאמה ראש מתגלה.
2. חותך חמישה 4 מיקרון קטעי סדרתי, זה מהווה את הרמה הראשונה לניתוח.
3. חותכים דרך 250 מיקרון של רקמות, לזרוק סעיפים אלה בתוך הפסולת.
4. ממרחק של 250 מיקרון לחתוך רמה שנייה של חמישה קטעים סדרו 4 מיקרון.
5. חזור על הצורך לסעיף דרך הכבד כולו. Hematoxylin ו כתם eosin את החלק הראשון של כל רמה כדי להעריך גרורות ^72.
  הערה: לקבלת רקמות Snap-קפוא להשתמש cryostat לחתוך חלקים.
  הערה: איתור של המחלה micrometastatic ידרוש תאים סרטניים מכתים ספציפיים.
הסר עכברים ממחקר אם יש צמיחת הגידול ב החתך לשבתדואר, כמו זה מציין זליגת תאים סרטניים לתוך חלל הצפק לאחר ההזרקה.
הערה: בעיה זו לא נצפתה.

Representative Results

מודל ההזרקה לוריד פורטל, שבו תאים סרטניים מועברים ישירות אל הכבד באמצעות הליך כירורגי, מאפשר הזרקה של תאי גידול לתוך וריד השער. בתנאי חיטוי, ב עכבר הרדים, מצוין ~ חתך ניתוחי 1 אינץ נעשה בצד השמאלי של העכבר בין המטוסים החציוני ועל sagittal, החל רק מעל למישור של הפטמה בלוטת חלב מפשעתי הרביעית וכלה בדיוק מתחת לצלעות . המעיים גדולים וקטנים הם משכו בעדינות דרך חתך לספק הדמיה של וריד השער (איור 1 א). זיהוי אנטומי מדויק של וריד פורטל הזרקה תוך-פורטל מוצלח יכול להיות מאושר על ידי תרגול פרוטוקול הזרקת בדיו או צבע דומה. הזרקת נכון דרך וריד הפורטל תגרום הדיו מועבר מיד ובאופן ספציפי אל הכבד, ולא לגרום התפשטות דיו הודו אל הריאות (figuמחדש 1B). יתר על כן, באמצעות העכבר D2A1 תאים החלב הגידול מתויג עם GFP, פיזור של תאים סרטניים בתוך הכבד ניכר בגיל תשעים דקות לאחר ההזרקה, המאשר משלוח הזרקה לווריד פורטל אל הכבד (תרשים 1C). בהגדלה גבוהה יותר מתברר כי ב 90 דקות לאחר ההזרקה, תאים סרטניים נמצאים בתוך sinusoids, כמו גם בתוך parenchyma הכבד בסמיכות השלשות פורטל, שם הדם פורטל וריד נכנס הכבד (תרשים 1C). נתונים אלה מראים כי extravasation גידול התא הפעיל מתרחש ב 90 דקות הזרקת תא שלאחר הגידול. יחדיו, נתונים אלה מאשרים כי מודל ההזרקה לוריד פורטל מספק את עוצמת הזריקה ישירות אל הכבד, עם תאי דיו או גידול פזור הכבדה אין תחבורה ניכרת של נפח הזרקה אל הריאות.

כדי להעריך חוסנו של המודל הזרקה לווריד פורטל, שלושה separאכול שורות תאים סרטניים חלב עכבר syngeneic נבדקו בעכברי Balb / c נקבה בוגרת. קווי גידול חלב אלה נבחרו על סמך ההתנהגות המאופיינת שלהם במודלי כרית שומן חלב וכוללים את קו 4T1 תאים אגרסיווי גרורתי מאוד, קו D2A1 גרורתי פחות אגרסיווי, וקו D2.OR הנמוך / לא גרורתי ^{37,61,73 , 74.} 2,000 ו -10,000 תאים לכל הזרקה נבדקו ללא הבדלים בולטים בזמן להתפתחות גרורה גלוי עם ריכוזי תא הנמוכים אלה. עבור מחקרים אלה סמנים פונדקאיים של גרורות שמשו כגון חוסר טיפוח, חיוורון, וירידה במשקל כדי להצדיק necropsy, שעליו קיומו או אי קיומו של גרורות בכבד אושר על ידי הערכה חזותית של הכבד ואיברים אחרים כדי לאשר משלוח תוך-פורטל . נתונים אלה מאשרים דיווחים קודמים כי שורות תאי 4T1 ו D2A1 לייצג קווי גידול חלב אגרסיביים יותר, שיעורי הישרדות ללא גרורות קצרות הם נצפו לעומת עכברים שהוזרקועם קו D2.OR פחות אגרסיבי (איור 2 א). עכברים הוזרקו תאים סרטניים 4T1 או D2A1 פיתח גרורות בכבד גלויה על ידי ~ 30 - 40 ימים לאחר ההזרקה, וכמה פיתח גרורות מוקדם ככל 18 ימים לאחר ההזרקה (איור 2 א), ואילו רק עכבר אחד הוזרקו תאים D2.OR היה גרורה בכבד גלוי מפותח עד סוף המחקר, אשר היה 60 - 65 ימי הזרקת תא שלאחר גידול. גרורות לאחר מכן אושרו על ידי חתך דרך הכבד ב 250 מיקרומטר רמות וניתוח hematoxylin ו eosin (H & E) סעיפים מוכתם (תרשים 2B-D).

בנוסף לגילוי גרור גלוי בכבד העכבר, מודל וריד שער יכול גם להיות מנוצל ללימוד אירועים קודמים במפל גרורתי כולל זיהוי של תאים בודדים / צבירי תאים הבאים extravasation, היווצרות של נגעי מייקרו גרורתי. immunofluorescence מכתים Multiplex שמשכדי לזהות 4T1, D2A1, ותאי הגידול החלב D2.OR בכבד כשהם נוכחים כמו תאים בודדים או נגעים מיקרו-גרורות, כמו H & E אינה מספיקה כדי לאשר את קיומו של נגעים קטנים. 3A איור מראה Balb / c עכבר כבד נציג עם מוקדים המשוערת micrometastatic של תאי D2A1 גידול כי הם חיוביים עבור CK18 קרטין אפיתל, שליליים על CD45 סמן הפאן החיסוני, ושליליים עבור סמן hepatocyte Heppar-1. Hepatocytes גם להכתים חיובי עבור CK18, הדבר מחייב שימוש Heppar-1 בלוח מכתים זה. הערה חשובה אחת היא שתא מרת צינור אפיתל וכבד ובתאים להכתים חיובי עבור CK18, מחייב אפליה זהירה בין תאים סרטניים ודרכי מרה, במיוחד כאשר מעריכים אזורי periportal (איור 3 א). חלופה זמנית immunofluorescence לזהות תאים בודדים יופצו מוקדי micrometastatic היא לנצל קווי גידול חלב syngeneic מתויגים עם פלואורסצנטי ירוק משופרחלבון (eGFP) ו / או בלוציפראז ולבצע IHC עבור התג (תרשים 1C). בשל החיסוני של eGFP, בלוציפראז, וחלבונים אחרים, זה חיוני כדי להשתמש במודלים של עכברים אשר tolerized לחלבונים אלה, כגון עכבר "זוהר הראש" מוסמכות החיסונית רומן מבטא eGFP ו בלוציפראז בבלוטת יותרת המוח הקדמית ^75. עבור זיהוי נגעים macrometastatic קווי syngeneic מתויגות כגון קו הגידול D2A1, את immunofluorescence זמנית CK18 / Heppar-1 / CD45 הוא אידיאלי (איור 3 ב).

איור 1: הזרקת Portal Vein מספקת תאים סרטניים ישירות אל הכבד. א) הזרקה לווריד פורטל; החתך הוא עשה בין החציון ומטוסי sagittal שמאל, מלמעלה המטוס של הפטמה בלוטת חלב מפשעתי הרביעית וכלה ממש מתחת רי כלוב ב. B) Balb / c כבד עם הזרקת PBS (משמאל). בעקבות הזרקת דיו הודו דרך וריד הפורטל, הכבד (באמצע) אבל לא הריאה (מימין) תופס דיו. C) תמונות בסעיף נציג דקה של תאים סרטניים החלב עכבר D2A1 מתויג עם GFP בתוך הכבד עכבר Balb / c ב 90 דקות לאחר ההזרקה של 1 x 10 ⁶ תאים סרטניים דרך וריד הפורטל. כבדי תוקנו בפורמלין, פרפין מוטבע, מחולק, ומוכתמת עם נוגדן אנטי- GFP לגילוי תאים סרטניים. פנל עליון מראה תאים סרטניים צבועים בחום כהה (חיצים) המפוזרים בתוך הכבד, כוכבית מציינת מכתים hepatocyte הלא ספציפית סביב ורידים מרכזיים; סרגל = 300 מיקרומטר. פנלים תחתונים מראים תמונות נציג של תאים סרטניים ב 90 דקות לאחר ההזרקה עדיין קשורה קשר הדוק עם כלי דם; סרגל = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1">
איור 2: תולדה של שורות תאים סרטניים עכבר חלב בכבד בעקבות הזרקת Portal Vein. א) עקום Kaplan-Meier מראים שיעורי הישרדות ללא-גרורות עכברים שהוזרק עם 2,000-10,000 4T1, D2A1, או תאים סרטניים חלב עכבר D2.OR. עכברים הוזרקו תאים סרטניים וכן פיקוח על סימנים של גרורות כולל חוסר הטיפוח, עיניו בהירות, שינויים במשקל. גרורה אושרה בשעת necropsy ועל ידי H & E על סעיפים היסטולוגית של הכבדים. N = 2 4T1 2,000 תאים; 2 4T1 10,000 תאים. N = 2 D2A1 2,000 תאים; 3 D2A1 10,000 תאים. N = 3 D2.OR 2,000 תאים; 3 D2.OR 10,000 תאים. נציג H & E תמונות של B) 4T1 נגעים ב 21 ימים לאחר ההזרקה של 10,000 תאים, C) נגעים D2A1 ב 26 ימים לאחר ההזרקה של 10,000 תאים סרטניים, ו- D) D2.OR נגעים ב59 ימים לאחר הזרקה של 10,000 תאים; סולם ברים = 75 מיקרומטר. נגעים דומים נצפו כאשר 2,000 4T1 או D2A1 תאים סרטניים הוזרקו. אין נגעים התגלו עם 2,000 תאים D2.OR. אין ראיות של גרורות באיברים אחרים או החתך באתר כירורגית באו לידי ביטוי בכל עכבר על מחקרים אלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: איתור של תאים בודדים גרורתי נגעים בכבד העכבר באמצעות Multiplex Immunofluorescence. א) immunofluorescence זמנית נציג של תאים סרטניים D2A1 בתוך הכבד עכבר Balb / c ב 90 דקות לאחר ההזרקה באמצעות מודל הזרקה לווריד פורטל. המכתים נעשה באמצעות ערכה זמנית. משמאל לימין תערוכות DAPI; CD45 לציון לויקוציטים; Heppar-1 עד מרץk hepatocytes; ו CK18 לסמן תאים סרטניים, hepatocytes, אפיתל צינור המרה. תמונה ממוזגת מציגה מקבץ משוער של CK18 ⁺ Heppar-1 ^- CD45 ^- התאים סרטניים D2A1 קשר הדוק עם שלישיית פורטל. חץ = תאים סרטניים D2A1, כוכבית = האפיתל מר צינור; סרגל = 25 מיקרומטר. ב) נגע גרורתי נציג הגלוי D2A1 באמצעות אותה חלונית מכתימה כמו תאים סרטניים א הם CK18 ⁺ ואילו hepatocytes סמוך CK18 ⁺ Heppar-1 ^+; סרגל = 25 מיקרומטר. תמונות נתפסו על מיקרוסקופ עם 20 x 0.8, 40 x 1.3, ו -60 x 1.4 מטרות מצלמת CCD, באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מודל ההזרקה לוריד פורטל עכבר Balb / c מתיר המחקר של נגעי סרטן שד בכבד בהיעדר גרורות רב-איבר מבלבלים וב שורה מוסמכת חיסונית באופן מלא. הפרוטוקול שלנו הוא קידום של הליכים כירורגיים שפורסמו בעבר המאפשרים גישת וריד השער עבור הזרקה של תאים סרטניים באופן ישיר לתוך הכבד ^16,55,56. קידום אחת עשינו הוא להפחית את מספר התאים סרטניים מוזרקים באופן משמעותי מן ≥ 1 x 10 ⁵ תאים / הזרקה ^16,55,56 עד ≤ 10,000 תאים סרטניים / הזרקה. יש לנו גם הרחיב את המודל לחקר גרורות סרטן השד אל הכבד. שימוש בפרוטוקול זה, שתי שורות תאי סרטן שד עם פוטנציאל גרורתי ידוע לפתח גרורות בכבד עם חביון קצר יותר מאשר קו תאים סרטניים חלב שלו יותר. יתר על כן, בנקודות זמן מוקדמות, תאים סרטניים מופצים ברחבי parenchyma הכבד כקבוצות יחידות או קטנות של ce היחידLLS לאחר הזרקת תאים סרטניים. המודל צפוי במטרה לענות על שאלות של יעילות גרורתי כולל extravasation תאים סרטניים, הישרדות התא, תרדמת, ושגשוגם - כל פנוטיפים שתורמים להתפתחות של מחלה גרורתית מיקרו גרורתי וגלויה בכבד.

חשוב לשקול היבטים רבים של פרוטוקול הזרקה לווריד פורטל לפני ייזום מחקרים. בזהירות להחליט על שורות תאים, ריכוז תא, מספר תאים הכולל, נקודות קצה עניין על בסיס מחקרי גישוש קטנים מומלץ בחום. יתר על כן, שימוש מארחים מוסמכים חיסוניים שורות תאי syngeneic הוא בעל חשיבות עליונה להבנת אינטראקציות תא מארח-גידול. חדש שפותח "הראש זוהר" עכבר מבטא eGFP ו בלוציפראז מבלוטת יותרת המוח הקדמית הוא כלי חשוב עבור ביטול תגובות לארח אקסוגניים eGFP ו בלוציפראז, חלבונים משמשים לעתים קרובות כדי לתייג קווי חלב גידול ⁷⁵

חשוב לציין כי מודל הזרקה לווריד פורטל לא לשכפל את מפל גרורתי מלא, אך הוא מוגבל לחקר extravasation תאים סרטניים, אינטראקציות נישה תאים סרטניים הבאים extravasation והתפתחות הגידול. מודלים במדויק לשכפל את מפל גרורה המלא אל הכבד, כגון מתרחש בחולים, יש צורך דחוף. מגבלה נוספת של המודל הזרקה לווריד פורטל היא שזה בתוהו בשל השפעת הניתוח על המארח, בריפוי פצעים ידוע להשפיע התקדמות המחלה ^76,77.

מודל ההזרקה לוריד הפורטל מהווה שיפור על הזרקה אחרתמודלים ללמוד גרורות בכבד, כולל intracardiac ומודלים intrasplenic. באופן ספציפי, מודל הזרקה לווריד הפורטל מאפשר לחקר מגוון גדול של התקדמות המחלה מאשר הדגם intracardiac, אשר מוגבל לעתים קרובות על ידי גרורות במקביל ברקמות אחרות. יתר על כן, מודל וריד השער לא מסובך על ידי הסרת הטחול, כפי שנעשה במודל intrasplenic.

מודל ההזרקה לוריד פורטל עשוי להוכיח כלי שימושי לחקר גרור בכבד בכלל. גרורות בכבד הוא האתר השכיח ביותר של גרורות אדנוקרצינומה הכוללת, עם צמיחה גבוהה במיוחד נרשמה סרטן הלבלב (85% בגרורות הם אל הכבד), המעי הגס אדנוקרצינומה של הרקטום (> 70%), כמו גם הקיבה הוושט (> 30 %) ^1. למרות מודלי גידול ספונטניים orthotopic העיקריים של אדנוקרצינומה לבלב ומעי גס יותר בקלות גרורה בכבד ^78,79, מודל ההזרקה לוריד הפורטל עשוי provדואר שימושי להבנת התהליך גרורתי של הסרטן אלה כפי במסירה מבוקרת של תאים סרטניים מאפשר הערכות ביוכימיים, מולקולריות היסטולוגית בזמנים מוגדרים לאחר הגעת תאים סרטניים. לסיכום, מודל ההזרקה לוריד הפורטל מהווה שיפור חשוב על מודלים גרורים בכבד זמין של סרטן השד, ויכול גם להיות ישים בתחום הגרור בכבד בכלל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
anti-CD45 antibody	BD Pharmingen	550539	Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chemical Depilatory			Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
anti-CK18 antibody	Abcam	ab53118	Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
anti-Green Fluorescent Protein antibody	Vector Laboratories	BA0702	Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose
Heating Pad, x 2 - 3			Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483	For use in cell culture to count cells
Hemostatic Forceps			Stainless steel; multiple suppliers
anti-Heppar-1 antibody	Dako	M7158	Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci
Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge	BD	324702	For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Light Source			Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers
Neutral buffered formalin, 10%	Anatech Ltd.	135	Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology
Opal™ 4-color fIHC kit	PerkinElmer, Inc.	NEL794001KT	Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver
Operating Scissors			Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers
Penicillin/Streptomycin, 100x	Corning	30-002-Cl	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose
Phosphate-buffered Saline			Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sodium Hypochlorite			Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery
Trypan Blue	Life Technologies	T10282	For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS
Trypsin/EDTA, 0.05% (1x)	Gibco	25300-054	Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates