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Cancer Research

एक पोर्टल नस इंजेक्शन मॉडल का अध्ययन करने के लिए स्तन कैंसर का लिवर मेटास्टेसिस

Published: December 26, 2016 doi: 10.3791/54903
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell, Developmental and Cancer Biology, Oregon Health and Science University

Abstract

स्तन कैंसर दुनिया भर में महिलाओं में कैंसर से संबंधित मृत्यु दर का प्रमुख कारण है। 15 माह - जिगर मेटास्टेसिस केवल 4.8 की औसत से बचने की दर से गरीब परिणामों में स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के साथ मामलों के 30% से अधिक की है, और परिणाम में शामिल है। स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के वर्तमान कृंतक मॉडल, प्राथमिक ट्यूमर सेल जेनोग्राफ्ट और सहज ट्यूमर मॉडल सहित, शायद ही कभी जिगर के लिए metastasize। इंट्राकार्डियक और intrasplenic इंजेक्शन मॉडल जिगर metastases में परिणाम है, लेकिन इन मॉडलों या तिल्ली इंजेक्शन स्थल पर ट्यूमर के विकास से बचने के लिए को हटाने की वजह सहवर्ती माध्यमिक साइट मेटास्टेसिस से चकित किया जा सकता है, समझौता प्रतिरक्षा में से। जिगर मेटास्टेसिस मॉडल में सुधार के लिए की जरूरत है, एक murine पोर्टल शिरा इंजेक्शन तरीका है कि ट्यूमर कोशिकाओं को बचाता है, सबसे पहले और सीधे करने के लिए विकसित किया गया था जिगर को संबोधित करने के लिए। इस मॉडल को अन्य अंगों या तिल्ली को हटाने में समवर्ती मेटास्टेसिस की जटिलताओं के बिना जिगर को ट्यूमर कोशिकाओं को बचाता है। चुननाखून की कमी के लिए नियंत्रित करने के लिए इंजेक्शन स्थल पर 10 μl, ≥ 32 गेज सुई, और hemostatic धुंध - imized पोर्टल शिरा 5 प्रोटोकॉल के छोटे इंजेक्शन की मात्रा कार्यरत हैं। के अलग मेटास्टेटिक संभावित परीक्षण किया गया था तीन syngeneic स्तन ट्यूमर लाइनों का उपयोग Balb / सी मादा चूहों में पोर्टल शिरा इंजेक्शन दृष्टिकोण; उच्च मेटास्टेटिक 4T1 कोशिकाओं, मध्यम-मेटास्टेटिक D2A1 कोशिकाओं, और कम मेटास्टेटिक D2.OR कोशिकाओं। ~ 20 एक विलंबता में की ≤ 10,000 कोशिकाओं / इंजेक्शन परिणाम सांद्रता - उच्च मेटास्टेटिक 4T1 और D2A1 लाइनों के साथ जिगर metastases के विकास के लिए 40 दिन, और कम आक्रामक D2.OR लाइन के लिए> 55 दिनों के लिए। यह मॉडल जिगर को स्तन कैंसर मेटास्टेसिस अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, और अन्य कैंसर है कि अक्सर कोलोरेक्टल और अग्नाशय adenocarcinomas सहित जिगर के लिए metastasize के लिए लागू हो सकता है।

Introduction

स्तन कैंसर मेटास्टेसिस जिगर के लिए

जिगर और फेफड़ों की हड्डी 1-3 के साथ-साथ, स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के एक आम साइट है। स्तन कैंसर के रोगियों में यकृत मेटास्टेसिस 4.8 से 15 महीने 6-9 जिगर मेटास्टेसिस पर्वतमाला के साथ स्तन कैंसर के रोगियों की औसत अस्तित्व के रूप में, बहुत गरीब परिणामों 4,5 के लिए एक स्वतंत्र शकुन कारक है। इसके विपरीत, फेफड़ों या हड्डी मेटास्टेसिस के साथ स्तन कैंसर के रोगियों 9 27.4 महीनों 8,9 और 16.3 से 56 महीनों 8,10-12 क्रमश: औसत उत्तरजीविता दर है। मेटास्टेसिस एक multistep प्रक्रिया, मेटास्टेटिक झरना है, जो प्राथमिक ट्यूमर में ट्यूमर सेल प्रसार के साथ शुरू होता है और बोने और एक दूर के अंग 13-15 भीतर ट्यूमर कोशिकाओं घूम के परिणाम के कारण रोगी मृत्यु दर के साथ समाप्त होता है के रूप में भेजा है। मेटास्टेसिस के कृंतक मॉडल से पता चला है कि मेटास्टेटिक झरना उल्लेखनीय अक्षम है, केवल 0.02 के साथ - 10%के प्रकट मेटास्टेसिस 16,17 स्थापना ट्यूमर कोशिकाओं घूम। मेटास्टेटिक अक्षमता से एक बड़ी अड़चन समझ साइट विशेष मेटास्टेसिस के महत्व पर प्रकाश डाला, माध्यमिक स्थलों पर अद्वितीय ऊतक microenvironments से तय, मेटास्टेटिक आलों 18 कहा जाता है। मेटास्टेटिक आला पुनरावृत्ति की साइट के लिए अद्वितीय है, और है, भाग में, अलग-अलग बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन 19,20 के बयान, विभिन्न प्रतिरक्षा सेल आबादी 21-23 की घुसपैठ, और कई साइटोकिन्स के dysregulated उत्पादन सहित बदल ऊतक homeostasis की विशेषता, chemokines, और वृद्धि कारकों 15,18,24,25। इस प्रकार, ऊतक विशिष्ट मेटास्टेटिक आला की एक समझ कैसे metastatic रोग को निशाना बनाने की एक समझ पछाड़ दिया है। हालांकि, यकृत मेटास्टेसिस के मजबूत मॉडल कमी कर रहे हैं। इसके अलावा, जिगर मेटास्टेसिस के बेहतर मॉडल स्तन कैंसर के रोगियों के लिए वाई उपन्यास लक्ष्य और प्रभावी उपचार की पहचान करने के लिए आवश्यक हो जाएगावें जिगर metastases।

स्थापित जिगर के लिए अध्ययन करने के लिए स्तन कैंसर मेटास्टेसिस मॉडल

वर्तमान में उपलब्ध मॉडल स्तन कैंसर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए जिगर प्रतिरक्षा समझौता चूहों में मानव कैंसर कोशिका xenografts शामिल हैं। / - -, या एस.सी.आई.डी प्रतिरक्षा समझौता murine मेजबान टीम 26-29 ये मॉडल आम तौर पर इस तरह के एमसीएफ-7 और एमडीए MB-231 और नंगा, Rag1 के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों का उपयोग करें। Xenograft मॉडल मानव निकाली गई कैंसर कोशिका लाइनों को शामिल करने का लाभ प्रदान करते हैं, हालांकि, मेटास्टेसिस 30-32 में और चिकित्सीय प्रतिरोध 33-35 में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए हाल ही में प्रशंसा दिया, एक पूरी तरह से प्रतिरक्षा सक्षम मेजबानी में मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए सर्वोपरि है। प्रतिरक्षा सक्षम मेजबान टीम में जिगर को स्तन कैंसर मेटास्टेसिस अध्ययन करने के लिए मॉडल के साथ या बिना शल्य स्तन वसा पैड में syngeneic ट्यूमर कोशिकाओं (जैसे, 4T1 और D2A1 सेल लाइनों) के ओर्थोटोपिक इंजेक्शन शामिलप्राथमिक ट्यूमर की लकीर, और मेटास्टेसिस 36-38 के बाद के आकलन। ध्यान से, ओर्थोटोपिक प्रत्यारोपण मॉडल से यकृत मेटास्टेसिस की दर बहुत कम या न के बराबर जैसे फेफड़ों 39,40 के रूप में अन्य मेटास्टेटिक साइटों की तुलना में है, या के बाद फेफड़ों मेटास्टेसिस की स्थापना की है तब होता है, जिगर-विशिष्ट मेटास्टेसिस 37,39 के अध्ययन उलझी ।

सहज अनुवांशिक इंजीनियर स्तन कैंसर मॉडल से ट्यूमर explants syngeneic ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में भोले सेनाओं के स्तन वसा पैड में फिर से इंजेक्शन जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में सूचना मिली थी कि K14 Cre ECAD एफ / एफ P53 एफ / एफ चूहों से सहज ट्यूमर है जो मॉडल आक्रामक lobular कार्सिनोमा स्तन, ट्यूमर विकसित जब orthotopically wildtype मेजबान टीम में इंजेक्शन। इन ट्यूमर की शल्य लकीर के बाद एक बार वे 15 मिमी 2 तक पहुँचते हैं, चूहों का 18% जिगर मेटास्टेसिस 40,41 के लिए आगे बढ़े। एक तीसरा दृष्टिकोण जिगर मेटास्टेसिस का इस्तेमाल करने के लिए मॉडलअनुवांशिक इंजीनियर चूहों में सहज मेटास्टेसिस। तिथि करने के लिए, स्तन कैंसर मेटास्टेसिस की सहज murine मॉडल की रिपोर्ट है कि आसानी से जिगर में फैल असामान्य हैं। अपवाद H19-IGF2, P53 एफपी / एफपी MMTV-CRE वैप Cre, और K14 Cre ECAD एफ / एफ P53 शामिल एफ / एफ अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल है, जहां जिगर मेटास्टेसिस चूहों के कम प्रतिशत में विकसित 38,41- 43। इस प्रकार, जबकि अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल मेटास्टेटिक झरना, शक्तिशाली और चिकित्सकीय प्रासंगिक मॉडल उपलब्ध कराने के सभी चरणों के अध्ययन की सुविधा है, वे जिगर मेटास्टेसिस 38 की कम दरों की वजह से सीमित हैं।

कई मेटास्टेसिस मॉडल प्राथमिक ट्यूमर और intravasation से ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार सहित मेटास्टेटिक झरना के प्रारंभिक कदम बायपास। इन मॉडलों को परिस्त्राव से माध्यमिक स्थलों पर ट्यूमर की स्थापना के लिए मेटास्टेटिक झरना के बाद के चरणों में जांच की अनुमति। intracardiac इंजेक्शन मॉडल बाएं वेंट्रिकल, जो महाधमनी के माध्यम से संचार प्रणाली में ट्यूमर कोशिकाओं को वितरित करता है में ट्यूमर कोशिकाओं को बचाता है। इंट्राकार्डियक इंजेक्शन सफल इंजेक्शन पुष्टि करने के लिए कोशिकाओं की आवश्यकता इंजेक्शन साइट या ऐसे luciferase की bioluminescence के रूप में अन्य इमेजिंग तौर तरीकों का अल्ट्रासाउंड निर्देशित इमेजिंग टैग की गईं। बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से ट्यूमर सेल इंजेक्शन हड्डी, मस्तिष्क, फेफड़े, और / या जिगर मेटास्टेसिस, अन्य अंगों 44-48 के बीच में हो सकता है। क्योंकि बहु अंग मेटास्टेसिस की, इन चूहों अक्सर प्रकट जिगर मेटास्टेसिस के विकास से पहले euthanized किया जाना है, पूरी तरह से जिगर के भीतर मेटास्टेटिक विकास की जांच करने की क्षमता को नकार जरूरत है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण उल्लेखनीय है कि बहु साइट मेटास्टेसिस के विकास को कम करता है intrasplenic इंजेक्शन मॉडल है। Intrasplenic इंजेक्शन प्लीहा नस कि बेहतर mesenteric नस के साथ जुड़ जाता पोर्टल शिरा 49,50 बनने के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं को बचाता है। पशु outgr के लिए नजर रखी जा सकतीजिगर में मेटास्टेटिक घावों की owth क्योंकि अन्य स्थलों पर मेटास्टेसिस के गठन दुर्लभ है, और एक परिणाम के रूप में, पशु के समग्र स्वास्थ्य 49,50 बनाए रखा है। हालांकि, यह ध्यान दें कि intrasplenic मॉडल प्लीहा ट्यूमर 49,50 से बचने के लिए splenectomy आवश्यकता है एक प्रक्रिया है कि प्रभावों प्रतिरक्षा समारोह में महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, myocardial ischemia reperfusion चोट Ly6C + एककेंद्रकश्वेतकोशिका सबसेट है कि तिल्ली से ही शुरू और घाव भरने ischemia 51,52 निम्न दौरान phagocytic और प्रोटिओलिटिक गतिविधि के लिए जिम्मेदार हैं की घुसपैठ की विशेषता है। Splenectomy के साथ, वहाँ एककेंद्रकश्वेतकोशिका आबादी में मनाया कमी है कि घाव में सहायता चिकित्सा 52 है। इसके अलावा, splenectomy विशेष रूप से घूम और इंट्रा-ट्यूमर CCR2 + CD11b + Ly6C + monocytic myelo की संख्या में कमी के माध्यम से, एक गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के मॉडल में प्राथमिक ट्यूमर के विकास और फेफड़ों मेटास्टेसिस को कम करने के लिए दिखाया गया हैआईडी कोशिकाओं 53। इसके अतिरिक्त, पेट के कैंसर की कोशिकाओं की intrasplenic इंजेक्शन के बाद splenectomy mesenteric लिम्फ नोड्स और ऊंचा जिगर मेटास्टेसिस 54 में विरोधी ट्यूमर प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के कम स्तर में हुई। संक्षेप में, इन निष्कर्ष बताते हैं कि splenectomy मेटास्टेटिक सेल भाग्य के लिए बाद में परिणामों के साथ प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका समझौता।

लिवर मेटास्टेसिस के पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल

एक पूरी तरह से प्रतिरक्षा सक्षम मेजबानी में जिगर को स्तन कैंसर मेटास्टेसिस, शर्तों जहां चूहों बहु अंग मेटास्टेसिस के कारण समझौता नहीं कर रहे हैं के तहत जांच करने के लिए एक पोर्टल नस इंजेक्शन मॉडल विकसित किया गया था। Intraportal इंजेक्शन मॉडल कोलोरेक्टल 55,56 और 16 मेलेनोमा सेल लाइनों के जिगर मेटास्टेसिस अध्ययन करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है; यहाँ हम syngeneic स्तन ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस मॉडल करने के लिए intraportal इंजेक्शन के आवेदन का वर्णन है। इस मॉडल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैप्रकट घावों में स्तन कैंसर सेल परिस्त्राव और बोने, ट्यूमर सेल भाग्य मौत / प्रसार / निद्रा के बारे में निर्णय, और परिणाम सहित मेटास्टेटिक झरना के बाद के चरणों। इस मॉडल में, syngeneic स्तन ट्यूमर सेल लाइनों के माध्यम से प्रतिरक्षा सक्षम Balb / सी मादा चूहों के पोर्टल शिरा, एक तरीका है कि तिल्ली को हटाने के बिना जिगर के लिए सबसे पहले और सीधे ट्यूमर कोशिकाओं को बचाता है इंजेक्ट कर रहे हैं। इस मॉडल, चार स्तन ट्यूमर सेल लाइनों है कि उच्च करने के लिए कम से उनकी मेटास्टेटिक क्षमता में सीमा कार्यरत थे के उपयोग को विकसित करने के लिए: D2.OR, D2A1, और 4T1, और करने के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (D2A1 GFP) के साथ टैग D2A1 कार्यरत है जल्दी समय अंक ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद जांच। 4T1 एक अत्यधिक मेटास्टेटिक सेल 410.4 ट्यूमर है कि अनायास एक MMTV + Balb / सी महिला माउस 36,37 में पैदा हुई और फेफड़े, यकृत, मस्तिष्क, और हड्डी स्तन वसा पैड प्राथमिक ट्यूमर 39,57,58 से metastasizes से निकाली गई रेखा है। D2A1 ट्यूमर कोशिकाओं werई भी मूल रूप से एक सहज स्तन ट्यूमर डी 2 hyperplastic वायुकोशीय गुत्थी कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के बाद एक Balb / सी की मेजबानी में उत्पन्न होने से निकाली गई, और फेफड़ों 59,60 करने के लिए प्राथमिक ट्यूमर से मेटास्टेटिक होने की पुष्टि कर रहे हैं। D2.OR ट्यूमर कोशिकाओं वे शायद ही कभी दूर मेटास्टेसिस 60,61 स्थापित हालांकि वे प्राथमिक ट्यूमर से बचने और माध्यमिक साइटों पर पहुंच D2A1 लाइन के लिए एक गैर-मेटास्टेटिक बहन लाइन कर रहे हैं और।

इसके अतिरिक्त, यह गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं (NSAIDs) के दौरान या शल्य प्रक्रिया के बाद सहित आमतौर पर कार्यरत दर्द प्रबंधन दवाओं के उपयोग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। एनएसएआईडी कुछ स्तन कैंसर 62-65 में विरोधी ट्यूमर गतिविधि है, और एनएसएआईडी के कुछ वर्गों हेपटोटोक्सिसिटी 66,67 के खतरे को बढ़ा, संभावित जिगर मेटास्टेटिक आला जिगर मेटास्टेसिस के अध्ययन और समझौता किए। इसके अलावा, अध्ययन बताते हैं कि एनएसएआईडी सीधे ऊतक microenvironment को प्रभावित करती है, समर्थक मेटास्टेटिक ext को कम करनेracellular मैट्रिक्स प्रोटीन tenascin-सी 68 और तंतुमय कोलेजन 62,65। वैकल्पिक रूप से, एक opioid व्युत्पन्न, buprenorphine का उपयोग करते हैं, कृंतक दर्द प्रबंधन 69 में इसकी क्षमता की वजह से और सबूत की कमी के कारण इस्तेमाल किया गया था कि नशीले पदार्थों विरोधी ट्यूमर गतिविधि 70 की है। इस पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल 5 के छोटे इंजेक्शन की मात्रा के लिए अनुकूलित किया गया था - 10 μl जिगर को अनावश्यक नुकसान से बचने के लिए। मॉडल भी छोटे व्यास (≥ 32 गेज) और तुरंत प्रक्रिया के दौरान खून की कमी को कम करने के लिए इंजेक्शन के बाद hemostatic धुंध के उपयोग के साथ सुइयों शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया था। इन अनुकूलित इंजेक्शन मापदंडों के विपरीत, सेल नंबर एक व्यक्तिगत आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए सेल लाइन के tumorigenic क्षमता पर आधारित है। हालांकि, ≤ 10,000 कोशिकाओं लंबे समय तक अध्ययन के लिए / इंजेक्शन से शुरू की सिफारिश की है। छोटे कद के समापन (जैसे, 24 घंटे बाद इंजेक्शन) काफी अधिक ट्यूमर कोशिकाओं (उदाहरण के लिए,1 x 10 5 - 1 x 10 6) अगर warranted इस्तेमाल किया जा सकता है। सारांश में, पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल यहाँ विस्तृत जिगर को स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है और अन्य जिगर मेटास्टेसिस मॉडल की सीमाओं की एक संख्या में गतिरोध उत्पन्न। यह मॉडल ट्यूमर सेल परिस्त्राव, बोने, प्रतिरक्षा सक्षम murine मेजबान टीम में अस्तित्व, प्रसार, और निद्रा, और मेटास्टेटिक परिणाम के शुरुआती भाग्य के फैसले के अध्ययन की सुविधा।

Protocol

इस लेख में सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की और ओरेगन स्वास्थ्य और विज्ञान विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. शल्य चिकित्सा क्षेत्र और उपकरणों की तैयारी

  1. 30 मिनट के लिए 124 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा कैंची, संदंश, और hemostat तैयार, 1 - 2 दिन की योजना बनाई सर्जरी से पहले। शल्य चिकित्सा के बाद स्वास्थ्य लाभ के लिए Autoclaved या बाँझ बिस्तर, पिंजरों, और भोजन के लिए उपयोग किया जाता है।
  2. , एक सड़न रोकनेवाला शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार अधिमानतः एक लामिना का प्रवाह हुड में।
    1. 10% ब्लीच के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र की सभी सतहों के नीचे साफ कर लें, हीटिंग पैड, प्रकाश स्रोत, संज्ञाहरण ट्यूबिंग और नाक शंकु, और शल्य सूट है कि शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के बहुत पास में हो जाएगा के किसी अन्य हिस्से भी शामिल है, जबकि यह प्रदर्शन किया जा रहा है ।
    2. मम्मियाँ शल्य चिकित्सा क्षेत्र में, बाँझ कपड़ा, प्रकाश स्रोत, संज्ञाहरण ट्यूबिंग और nosecone, इंसुलिन सीरिंज से साफ हीटिंग पैड जगह1 मिलीलीटर सीरिंज, Bupivacaine, कृत्रिम आँसू, बाँझ खारा, 2 एक्स 2 "बाँझ धुंध स्पंज, 4 x 4" बाँझ धुंध में 0.5 hemostatic धुंध कटौती - 1 सेमी 2 टुकड़े, कैंची, संदंश, hemostat, 4-0 vicryl टांके घटना सुई, और एक autoclaved कंटेनर में 50 मिलीलीटर 2% Chlorhexidine gluconate के साथ।
    3. सुनिश्चित करें बर्फ पर संग्रहीत तैयार ट्यूमर कोशिकाओं के लिए इस अंतरिक्ष में जगह नहीं है।
    4. बेंच शल्य चिकित्सा क्षेत्र से सटे पर, एक दूसरे हीटिंग पैड और बाँझ बिस्तर के साथ स्वच्छ पिंजरों के साथ वसूली के क्षेत्र तैयार करते हैं।
      नोट: इस तरह के एक मनका अजीवाणु के रूप में इस क्षेत्र में भी घर आइटम कर सकते हैं।

2. पोर्टल शिरा इंजेक्शन

  1. एक घंटे की योजना बनाई इंजेक्शन से पहले, Balb / सी मादा आयु वर्ग के 8 चूहों का इलाज - 0.015 मिलीग्राम / एमएल buprenorphine, subcutaneously के 100 μl के साथ 15 सप्ताह, दर्द प्रबंधन के लिए।
    नोट: यह इंजेक्शन प्रोटोकॉल उचित उपयोग कर किसी भी उम्र में महिला या पुरुष माउस के किसी भी तनाव के लिए लागू किया जा सकता है,तनाव में परिवर्तन के लिए सेल लाइनों।
  2. सेल लाइन या पसंद का ट्यूमर explant के लिए प्रोटोकॉल के आधार पर इंजेक्शन के लिए ट्यूमर कोशिकाओं को तैयार करें। murine रोगाणुओं की उपस्थिति के लिए सभी ट्यूमर सेल लाइनों प्रशासन से पहले टेस्ट जानवर कॉलोनी में इस तरह के रोगजनकों शुरू करने के जोखिम को कम करने के लिए।
    1. syngeneic Balb / सी 3 दिन पहले इंजेक्शन के लिए D2A1, D2.OR, और 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं, पिघलना कोशिकाओं को एक 10 सेमी टिशू कल्चर थाली में भी शामिल ट्यूमर सेल लाइनों के लिए कि इस तरह के अगले दिन कोशिकाओं ~ 90 पर कर रहे हैं - 100% confluency।
    2. 1 दिन में एक बार 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% trypsin के 2 मिलीलीटर का उपयोग कर मिला हुआ ट्यूमर कोशिकाओं trypsinize के साथ निम्न ट्यूमर सेल पिघलना धोने कोशिकाओं। पूरा मीडिया के 8 मिलीलीटर (DMEM उच्च ग्लूकोज, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल glutamine, और 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) और पारित होने 01:10 पूरा मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ एक ताजा 10 सेमी डिश में जोड़ें।
    3. इंजेक्शन के दिन, 1x पीबीएस और टी के साथ एक बार कोशिकाओं को धोजैसा कि ऊपर वर्णित rypsinize।
    4. 1,500 XG पर पूरा मीडिया, 5 मिनट के लिए स्पिन के 8 मिलीलीटर में trypsinized कोशिकाओं resuspend, पीबीएस 1x 5 मिलीलीटर में मीडिया और resuspend को हटा दें।
    5. एक hemocytometer व्यवहार्यता आकलन के लिए trypan नीले बहिष्कार का उपयोग करने पर कोशिकाओं की गणना। एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता और मात्रा पर 1x पीबीएस में इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं Resuspend।
      नोट: 5 - के रूप में छोटे इंजेक्शन की मात्रा जिगर को अनावश्यक नुकसान को रोकने के 10 μl की सिफारिश की है।
    6. इंजेक्शन की अवधि के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें। इंजेक्शन के पूरा होने के बाद 1 दिन के लिए पूरा मीडिया में प्रयोगशाला के लिए कोशिकाओं का एक नमूना लौटने और संस्कृति में जगह सुनिश्चित करने के लिए व्यवहार्यता।
  3. 2.5% isoflurane (2-क्लोरो-2- (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-ईथेन) ऑक्सीजन में दिया - संज्ञाहरण के तहत माउस 2 के साथ रखें। हीटिंग पैड का उपयोग कर शरीर के तापमान को बनाए रखें। एक पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए एक प्रतिक्रिया के लिए आकलन करने से पूरा anesthetization सुनिश्चित करने, और उसके बाद anesthe बनाए रखने के2.5% isoflurane - 2 पर SIA।
    नोट: यह साँस लेने की दर जानवरों पर नजर रखने और प्रक्रिया के दौरान तदनुसार isoflurane प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. हर आंख के ऊपर कृत्रिम आँसू या पशु चिकित्सक मरहम की एक छोटी राशि की जगह शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान आंखों की अत्यधिक सुखाने से बचने के लिए।
  5. एक लापरवाह स्थिति में माउस जगह है, पेट से अवगत कराया साथ अपनी पीठ पर।
  6. रासायनिक लोमनाशक के साथ क्षेत्र पोंछते द्वारा 4 वें वंक्षण स्तन ग्रंथि निप्पल करने के लिए नीचे दूसरी पसली अंतरिक्ष से कृंतक के उदर बाईं ओर बाल निकालें। 2 मिनट के लिए और फिर धुंध और एच 2 ओ यह कदम 1 से किया जा सकता है के साथ पूरी तरह से हटाने - - समय की बचत करने के लिए अगर कई सर्जरी की योजना बनाई है अग्रिम में 2 दिन लोमनाशक 1 के लिए बैठने के लिए अनुमति दें।
  7. एक 2 एक्स 2 "बाँझ धुंध स्पंज (2% Chlorhexidine में भिगो) ले लो और बालों को हटाने के स्थल पर माउस नीचे पोंछ। पूरे आसपास के क्षेत्र जीवाणुरहित, पूंछ सहित, बैक्टीरियल शेष भाग को कम करने केउपकरणों की amination।
  8. बालों को हटाने की साइट और एक शराब प्रस्तुत करने का पैड के साथ नीचे और आसपास के क्षेत्र को साफ कर लें।
  9. 2% Chlorhexidine और शराब कदम एक बार फिर दोहराना और तीन 2% Chlorhexidine और दो शराब प्रस्तुत करने का पैड washes के एक कुल के लिए नीचे पोंछ एक अंतिम Chlorhexidine के साथ खत्म। अंतिम Chlorhexidine इस तरह पोंछ दें कि रासायनिक आंतरिक अंगों पर हो रही Chlorhexidine से बचने के लिए शल्य साइट के आसपास टपकता नहीं है। नोट: chlorhexidine और त्वचा के लिए शराब और आसपास के फर की बड़ी मात्रा का आवेदन शरीर के तापमान में उल्लेखनीय गिरावट में परिणाम हो सकता है। कदम 2.7-2.9 के दौरान अतिरिक्त मात्रा के साथ मिटा नहीं है। एक हीटिंग पैड के साथ शरीर का तापमान बनाए।
  10. बाँझ दस्ताने और बाँझ ब्लेड के साथ एक निष्फल छुरी का उपयोग करना, माउस के बाएं किनारे पर मंझला और बाण विमानों के बीच त्वचा में एक भी 1 इंच का चीरा बनाने, बस पसलियों के नीचे शुरू करने और सिर्फ चौथे वंक्षण के विमान से ऊपर समाप्त होने के स्तन ग्रंथि चूची।
  11. autoclaved या मनका निष्फल कैंची और संदंश का प्रयोग, पेरिटोनियम में एक समान 1 इंच का चीरा बनाते हैं। स्तन वसा पैड में कटौती से बचें और आंतों, जिगर, या डायाफ्राम कटौती करने के लिए नहीं किया जाता है।
  12. एक 4 x 4 "धुंध पैड माउस, जहां चीरा बनाया गया था, कि इस तरह के आंतरिक अंगों धुंध पर रखा जा सकता है और आसपास की त्वचा या शल्य चिकित्सा क्षेत्र के साथ संपर्क में नहीं आते के बाईं ओर बाँझ खारा में भिगो रखें।
  13. कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा और ट्यूमर कोशिकाओं माउस की तैयारी के दौरान आदी हो जाएगा के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं को तैयार करें। एक 25 μl हटाने योग्य सुई सिरिंज और ट्यूमर कोशिकाओं के साथ 32 गेज सुई तैयार करें। सिरिंज पर पुश जब तक ट्यूमर कोशिकाओं को सुई की नोक पर कर रहे हैं और सवार इंजेक्शन के लिए उचित मात्रा में है; हवा के बुलबुले के इंजेक्शन से बचें।
  14. एक बाँझ शराब पैड के साथ सुई के बाहर साफ कर लें किसी भी बाहरी ट्यूमर कोशिकाओं को हटा दें। सावधानी बरतें सुई चिपक जाती बचने के लिए।
  15. मंझला सिड पकड़ोत्वचा और पेरिटोनियल अस्तर सहित चीरा, एक तरफ संदंश के साथ की ई और एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग सावधानी से, बड़े और छोटे आंतों बाहर खींचने के लिए बाँझ बाँझ खारा में भिगो धुंध पर उन्हें रखने। बड़े और छोटे आंतों बाहर खींचो जब तक पोर्टल शिरा कल्पना की है।
  16. आंतरिक नमी और बाँझपन बनाए रखने के लिए खारा लथपथ धुंध में आंतरिक अंगों को कवर किया।
  17. पूरी तरह से पोर्टल शिरा प्रकट करने के लिए झाड़ू इत्तला दे दी एक सहायक भी बाँझ दस्ताने पहने हुए है, आंतों एक बाँझ कपास के साथ रास्ते से बाहर धीरे खारा लथपथ धुंध में लिपटे पकड़। इसके अतिरिक्त, यह autoclaved hemostat या संदंश का उपयोग करने के लिए चीरा की औसत पक्ष पर एक तरफ ऊतक धारण करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  18. बेवल का सामना करना पड़ के साथ एक कोण <5 ° नस के लिए कम से जिगर नीचे 10 मिमी 5 पोर्टल नस में मिमी ~ - सुई ट्यूमर कोशिकाओं ~ 3 के साथ लोड डालें। धीरे-धीरे पूरी मात्रा ट्यूमर कोशिकाओं से युक्त इंजेक्षन। रक्त अतीत सुई ज प्रवाह करने की अनुमतिकई सेकंड के लिए EAD नस से बाहर ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवाह को वापस करने से बचें। इंजेक्शन के दौरान नस में सुई घूम रहा है कम से कम। फिर, सावधानी का उपयोग सुई चिपक जाती बचने के लिए।
    नोट: पोर्टल शिरा के दृश्य बढ़ाई बिना किया जाता है, लेकिन एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप अगर पसंद इस्तेमाल किया जा सकता है।
  19. सुई निकालें, जबकि एक साथ दबाव के साथ नस पर एक बाँझ कपास टिप applicator रखकर। नस पर इंजेक्शन स्थल पर 1 सेमी 2 hemostatic धुंध - साथ सहायक अभी भी आंतों पकड़े तरफ 0.5 का एक टुकड़ा जगह है।
    नोट: hemostatic पाउडर भी प्रोटोकॉल में इस कदम के लिए प्रयास किया लेकिन इंजेक्शन के बाद शिरापरक खून की कमी को रोकने में कारगर नहीं था।
  20. 5 मिनट के लिए एक बाँझ कपास टिप applicator से दबाव के साथ इंजेक्शन स्थल पर hemostatic धुंध पकड़ो।
  21. ध्यान से अगर धुंध की छड़ें आसपास के ऊतकों, STERIL की एक छोटी राशि के लिए, hemostatic धुंध उठाने से नस के बंद होने का आकलनई खारा लेना और धुंध उठाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  22. खून की कमी इस समय होता है, तो एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए दबाव के साथ स्थल पर hemostatic धुंध के एक अतिरिक्त टुकड़ा जगह है। रक्त का प्रवाह पूरी तरह नहीं रह गया है, जब माउस से धुंध को हटा दें।
    नोट: शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान खून की कमी को ध्यान से मूल्यांकन किया जाना चाहिए और यदि कुल अनुमति खून की कमी की मात्रा मिले या पार किया जाता है (अन्वेषक के संस्थागत समीक्षा बोर्ड के लिए नियामक मानक संचालन प्रक्रियाओं के आधार पर) माउस, जबकि हृदय छिड़काव द्वारा संज्ञाहरण के तहत euthanized किया जाना चाहिए।
  23. एक बार इंजेक्शन साइट बरकरार समझा जाता है, कोई खून इंजेक्शन साइट छोड़ने के साथ, आंतरिक अंगों को धीरे उदर गुहा में वापस जगह है।
  24. पेरिटोनियल अस्तर और फिर एक सरल निरंतर या बाधित सीवन पैटर्न का उपयोग कर बाँझ 4-0 vicryl सिवनी और शंकु सुई के साथ त्वचा सीवन। आमतौर पर, चीरा को बंद 10-15 टांके की आवश्यकता है।
  25. bupi के 100 μl इंजेक्षनvacaine (5 मिलीग्राम / एमएल) के एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर स्थानीय दर्द प्रबंधन के लिए चीरा साइट के साथ। हाइड्रेशन के लिए 26 गेज सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर बाँझ खारा subcutaneously के 0.5 मिलीलीटर इंजेक्षन। पूरा करने के लिए 25 मिनट - सर्जरी 15 से लेते हैं।
  26. सर्जरी के दौरान बाँझ स्थिति बनाए रखने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण और सामग्री सहित दस्ताने हाथ माउस, के साथ संपर्क में आ रहा है, उचित रूप से संपर्क करने से पहले साफ कर रहे हैं। संभव उपयोग बाँझ सामग्री और दस्ताने, या न्यूनतम कहाँ का उपयोग एक 70% इथेनॉल समाधान या 10% ब्लीच समाधान साफ ​​करने के लिए।
  27. एकाधिक सर्जरी एक ही सत्र के लिए योजना बनाई रहे हैं, तो ताजा बाँझ कपड़ा, इंसुलिन सीरिंज, 1 मिलीलीटर सीरिंज, बाँझ खारा के साथ प्रारंभिक शल्य चिकित्सा क्षेत्र का रीमेक, 2 एक्स 2 "बाँझ धुंध स्पंज, 4 x 4" बाँझ धुंध, hemostatic धुंध 0.5 में कटौती - 1 सेमी 2 टुकड़े, शंकु सुई के साथ 4-0 vicryl टांके, और 2% Chlorhexidine। कैंची, संदंश, और hemostat मनका बाँझ सर्जरी के बीच और अनुमतिपर्याप्त रूप से पहले फिर से उपयोग शांत करने के लिए।

3. वसूली, निगरानी कृंतक स्वास्थ्य, और अंत बिंदु विश्लेषण

  1. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया पूर्ण होने के बाद 20 मिनट की एक न्यूनतम के लिए बिस्तर से मुक्त, स्वच्छ पिंजरों में वसूली के लिए एक हीटिंग पैड पर चूहों बनाए रखें। संज्ञाहरण से जगाने के लिए 4 मिनट - चूहे आम तौर पर 2 से लेते हैं।
  2. एक जानवर है कि शल्य चिकित्सा सह बस्ती को अन्य जानवरों के साथ आया है, जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है वापस नहीं है। जबकि यह चेतना वापस आ रहा है एक जानवर की पहुंच से बाहर मत छोड़ो और निगरानी जब तक पशु स्टर्नल लेटना में खुद को बनाए रखने की क्षमता आ गया है।
  3. 0.1 मिलीग्राम / किलो buprenorphine दर्द प्रबंधन के लिए हर 6-12 मानव संसाधन सर्जरी के बाद, अप करने के लिए 72 घंटे के लिए - चूहों 0.05 दीजिए।
  4. दैनिक टांके की जाँच करें सुनिश्चित करने के लिए वे उपचार के दौरान बरकरार रहेगा। मामला है कि टांके पूर्ववत आते हैं, संज्ञाहरण के तहत माउस जगह है, शेष टांके हटा दें, और जगह। संक्रमण या inflamm के मामले मेंव्यावहारिक पशुचिकित्सा स्टाफ से परामर्श करें।
    नोट: संक्रमण या सूजन इस प्रोटोकॉल के साथ सामना नहीं किया गया है।
  5. मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए, दैनिक स्वास्थ्य की जांच करने के लिए जब तक metastatic रोग की जावक संकेत सहित मनाया जाता है, लेकिन सीमित नहीं है:> 10% वजन घटाने / लाभ, scruffiness, परिवेश को ध्यान में कमी, पेट शोफ / जलोदर, पीला आँखें और कान, या एक hunched स्थिति।
    ध्यान दें: दैनिक स्वास्थ्य की जाँच के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं जब एक नया सेल लाइन या सेल एकाग्रता के साथ उपयोग के लिए मॉडल विकसित तक मेटास्टेसिस के समय अच्छी तरह से समझ में आ जाता है।
  6. अध्ययन के अंत बिंदु पर, 2 साँस लेना ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ द्वारा चूहों euthanize।
    नोट: 'जांचकर्ताओं निरीक्षण समिति ने मंजूरी दे दी इच्छामृत्यु के वैकल्पिक तरीकों जबकि संज्ञाहरण के तहत 1x पीबीएस के साथ छिड़काव सहित इस्तेमाल किया जा सकता है। जिगर के छिड़काव cannulating पोर्टल शिरा, अवर रग Cava snipping, और धक्का 1x पीबीएस वें द्वारा किया जाता है1 के लिए 4 मिलीग्राम / मिनट की दर से किसी न किसी तरह जिगर वाहिका - 2 मिनट रक्त और ल्यूकोसाइट्स घूम हटा दें।
    नोट: अध्ययन, सेल लाइन, और उपयोग एकाग्रता के लिए समापन बिंदु पर निर्भर करता है, प्रकट जिगर मेटास्टेसिस या नहीं स्पष्ट शव-परीक्षा में भी हो सकती है। Micrometastatic घावों जिगर के histological विश्लेषण से पता चला जा सकता है। समापन अध्ययन डिजाइन के आधार पर अलग अलग होंगे।
  7. पहले पित्ताशय की थैली को हटाने के द्वारा कैंची और संदंश के साथ जिगर निकालें, तो जिगर बेहतर करने के लिए अवर रग Cava के माध्यम से कटौती। रग कावा, पोर्टल शिरा, और जिगर को नीचा यकृत धमनी के माध्यम से कट।
  8. पूरे जिगर धीरे निकालें और 1x पीबीएस में 5x धो लें।
  9. छोड़ दिया, सही, मंझला, और पूंछवाला खण्डों में जिगर अलग करें।
  10. 48 घंटे के लिए 10% तटस्थ बफर formalin में formalin तय जिगर, जबकि कमरे के तापमान पर मिलाते हुए। प्रक्रिया एकाग्रता और xylene बढ़ाने में एल्कोहल की एक श्रृंखला के माध्यम से ऊतकों; आयल तय ऊतक एम्बेड 71 नोट: वैकल्पिक रूप से, जिगर जा इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) फार्मूले के साथ एक cryomold में ऊतक रखने और 95% इथेनॉल में डूबे हुए सूखी बर्फ छर्रों पर ठंड से स्नैप-जमे हुए हो सकते हैं।
    1. एक microtome का प्रयोग, आयल एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक में कटौती ऐसी है कि ऊतक के एक मैच सिर के आकार का पता चला है।
    2. पांच 4 माइक्रोन सीरियल वर्गों में कटौती, इस विश्लेषण के लिए प्रथम स्तर का गठन किया।
    3. ऊतक के 250 माइक्रोन के माध्यम से कट, कचरे में इन वर्गों फेंक देते हैं।
    4. 250 माइक्रोन से कम पांच 4 माइक्रोन धारावाहिक वर्गों के एक दूसरे स्तर में कटौती।
    5. पूरे जिगर के माध्यम से खंड के लिए आवश्यक के रूप में दोहराएँ। Hematoxylin और eosin दाग हर स्तर के प्रथम खंड मेटास्टेसिस 72 के लिए आकलन करने के लिए।
      नोट: स्नैप जमी ऊतक के लिए एक cryostat का उपयोग वर्गों में कटौती करने के लिए।
      नोट: micrometastatic बीमारी का पता लगाने के ट्यूमर सेल विशिष्ट धुंधला की आवश्यकता होगी।
  11. अध्ययन से चूहों को हटाये अगर वहाँ चीरा में ट्यूमर के विकास है बैठनाई, इस इंजेक्शन के बाद पेरिटोनियल गुहा में ट्यूमर सेल रिसाव को इंगित करता है।
    नोट: यह समस्या नहीं देखा गया है।

Representative Results

पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल है, जो में ट्यूमर कोशिकाओं के एक शल्य प्रक्रिया के माध्यम से जिगर को सीधे वितरित कर रहे हैं, पोर्टल नस में ट्यूमर सेल इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है। एंटीसेप्टिक शर्तों के तहत, एक anesthetized माउस, एक ~ 1 इंच शल्य चीरा मंझला और बाण विमानों के बीच माउस के बाएं किनारे पर बना है, बस चौथे वंक्षण स्तन ग्रंथि चूची के ऊपर विमान शुरू करने और सिर्फ पसलियों के नीचे न खत्म होने वाली । बड़े और छोटे आंतों धीरे पोर्टल शिरा (चित्रा 1 ए) के दृश्य प्रदान करने के लिए चीरा के माध्यम से खींच रहे हैं। पोर्टल शिरा और सफल इंट्रा-पोर्टल इंजेक्शन की सटीक पहचान संरचनात्मक भारत स्याही या इसी तरह की डाई के साथ इंजेक्शन प्रोटोकॉल का अभ्यास द्वारा की पुष्टि की जा सकती है। के माध्यम से पोर्टल शिरा सही इंजेक्शन स्याही जिगर के लिए तुरंत और विशेष रूप से वितरित किया जा रहा में परिणाम होगा, और (फेफड़ों के लिए भारत स्याही प्रसार में परिणाम नहीं होगा figuफिर 1 बी)। इसके अलावा, D2A1 माउस स्तन ट्यूमर GFP के साथ टैग की कोशिकाओं, ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार का उपयोग कर भर जिगर स्पष्ट नब्बे मिनट पर बाद इंजेक्शन जिगर (चित्रा 1 सी) के लिए पोर्टल शिरा इंजेक्शन डिलीवरी की पुष्टि है। उच्च बढ़ाई यह स्पष्ट हो जाता है कि 90 मिनट के बाद इंजेक्शन में ट्यूमर कोशिकाओं sinusoids भीतर, साथ ही जहां पोर्टल शिरा रक्त जिगर (चित्रा 1 सी) में प्रवेश करती पोर्टल तीनों के बहुत पास, जिगर में पैरेन्काइमा भीतर पाए जाते हैं। ये आंकड़े बताते हैं कि सक्रिय ट्यूमर सेल परिस्त्राव 90 मिनट के बाद ट्यूमर सेल इंजेक्शन पर हो रहा है। साथ में ले ली, इन आंकड़ों की पुष्टि है कि पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल, जिगर को सीधे इंजेक्शन की मात्रा बचाता है जिगर और फेफड़ों के लिए इंजेक्शन की मात्रा का कोई सराहनीय परिवहन भर में बिखरे स्याही या ट्यूमर कोशिकाओं के साथ।

पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल की मजबूती का आकलन करने के लिए, तीन separखाया syngeneic माउस स्तन ट्यूमर सेल लाइनों वयस्क महिला Balb / ग चूहों में परीक्षण किया गया। ये स्तन ट्यूमर लाइनों स्तन वसा पैड मॉडल में उनकी विशेषता व्यवहार के आधार पर चयन किया गया था और अत्यधिक आक्रामक और मेटास्टेटिक 4T1 सेल लाइन, कम आक्रामक मेटास्टेटिक D2A1 लाइन, और कम / गैर-मेटास्टेटिक D2.OR पंक्ति में शामिल 37,61,73 74। इंजेक्शन प्रति 2,000 और 10,000 कोशिकाओं कोई उल्लेखनीय इन कम सेल सांद्रता के साथ खुला मेटास्टेसिस के विकास के लिए समय में अंतर के साथ परीक्षण किया गया। इन अध्ययनों के लिए मेटास्टेसिस के किराए की मार्कर संवारने की कमी है, पीलापन, और वजन घटाने के रूप में इस तरह इस्तेमाल किया गया शव-परीक्षा, जिस पर उपस्थिति या यकृत मेटास्टेसिस के अभाव जिगर का दृश्य मूल्यांकन और अन्य अंगों द्वारा पुष्टि की गई पुष्टि करने के लिए इंट्रा-पोर्टल वितरण सही ठहराने के लिए । ये आंकड़े पिछले खबरें हैं कि 4T1 और D2A1 सेल लाइनों इंजेक्शन चूहों की तुलना में अधिक आक्रामक स्तन ट्यूमर लाइनों का प्रतिनिधित्व के रूप में कम मेटास्टेसिस मुक्त जीवित रहने की दरों में मनाया जाता है इस बात की पुष्टिकम आक्रामक D2.OR लाइन (2A चित्रा) के साथ। चूहे ~ द्वारा 30 4T1 या D2A1 ट्यूमर कोशिकाओं को विकसित प्रकट जिगर मेटास्टेसिस के साथ इंजेक्शन - 40 दिनों के बाद इंजेक्शन, और कुछ विकसित मेटास्टेसिस के रूप में के रूप में 18 के शुरुआती दिनों के बाद इंजेक्शन (2A चित्रा) है, जबकि केवल एक माउस D2.OR कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ किया था 65 दिनों के बाद ट्यूमर सेल इंजेक्शन - अध्ययन अंत है, जो 60 था द्वारा विकसित प्रकट जिगर मेटास्टेसिस। मेटास्टेसिस बाद में 250 माइक्रोन के स्तर में जिगर के माध्यम से सेक्शनिंग और hematoxylin और eosin (एच एंड ई) दाग वर्गों (चित्रा 2 बी-डी) का विश्लेषण करके पुष्टि की गई।

माउस जिगर में प्रकट मेटास्टेटिक घावों का पता लगाने के अलावा, पोर्टल शिरा मॉडल भी परिस्त्राव निम्नलिखित एकल कक्षों / सेल समूहों का पता लगाने, और सूक्ष्म मेटास्टेटिक घावों के गठन सहित मेटास्टेटिक झरना में पहले की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स immunofluorescence धुंधला इस्तेमाल किया गया थाजिगर में 4T1, D2A1, और D2.OR स्तन ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए जब वे एकल कक्षों या सूक्ष्म मेटास्टेटिक घावों के रूप में मौजूद हैं, के रूप में एच ई छोटे घावों की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पर्याप्त नहीं है। चित्रा 3 ए D2A1 ट्यूमर कोशिकाओं है कि hepatocyte मार्कर Heppar-1 के लिए उपकला केरातिन CK18 के लिए सकारात्मक, अखिल प्रतिरक्षा मार्कर CD45 के लिए नकारात्मक है, और नकारात्मक रहे हैं की एक ख्यात micrometastatic foci के साथ एक प्रतिनिधि / Balb सी माउस जिगर से पता चलता है। Hepatocytes भी CK18 के लिए सकारात्मक दाग, इस धुंधला पैनल में Heppar -1 के उपयोग की जरूरत महसूस। एक महत्वपूर्ण टिप्पणी है कि पित्त नली उपकला और यकृत कोशिकाओं पूर्वज CK18 के लिए सकारात्मक दाग, ट्यूमर कोशिकाओं और पित्त नलिकाओं के बीच सावधान भेदभाव की आवश्यकता होती है, खासकर जब periportal क्षेत्रों का आकलन (चित्रा 3 ए) है। एक वैकल्पिक syngeneic स्तन ट्यूमर बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट के साथ टैग लाइनों का उपयोग करने के लिए immunofluorescence एकल फैलाया कोशिकाओं और micrometastatic foci की पहचान करने के लिए मल्टीप्लेक्स के लिए हैप्रोटीन (EGFP) और / या luciferase और टैग (चित्रा 1 सी) के लिए आईएचसी प्रदर्शन करते हैं। EGFP, luciferase, और अन्य प्रोटीन की प्रतिरक्षाजनकता के कारण, यह इस तरह के उपन्यास प्रतिरक्षा सक्षम "चमक सिर" माउस है कि EGFP व्यक्त किया और पूर्वकाल पिट्यूटरी ग्रंथि 75 में luciferase के रूप में माउस मॉडल है कि इन प्रोटीनों को tolerized कर रहे हैं, का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। ऐसे D2A1 ट्यूमर पंक्ति के रूप में untagged syngeneic लाइनों की macrometastatic घावों की पहचान के लिए, CK18 / Heppar-1 / CD45 मल्टीप्लेक्स immunofluorescence आदर्श (चित्रा 3 बी) है।

आकृति 1
चित्रा 1: पोर्टल नस इंजेक्शन जिगर को सीधे ट्यूमर कोशिकाओं उद्धार। ए) पोर्टल शिरा इंजेक्शन; चीरा चौथे वंक्षण स्तन ग्रंथि चूची के विमान से ऊपर है और सिर्फ री नीचे समाप्त होने से, मंझला और बाएं बाण विमानों के बीच बना हैख पिंजरे। बी) / Balb सी पीबीएस इंजेक्शन (बाएं) के साथ जिगर। के माध्यम से पोर्टल शिरा भारत स्याही इंजेक्शन के बाद, जिगर (मध्य) नहीं बल्कि फेफड़ों (दाएं) स्याही लेता है। सी) D2A1 माउस स्तन ट्यूमर के माध्यम से पोर्टल शिरा 1 एक्स 10 6 ट्यूमर कोशिकाओं के 90 मिनट के बाद इंजेक्शन पर एक माउस / Balb ग जिगर में GFP के साथ टैग कोशिकाओं के प्रतिनिधि पतली धारा छवियों। यकृत formalin, तय आयल एम्बेडेड, sectioned, और ट्यूमर सेल का पता लगाने के लिए विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। शीर्ष पैनल गहरे भूरे रंग के दाग ट्यूमर कोशिकाओं (तीर) जिगर भर में छितरी हुई है, तारांकन अर्थ केंद्रीय नसों के आसपास गैर विशिष्ट hepatocyte धुंधला पता चलता है; स्केल बार = 300 माइक्रोन। कम पैनल 90 मिनट के बाद इंजेक्शन अभी भी बारीकी वाहिका के साथ जुड़े में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों को दिखाने; पैमाने बार 50 माइक्रोन =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2: पोर्टल शिरा इंजेक्शन के बाद जिगर में माउस स्तन ट्यूमर सेल लाइनों के परिणाम। ए) चूहों में मेटास्टेसिस मुक्त जीवित रहने की दरों दिखा कापलान-मायर वक्र 2,000-10,000 4T1, D2A1, या D2.OR माउस स्तन ट्यूमर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन। चूहे ट्यूमर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन और संवारने की कमी, पीला आँखें, और वजन में परिवर्तन सहित मेटास्टेसिस के संकेत के लिए निगरानी की गई। मेटास्टेसिस शव-परीक्षा के समय में और एच ई द्वारा यकृत के histological वर्गों पर पुष्टि की गई। एन = 2 4T1 2,000 कोशिकाओं; 2 4T1 10,000 कोशिकाओं। एन = 2 D2A1 2,000 कोशिकाओं; 3 D2A1 10,000 कोशिकाओं। एन = 3 D2.OR 2,000 कोशिकाओं; 3 D2.OR 10,000 कोशिकाओं। प्रतिनिधि एच ई 10,000 कोशिकाओं, सी) D2A1 घावों के 21 दिनों के बाद इंजेक्शन से कम 10,000 ट्यूमर कोशिकाओं के 26 दिनों के बाद इंजेक्शन पर डी बी के चित्र) 4T1 घावों, और) D2.OR घावों59 दिनों में 10,000 कोशिकाओं के बाद इंजेक्शन; स्केल सलाखों = 75 माइक्रोन। इसी तरह के घावों मनाया जाता है जब 2,000 4T1 या D2A1 ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्शन थे। कोई घावों 2,000 D2.OR कोशिकाओं के साथ पाया गया। अन्य अंगों में या शल्य चीरा साइट पर मेटास्टेसिस के कोई सबूत नहीं इन अध्ययनों पर किसी भी माउस में स्पष्ट किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एकल कक्षों और Metastatic घावों माउस जिगर में मल्टीप्लेक्स immunofluorescence का उपयोग की जांच। ए) पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल का उपयोग कर 90 मिनट के बाद इंजेक्शन पर एक माउस / Balb ग जिगर में D2A1 ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिनिधि मल्टीप्लेक्स immunofluorescence। धुंधला हो जाना एक मल्टीप्लेक्स किट का उपयोग किया गया था। बाएं से दाएं DAPI पता चलता है; CD45 ल्यूकोसाइट्स चिह्नित करने के लिए; Heppar-1 मार्च कोhepatocytes k; और CK18 ट्यूमर कोशिकाओं, hepatocytes, और पित्त नली उपकला चिह्नित करने के लिए। CD45 - - निकट एक पोर्टल त्रय के साथ जुड़े D2A1 ट्यूमर कोशिकाओं मर्ज किए गए छवि CK18 + Heppar-1 के एक ख्यात क्लस्टर से पता चलता है। तीर = D2A1 ट्यूमर कोशिकाओं, तारांकन = पित्त नली उपकला; स्केल बार = 25 माइक्रोन। बी) के एक प्रतिनिधि प्रकट D2A1 मेटास्टेटिक ए ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में ही धुंधला पैनल का उपयोग घाव हैं CK18 + जबकि आसन्न hepatocytes CK18 + Heppar-1 + कर रहे हैं; स्केल बार = 25 माइक्रोन। छवियाँ 20 x 0.8 के साथ एक माइक्रोस्कोप पर कब्जा कर लिया गया, 40 x 1.3, और 60 x 1.4 उद्देश्यों और सीसीडी कैमरा, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

माउस / Balb ग पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल confounding बहु अंग मेटास्टेसिस के अभाव में जिगर में और एक पूरी तरह से प्रतिरक्षा सक्षम मेजबान में स्तन कैंसर के घावों के अध्ययन के लिए परमिट। हमारी प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं है कि सीधे जिगर 16,55,56 में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए पोर्टल शिरा के लिए उपयोग की अनुमति के लिए एक प्रगति है। एक उन्नति हम बना दिया है काफी 10,000 ट्यूमर कोशिकाओं / इंजेक्शन ≤ को ≥ 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / इंजेक्शन 16,55,56 नीचे से इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए है। हम यह भी जिगर को स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए मॉडल का विस्तार किया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, ज्ञात मेटास्टेटिक क्षमता के साथ दो स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के लिए एक अधिक मौन स्तन ट्यूमर सेल लाइन की तुलना में कम विलंबता के साथ जिगर metastases का विकास। इसके अलावा, जल्दी समय बिंदुओं पर, ट्यूमर कोशिकाओं एकल सीई के एकल या छोटे समूहों के रूप में जिगर पैरेन्काइमा भर में वितरित कर रहे हैंट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद lls। सभी phenotypes कि जिगर में सूक्ष्म मेटास्टेटिक और प्रकट मेटास्टेटिक रोग के विकास में योगदान - मॉडल ट्यूमर सेल परिस्त्राव, सेल अस्तित्व, निद्रा, और प्रसार सहित मेटास्टेटिक दक्षता के सवालों को संबोधित करने के लिए तैयार है।

यह पोर्टल शिरा इंजेक्शन के अध्ययन की शुरुआत करने से पहले प्रोटोकॉल के कई पहलुओं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। ध्यान से सेल लाइनों, सेल एकाग्रता, कुल सेल नंबर, और छोटे खोजपूर्ण अध्ययन के आधार पर ब्याज की अंत अंक पर निर्णय लेने से अत्यधिक की सिफारिश की है। इसके अलावा, प्रतिरक्षा सक्षम मेजबान और syngeneic सेल लाइनों का उपयोग मेजबान ट्यूमर सेल बातचीत को समझने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। नव विकसित "चमक सिर" माउस है कि EGFP व्यक्त किया और पूर्वकाल पिट्यूटरी ग्रंथि से luciferase बहिर्जात EGFP और luciferase के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं को नष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, प्रोटीन अक्सर स्तन ट्यूमर लाइनों 75 टैग करने के लिए इस्तेमाल किया

यह ध्यान रखें कि पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल पूर्ण मेटास्टेटिक झरना नकल नहीं करता महत्वपूर्ण है, लेकिन परिस्त्राव और ट्यूमर के विकास को निम्नलिखित ट्यूमर सेल परिस्त्राव, ट्यूमर सेल आला बातचीत के अध्ययन तक सीमित है। मॉडल सही है कि जिगर को पूर्ण मेटास्टेटिक झरना दोहराने, रोगियों में होता है, जैसे तत्काल जरूरत है। पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल का एक अतिरिक्त सीमा है कि यह घाव रोग प्रगति 76,77 प्रभावित करने के लिए जाना जाता चिकित्सा के साथ, मेजबान पर सर्जरी के प्रभाव से चकित किया जाता है।

पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल अन्य इंजेक्शन पर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता हैमॉडल intracardiac और intrasplenic मॉडल सहित यकृत मेटास्टेसिस, अध्ययन करने के लिए। विशेष रूप से, पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल intracardiac मॉडल है, जो अक्सर अन्य ऊतकों में सहवर्ती मेटास्टेसिस द्वारा सीमित है की तुलना में रोग प्रगति की एक बड़ी रेंज के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, पोर्टल शिरा मॉडल, तिल्ली को हटाने के द्वारा जटिल नहीं है के रूप में intrasplenic मॉडल में किया जाता है।

पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल सामान्य में जिगर मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण साबित हो सकता है। लिवर मेटास्टेसिस समग्र adenocarcinomas में मेटास्टेसिस का सबसे लगातार साइट है, अग्नाशय के कैंसर में विशेष रूप से उच्च दर (मेटास्टेसिस के 85% जिगर के लिए कर रहे हैं), मलाशय और adenocarcinomas (> 70%), साथ ही पेट और esophageal के साथ (> 30 %) 1। हालांकि सहज और ओर्थोटोपिक अग्नाशय और पेट के adenocarcinomas के प्राथमिक ट्यूमर मॉडल और अधिक आसानी से जिगर 78,79 करने के लिए metastasize, पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल prov सकता हैई ट्यूमर कोशिकाओं के नियंत्रित वितरण के रूप में इन कैंसर के मेटास्टेटिक प्रक्रिया को समझने के लिए उपयोगी ट्यूमर सेल आने के बाद निर्दिष्ट समय पर, जैव रासायनिक आणविक और histological आकलन परमिट। सारांश में, पोर्टल शिरा इंजेक्शन मॉडल स्तन कैंसर के उपलब्ध जिगर मेटास्टेसिस मॉडल पर एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, और भी सामान्य रूप में जिगर मेटास्टेसिस क्षेत्र के लिए लागू किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle BD Syringe 309597 For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp
Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 06-669-62 For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile Kendall 8044 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears Rugby 370114 Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml Mfg. by Reckitt Benckiser NDC-12496-0757-1 Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) Mfg. by Humira Inc NDC-04091163-01 Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site 
anti-CD45 antibody BD Pharmingen 550539 Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze Medtrade Products Ltd. FG08839011 Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chemical Depilatory Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers
Chlorhexidine, 2% Solution Vet One 1CHL008 Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
anti-CK18 antibody Abcam ab53118 Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci
Cotton Tipped Applicators, Sterile Fisher Scientific 23-400-114 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose HyClone SH30243.01 Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03 Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile Kendall 2146 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
anti-Green Fluorescent Protein antibody Vector Laboratories BA0702 Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081 Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose
Heating Pad, x 2 - 3 Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers
Hemocytometer Hausser Scientific 1483 For use in cell culture to count cells
Hemostatic Forceps Stainless steel; multiple suppliers
anti-Heppar-1 antibody Dako M7158 Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci
Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge BD   324702 For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp
Isoflurane Piramal NDC-66794-017-25 Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer VetEquip 911103 Use caution, vaporizes anesthetic gases
Light Source Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers
Neutral buffered formalin, 10% Anatech Ltd. 135 Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology
Opal™ 4-color fIHC kit PerkinElmer, Inc. NEL794001KT Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver
Operating Scissors Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers
Penicillin/Streptomycin, 100x Corning 30-002-Cl Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose
Phosphate-buffered Saline Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702 Hamilton 7654-01 For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15 Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge Hamilton 7803-04 For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sodium Hypochlorite Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers
Sterile Saline Fisher Scientific BP358-212 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile Multiple suppliers
Sutures, Sterile  Ethicon J310H 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine VetEquip 901801 Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile  Dynarex 4410 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery
Trypan Blue Life Technologies T10282 For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS
Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) Gibco 25300-054 Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates

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Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (118), e54903, doi:10.3791/54903 (2016).

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