Abstract
Brystkreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet hos kvinner over hele verden. Levermetastaser er involvert i overkant av 30% av tilfellene med brystkreft metastaser, og resulterer i dårlige resultater med median overlevelse på bare 4,8 til 15 måneder. Nåværende gnagermodeller av brystkreft metastase, inkludert primær tumorcelle xenograft og spontane tumormodeller, sjelden metastasere til leveren. Intrakardial og intrasplenic injeksjon modeller resulterer i levermetastaser, men disse modellene kan bli til skamme ved samtidig sekundær-site metastasering, eller ved svekket immunforsvar på grunn av fjerning av milten for å unngå tumorvekst på injeksjonsstedet. For å møte behovet for forbedret levermetastaser modeller, en muse-portal vene injeksjon metode som gir kreftceller først og direkte til leveren ble utviklet. Denne modellen gir tumorceller til leveren uten komplikasjoner av samtidige metastaser i andre organer eller fjerning av milten. optimized portvenen protokollen benytter små injeksjonsvolumer 5-10 ul, ≥ 32 måle nåler, og hemostatisk gasbind på injeksjonsstedet for å kontrollere for blodtap. Portalen vene injeksjon tilnærming i Balb / c hunnmus ved hjelp av tre syngene brystsvulst linjer av varierende metastatisk potensiale ble testet; høy metastatisk 4T1 celler, moderat-metastatiske D2A1 celler, og lav-metastatiske D2.OR celler. Konsentrasjoner av ≤ 10.000 celler / injeksjon resulterer i en ventetid på ~ 20 - 40 dager for utvikling av levermetastaser med høyere metastatisk 4T1 og D2A1 linjer, og> 55 dager for mindre aggressive D2.OR linjen. Denne modellen er et viktig verktøy for å studere brystkreft metastaser til leveren, og kan være aktuelt for andre kreftformer som ofte metastaserer til leveren og endetarms og bukspyttkjertelen adenokarsinomer.
Introduction
Breast Cancer metastaser til leveren
Leveren er et felles område av brystkreft metastase, sammen med ben og lunge 1-3. Levermetastaser hos brystkreftpasienter er en uavhengig prognostisk faktor for svært dårlige resultater 4,5, som median overlevelse for brystkreftpasienter med levermetastaser varierer fra 4,8 til 15 måneder 6-9. I motsetning til brystkreftpasienter med lunge- eller skjelettmetastaser har median overlevelse av 9 til 27,4 måneder 8,9 og 16,3 til 56 måneder 8,10-12, henholdsvis. Metastase er en flertrinns prosess, betegnet som metastatisk kaskade, som begynner med tumorcellespredning i den primære tumor og slutter med pasienten dødelighet på grunn av den såing og utvekst av sirkulerende tumorceller innenfor et fjernt organ 13-15. Gnagermodeller av metastatiske har avslørt at metastatisk kaskade er bemerkelsesverdig lite effektiv, med bare 0,02 til 10%av sirkulerende tumorceller etablere utilslørt metastase 16,17. En stor flaskehals av metastatisk ineffektivitet er diktert av de unike vev microenvironments på sekundære områder, kalt metastatisk nisjer 18, fremhever viktigheten av å forstå stedsspesifikke metastasering. Den metastatisk nisje er unik for området av tilbakefall, og er, delvis, karakterisert ved avsetning av forskjellige ekstracellulære matriksproteiner 19,20, infiltrasjon av forskjellige immuncellepopulasjoner 21-23, og homeostase forandret vev inklusive feilregulert produksjon av mange cytokiner, kjemokiner, og vekstfaktorer 15,18,24,25. Dermed en forståelse av vev bestemt metastatisk nisje foran en forståelse av hvordan å målrette metastatisk sykdom. Imidlertid mangler robuste modeller av levermetastaser. Videre vil forbedrede modeller av levermetastaser være avgjørende for å identifisere nye mål og effektive behandlinger for brystkreftpasienter with levermetastaser.
Etablert Modeller for å studere brystkreft metastaser til leveren
For tiden tilgjengelige modeller for å studere brystkreft metastaser til leveren omfatter menneskelige kreftcelletransplantater i svekket immunforsvar mus. Disse modellene bruker vanligvis godt studert menneskelige brystkreftcellelinjer som MCF-7 og MDA-MB-231 og Nude, Rag1 - / - eller SCID med svekket immunforsvar murine vertene 26-29. Xenograft modeller gir fordelen av å involvere menneskelige avledet kreft cellelinjer, men gitt den siste takknemlighet for immunceller i metastase 30-32 og i terapeutiske motstand 33-35, studiet av metastaser i en fullt immun kompetent vert er avgjørende. Modeller for å studere brystkreft metastaser til leveren ved immun kompetent vert omfatte ortotopisk injeksjon av syngeniske tumorceller (for eksempel, 4T1 og D2A1 cellelinjer) i melkefettpute, med eller uten kirurgiskreseksjon av den primære tumor, og påfølgende vurdering av metastase 36-38. Av notatet, er frekvensen av levermetastaser fra ortotopiske transplanterte modeller svært lav eller ikke-eksisterende forhold til andre metastaser som lunge 39,40, eller oppstår etter lungemetastase er etablert, kompliserer studiet av leverspesifikke metastaser 37,39 .
Tumor explants fra spontane genmanipulerte brystkreft modellene kan bli re-injisert i melkefettputer av naive verter som syngene tumorceller. For eksempel ble det nylig rapportert at spontane svulster fra K14 Cre ECAD f / f P53 f / f mus som modell invasiv lobular brystkreft, utvikle svulster når orthotopically injiseres i villtype verter. Etter kirurgisk reseksjon av disse tumorer når de når 15 mm 2, 18% av musene utviklet seg til levermetastaser 40,41. En tredje tilnærming for å modellere levermetastaser benytterspontane metastaser i genmodifiserte mus. Til dags dato, rapporter om spontane murine modeller av brystkreft metastaser som lett sprer seg til leveren er uvanlig. Unntakene er H19-IGF2, p53-fp / fp MMTV-Cre Cre-WAP, og den K14 Cre ECAD f / f P53 f / f genetisk modifiserte musemodeller, hvor levermetastaser utvikler seg i en lav prosentandel av mus 38,41- 43. Således, mens genmanipulerte musemodeller rette studiet av alle stadier av metastatisk cascade, og gir kraftige og klinisk relevante modeller, de er begrenset på grunn av lave priser av levermetastaser 38.
Flere metastasemodeller omgå de første trinnene i metastatisk kaskade inkludert spredning av kreftceller fra den primære svulsten og intravasation. Disse modellene tillate etterforskning i de senere trinnene av metastatisk cascade, fra ekstravasasjon til etablering av svulster på sekundære områder. den intracardiac injeksjon modellen leverer tumorceller inn i venstre hjertekammer, som distribuerer tumorceller inn i sirkulasjonssystemet via aorta. Intrakardial injeksjon krever ultralydveiledet avbildning av injeksjonsstedet eller andre bildediagnostikk som bioluminescence av luciferase merkede celler for å bekrefte vellykket injeksjon. Tumorcelle-injeksjon via den venstre ventrikkel kan resultere i ben, hjerne, lunge og / eller levermetastaser, blant andre organer 44-48. På grunn av flere organmetastaser, disse musene ofte må avlives før utviklingen av åpen levermetastaser, benektende muligheten til å fullt ut undersøke metastatisk vekst i leveren. En alternativ tilnærming som i betydelig grad reduserer utviklingen av multi-site metastaser er den intrasplenic injeksjon modell. Intrasplenic injeksjon leverer kreftceller via miltvenen som binder med den overlegne mesenteric venen til å bli portvenen 49,50. Dyr kan overvåkes for outgrowth av metastatiske lesjoner i lever, fordi dannelsen av metastaser på andre områder er sjeldne, og som et resultat blir dyrets generelle helseopprettholdt 49,50. Det er imidlertid viktig å merke seg at intrasplenic modellen krever splenektomi for å unngå milt-tumorer 49,50, en prosedyre som påvirker immunforsvaret. For eksempel er myokardial ischemi reperfusjonsskade, karakterisert ved infiltrasjon av Ly6C + monocytt undergrupper som stammer fra milten og er ansvarlig for fagocyttisk og proteolytisk aktivitet i sårhelingsprosessen følgende iskemi 51,52. Med splenektomi, er det en observert reduksjon i monocytt populasjoner som hjelper til sårheling 52. Videre har splenektomi vist seg å redusere primær tumorvekst og lungemetastaser i en kreftmodell ikke-småcellet lunge, nærmere bestemt ved en reduksjon i antall sirkulerende og intra-tumor CCR2 + CD11b + Ly6C + monocyttisk myeloid celler 53. I tillegg splenectomy følgende intrasplenic injeksjon av tykktarm kreft celler resultert i reduserte nivåer av anti-tumor naturlige drepeceller i mesenteriets lymfeknuter og forhøyede levermetastaser 54. I sum er disse funnene tyder på at splenektomi kompromitterer immunsystemets rolle med påfølgende konsekvenser for metastatisk celle skjebne.
Portal Vein Injeksjon Modell av levermetastaser
For å undersøke brystkreft metastaser til leveren i en fullt immun kompetent vert, under forhold hvor musene ikke blir kompromittert på grunn av multi-organmetastaser, ble en portal vene injeksjon modell utviklet. Intraportal injeksjon modeller har blitt brukt tidligere for å studere levermetastaser fra kolorektal 55,56 og føflekkreft 16 cellelinjer; Her beskriver vi bruk av intraportal injeksjon for å modellere syngene brysttumorcelle metastase. Denne modellen kan brukes til å studerede senere stadier av metastatisk cascade inkludert brystkreft celle bloduttredelse og seeding, tumor celle skjebne beslutninger om død / spredning / dvalen, og utvekst i åpenlys lesjoner. I denne modellen er syngeniske brysttumorcellelinjene injisert via portalvenen av immun vedkommende Balb / c-hunnmus, en metode som leverer tumorcellene for det første og direkte til leveren uten fjerning av milten. For å utvikle denne modellen, bruk av fire melketumorcellelinjer som varierer i sin metastatiske evne fra lav til høy var ansatt: D2.OR, D2A1, og 4T1, og har ansatt D2A1 merket med grønt fluorescerende protein (D2A1-GFP) for å undersøke tidlig tidspunkt-poeng etter tumorcelle injeksjon. 4T1 er en svært metastatisk cellelinje avledet fra 410,4 svulst som spontant oppstod i en MMTV + Balb / c hunnmus 36,37 og metastasizes til lunge, lever, hjerne og bein fra melkefettpute primære svulster 39,57,58. D2A1 tumorceller were også opprinnelig stammer fra en spontan brysttumor skriver seg fra en Balb / c verten etter transplantasjon av D2 hyperplastiske alveolære nodule celler, og er bekreftet å være metastatisk fra den primære svulsten til lungene 59,60. D2.OR kreftceller er en ikke-metastatisk søster linje til D2A1 linjen, og selv om de slipper unna den primære svulsten og ankommer sekundære områder, de sjelden etablere fjernmetastaser 60,61.
I tillegg er det viktig å unngå bruk av vanlig anvendte smertelindring medisiner, inkludert ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) under eller etter den kirurgiske prosedyren. NSAIDs har anti-tumor aktivitet i visse brystkreft 62-65, og noen klasser av NSAIDs øker risikoen for levertoksisitet 66,67, potensielt kompromittere studiet av levermetastaser og leveren metastatisk nisje. Videre studier tyder på at NSAIDs direkte påvirker vevet mikromiljøet, redusere pro-metastatisk extracellular matrix proteiner tenascin-C 68 og fibrillar kollagen 62,65. Alternativt kan bruken av et opioid-derivat, buprenorfin, ble brukt på grunn av sin effekt i gnager smertebehandling 69 og på grunn av mangel på bevis for at opioider har anti-tumor-aktivitet 70. Denne portvene-injeksjon modell ble optimalisert for mindre injeksjonsvolum av 5 - 10 pl for å unngå unødvendig skade på leveren. Modellen ble også optimalisert for å inkludere nåler med mindre diameter (≥ 32 gauge) og bruk av hemostatisk gasbind umiddelbart etter injeksjon for å redusere blodtap under prosedyren. I motsetning til disse optimale injeksjonsparametre, bør celletall bestemmes på individuelt grunnlag, basert på karsinogent potensial av cellelinjen. Men, som starter på ≤ 10 000 celler / injeksjon for langtidsstudier anbefales. For kortere endepunkter (f.eks 24 timer etter injeksjon) betydelig mer kreftceller (f.eks,1 x oktober 5 til 1 x 10 6) kan brukes hvis berettiget. Oppsummert portveneinjeksjon modell beskrevet her representerer et nyttig verktøy for studier av brystkreft metastaser til leveren og omgår mange av begrensningene ved andre levermetastasemodeller. Denne modellen muliggjør studie av tumorcelle ekstravasasjon, såing, tidlige skjebne avgjørelser for overlevelse, spredning, og dvalen, og metastatisk utvekst i immun kompetente murine verter.
Protocol
Alle dyr prosedyrer i denne artikkelen ble gjennomgått og godkjent av Oregon Health & Science University Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Klargjøring av kirurgiske området og instrumenter
- Forbered saks, pinsett, og pinsetten ved autoklavering ved 124 ° C i 30 min, 1 - 2 dager før den planlagte operasjoner. Sikre tilgang til Autoclaved eller sterilt sengetøy, bur og mat for post-kirurgisk utvinning.
- Forbered en aseptisk kirurgiske området, fortrinnsvis i en laminær hette.
- Tørk av alle overflater av det kirurgiske område med 10% blekemiddel, inkludert varmeputen, lyskilde, anestesi produksjonsrør og nesekjeglen, og en hvilken som helst annen del av den kirurgiske pakke som kommer i umiddelbar nærhet til den kirurgiske prosedyren mens det blir utført .
- I aseptisk kirurgiske området, plasserer rengjøres varmeputen med steril drapere, lyskilde, anestesi rør og nosecone, insulinsprøyter1 ml sprøyter, bupivakain, kunstige tårer, sterilt saltvann, 2 x 2 "sterilt gasbind svamper, 4 x 4" sterilt gasbind, hemostatic gasbind skåret i 0,5 til 1 cm 2 stk, saks, tang, pinsetten, 4-0 Vicryl sting med koniske nål, og 50 ml 2% klorheksidinglukonat i en autoklavert beholder.
- Sørg for at det er plass i dette rommet for tilberedte kreftceller som er lagret på is.
- På benken ved siden av kirurgiske området, forberede utvinning området med en andre varmeputen og rene bur med sterilt sengetøy.
MERK: Dette området kan også huset elementer som en perle sterilisator.
2. Portal Vein Injection
- En time før den planlagte injeksjoner, behandle Balb / c hunnmus alderen 8 - 15 uker med 100 mL av 0,015 mg / ml buprenorfin, subkutant, for smertebehandling.
MERK: Dette injeksjon protokollen kan brukes på alle stamme av kvinnelige eller mannlige mus i alle aldre, med passendecellelinjer for endringer i belastning. - Forbered tumorceller for injeksjon basert på protokoller for cellelinje eller svulst eksplantering av valget. Test alle tumorcellelinjer før administrasjon med hensyn til nærvær av murine patogener for å redusere risikoen for å innføre slike patogener i dyret kolonien.
- For syngene Balb / c-tumorcellelinjer inkludert D2A1, D2.OR, og 4T1 tumorceller, tine-celler i en 10 cm vevsdyrkningsplate 3 dager før injeksjonen slik at de følgende dagen cellene er på -90 - 100% konfluens.
- En dag etter tumorcelle-tine Vask cellene en gang med 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS) og trypsineres på konfluent tumorceller ved bruk av 2 ml av 0,05% trypsin ved 37 ° C i 5 minutter. Tilsett 8 ml komplett medium (DMEM høy glukose, 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, og 1x penicillin / streptomycin) og passasje 01:10 inn i en ny 10 cm skål med 10 ml komplett medium.
- På dagen for injeksjoner, vaskes cellene en gang med 1 x PBS og trypsinize som beskrevet ovenfor.
- Susp tryptinisert celler i 8 ml komplett media, spinn i 5 min ved 1500 xg, fjern media og resuspender i 5 ml 1x PBS.
- Telle celler på et hemocytometer hjelp trypan blå utelukkelse for levedyktighet vurdering. Resuspender celler for injeksjon i 1x PBS ved en forhåndsbestemt konsentrasjon og volum.
MERK: 5-10 mL anbefales som mindre injeksjonsvolumer hindre unødvendig skade på leveren. - Holde cellene på is i løpet av injeksjonene. Etter gjennomføring av injeksjoner, tilbake en prøve av celler til laboratoriet og plasser i kultur i fullstendig media for en dag for å sikre levedyktighet.
- Plasser musen under bedøvelse med 2 - 2,5% isofluran (2-klor-2- (difluormetoksy) -1,1,1-trifluor-etan) levert i oksygen. Opprettholde kroppstemperaturen ved hjelp av varmeputen. Sikre fullstendig anesthetization ved å vurdere for en reaksjon på en tå klype, og deretter opprettholde anesthesia på 2 - 2,5% isofluran.
MERK: Det er viktig å overvåke dyrene puste hastigheten og justere isofluran strømningshastigheten tilsvarende gjennom hele prosedyren. - Plasser en liten mengde kunstige tårer eller veterinær salve over hvert øye for å unngå overdreven tørking av øynene under den kirurgiske prosedyren.
- Plasser musen i liggende stilling, på ryggen med magen utsatt.
- Fjerne hår på den ventrale venstre side av gnager fra den andre ribben plass ned til den 4. inguinale melkekjertel nippel ved å tørke det område med kjemisk riktige. La riktige å sitte i 1 - 2 minutter og deretter fjerne helt med gasbind og H 2 O. Dette trinnet kan gjøres 1 - 2 dager på forhånd for å spare tid hvis mange operasjoner er planlagt.
- Ta en 2 x 2 "sterilt gasbind svamp (dynket i 2% klorheksidin) og tørk nede muse på stedet av hårfjerning. Steril hele området, inkludert halen, for å minimalisere bakteriell fortsaminering av instrumenter.
- Tørk stedet for hårfjerning og området rundt ned med en alkohol prep pad.
- Gjenta 2% klorheksidin og alkohol trinn når flere og avslutt med en endelig Klorhexidin tørke ned for totalt tre 2% klorheksidin og to alkohol prep pad vasker. Har den siste Klorhexidin tørke slik at den kjemiske ikke drypper rundt operasjonsstedet for å unngå å få Klorhexidin på indre organer. MERK: Bruk av store mengder klorheksidin og alkohol på huden og omkringliggende pels kan føre til en betydelig nedgang i kroppstemperatur. Ikke tørk med overflødig volum under trinn 2,7-2,9. Opprettholde kroppstemperaturen med en varmepute.
- Ved hjelp av sterile hansker og en sterilisert skalpell med sterilt kniven, må et enkelt en-tommers snitt i huden mellom median og sagittalplan på venstre side av musen, som starter like under ribben og slutter like over planet for den fjerde lyske melkekjertler smokken.
- Bruke autoklaveres eller perle steriliserte saks og pinsett, lage en lignende 1-tommers innsnitt i peritoneum. Unngå å kutte i melkefettpute og sørge for ikke å kutte tarmer, lever, eller pessar.
- Plasser en 4 x 4 "kompress fuktet med sterilt saltvann på venstre side av musen, hvor snittet er gjort, slik at indre organer kan anbringes på gasbind og ikke kommer i kontakt med den omgivende hud eller kirurgiske område.
- Forbered kreftceller ved å pipettere opp og ned flere ganger som kreftceller vil bosette under utarbeidelsen av musen. Forbered en 25 mL avtagbar sprøytespissen og 32-gauge nål med tumorceller. Skyve på sprøyten til tumorcellene på spissen av nålen og stempelet er ved den passende volum for injeksjon; unngå injeksjon av luftbobler.
- Tørk utsiden av nålen med en steril alkohol pad for å fjerne eventuelle eksterne tumorceller. Vær forsiktig for å unngå nålestikk.
- Hold median side av snittet, inkludert hud og peritoneal fôr, til side med pinsett og bruke en steril bomullspinne til å trekke forsiktig de store og små innvollene ut, plassere dem på steril kompress dynket i sterilt saltvann. Trekk ut store og små innvollene til portvenen er visualisert.
- Dekk de indre organene i saltvann gjennomvåt gasbind for å opprettholde interne fuktighet og sterilitet.
- Ha en assistent, også på seg sterile hansker, holde tarmen innpakket i saltvann gjennomvåt gasbind forsiktig ut av veien med en steril bomullspinne til fullt avsløre portvenen. I tillegg kan det være nødvendig å bruke den autoklaveres pinsetten eller tang for å holde vevet til side på median side av snittet.
- Sett nålen lastet med tumor celler ~ 3-5 mm inn i portvenen ~ 10 mm under leveren i en vinkel <5 ° til venen, med skråkant vendt opp. Sakte injisere hele volumet som inneholder kreftceller. Tillate blod å strømme forbi nålen hEAD i flere sekunder for å unngå tilbakestrømning av tumorceller ut av venen. Minimer flytte nålen i venen under injeksjonen. Igjen, vær forsiktig for å unngå nålestikk.
MERK: Visualisering av portvenen er gjort uten forstørrelse, men et stereomikroskop kan benyttes hvis ønskelig. - Fjern nålen samtidig plassere en steril bomullstupp applikator på venen med trykk. Med assistent fortsatt holder tarmen til side plassere ett stykke 0,5 til 1 cm 2 hemostatisk gasbind på injeksjonsstedet på venen.
MERK: Hemostatic pulver ble også forsøkt for dette trinnet i protokollen, men var ikke effektiv i å stoppe venøst blodtapet etter injeksjon. - Hold hemostatiske gasbind på injeksjonsstedet med press fra en steril bomullstupp applikator for 5 min.
- Vurdere lukking av venen ved forsiktig å løfte den hemostatiske gasbind, hvis gasbind pinner til det omgivende vev, en liten mengde av sterile saltløsning kan anvendes for å suge og løfte gasbind.
- Hvis blodtap skjer på denne tiden, plassere en ekstra stykke hemostatisk gasbind på stedet med press for ytterligere 5 min. Når blodstrømmen har helt sluttet, fjerne gasbind fra musen.
MERK: Blood tap under den kirurgiske prosedyren må vurderes nøye, og hvis den totale tillatt blodtap volumet er nådd eller overskredet (basert på regulatoriske standard operasjonsprosedyrer for søkerens institusjonelle gjennomgang boards) muse må avlives mens under anestesi ved hjerte perfusjon. - Når injeksjonsstedet anses intakt, uten blod forlate injeksjonsstedet, plasserer de indre organer forsiktig tilbake inn i bukhulen.
- Sy peritoneal foring og deretter huden med sterilt 4-0 Vicryl sutur og taper nål ved hjelp av en enkel kontinuerlig eller avbrutt sutur mønster. Vanligvis lukker snittet krever 10-15 sting.
- Injisere 100 ul BUPIvacaine (5 mg / ml) langs snittstedet for lokal smertebehandling ved anvendelse av en insulinsprøyte. Injiser 0,5 ml sterilt saltvann subkutant ved anvendelse av en 1 ml sprøyte med en 26-gauge nål for hydrering. Operasjoner ta 15 - 25 min å fullføre.
- For å opprettholde sterile forhold gjennom hele operasjonen, sørge for at alle verktøy og materialer som kommer i kontakt med musen, inkludert hansker, rengjøres på riktig måte før kontakt. Der det er mulig bruke sterile materialer og hansker, eller minimalt utbytte av en 70% etanol løsning eller 10% blekemiddel løsning å rengjøre.
- Hvis flere operasjoner er planlagt for en enkelt økt remake første kirurgiske området med frisk steril drapere, insulin sprøyter, 1 ml sprøyter, sterilt saltvann, 2 x 2 "sterilt gasbind svamper, 4 x 4" steril kompress, hemostatic gasbind skåret i 0,5 - 1 cm 2 stk, 4-0 Vicryl suturer med taper nål og 2% klorheksidin. Bead-sterilisere saks, pinsett, og pinsetten i mellom operasjoner og tillatetilstrekkelig kjøle før gjenbruk.
3. Recovery, Overvåking Rodent Helse, og sluttpunkt Analyser
- Etter den kirurgiske prosedyren er fullført, opprettholde mus på en varmepute for utvinning i sengetøy frie, rene bur i minst 20 min. Mus tar vanligvis 2 - 4 min til å våkne opp fra anestesi.
- Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi for å co-bolig med andre dyr før det er fullt restituert fra anestesi. Ikke la et dyr uten tilsyn mens det er kommet til bevissthet og overvåke inntil dyret har gjenvunnet evnen til å opprettholde seg selv i sternal recumbency.
- Gi mus 0,05 til 0,1 mg / kg buprenorfin for smertebehandling hver 6-12 timer etter operasjonen, for opp til 72 timer.
- Sjekk sting daglig for å sikre at de forblir intakt under healing. I tilfellet at sting komme ugjort, plasserer du muse under narkose, fjerne gjenværende sting, og erstatte. I tilfelle av infeksjon eller Inflammasjon oppsøke veterinær ansatte.
MERK: Infeksjon eller betennelse har ikke blitt møtt med denne protokollen. - For metastase studier, utføre daglige helsesjekker til ytre tegn på metastatisk sykdom er observert, inkludert, men ikke begrenset til:> 10% vekt tap / gevinst, scruffiness, tap av hensyn til omgivelsene, mage ødem / ascites, lyse øyne og ører, eller en krum stilling.
MERK: Daglige helsesjekk er særlig viktig ved utvikling av modellen for bruk sammen med en ny cellelinje eller cellekonsentrasjon inntil tidslinjen for metastasering er godt forstått. - Ved studiens slutt-punkt, avlive mus ved CO 2 innånding fulgt ved halshugging.
MERK: Alternative metoder for aktiv dødshjelp godkjent av forskernes tilsyn Komiteen kan brukes, inkludert perfusjon med 1x PBS mens under anestesi. Perfusjon av leveren er utført av kanylerør portvenen, snipping vena cava inferior, og presser 1x PBS thgrov leveren vaskulaturen ved en hastighet på 4 ml / min i 1 - 2 minutter for å fjerne sirkulerende blod og leukocytter.
MERK: Avhengig av endepunkt for undersøkelsen, cellelinje, og den anvendte konsentrasjon, åpenbar levermetastaser kan eller kan ikke være åpenbare ved obduksjon. Mikrometa lesjoner kan bli avslørt med histologisk analyse av leveren. Endepunkter vil variere basert på studien design. - Pakk leveren med saks og pinsett ved først å fjerne galleblæren, og deretter skjære gjennom nedre vena cava superior til leveren. Skjær gjennom vena cava, portvenen, og leverpulsåren dårligere til leveren.
- Fjerne hele leveren forsiktig og vaske 5 x i 1 x PBS.
- Separer leveren til venstre, høyre, median, og caudatus fliker.
- Formalin løsning leveren i 10% nøytral bufret formalin i 48 timer under rysting ved romtemperatur. Fremgangsmåte vev gjennom en serie av alkoholer i økende konsentrasjon og xylen; parafin legge den faste vev 71 MERK: Alternativt leveren kan bli hurtigfrosset ved å sette vevet i et cryomold med optimal skjære temperatur (OCT) og formel frysing på tørrispellets nedsenket i 95% etanol.
- Ved hjelp av en mikrotom, kutt i parafin innebygde vevsblokk slik at en kamp-head størrelse av vev er avslørt.
- Skjær fem 4-mikron seriesnitt, utgjør dette første nivå for analyse.
- Skjær gjennom 250 mikrometer vev, kaste disse delene i avfallet.
- På 250 mikron kutte et annet nivå på fem 4-mikron seriesnitt.
- Gjenta om nødvendig for å snitt gjennom hele leveren. Hematoxylin og eosin flekken den første delen av hvert nivå for å vurdere for metastase 72.
MERK: For snap-frosset vev bruke en cryostat å kutte deler.
MERK: Påvisning av mikrometa sykdom vil kreve tumorcelle spesifikk farging.
- Fjern mus fra studien hvis det er tumorveksten ved innsnitt sittee, da det betyr tumorcelle lekkasje inn i bukhulen etter injeksjon.
MERK: Dette problemet har ikke blitt observert.
Representative Results
Den portvene-injeksjon modell, hvor tumorcellene blir levert direkte til leveren gjennom et kirurgisk inngrep, gjør det mulig for tumorcelle-injeksjon inn i portvenen. Under antiseptiske forhold, i en bedøvet mus, blir et ~ en-tommers kirurgisk innsnitt gjøres på venstre side av musen mellom median og sagittalplan, starter like over planet for den fjerde inguinale melkekjertel spenen og slutter rett nedenfor ribbene . De store og små tarmer er forsiktig trekkes gjennom innsnitt for å tilveiebringe visualisering av portvenen (figur 1A). Nøyaktig anatomisk identifisering av portvenen og vellykket intra-portal injeksjon kan bekreftes ved å praktisere injeksjons protokollen med tusj eller lignende fargestoff. Riktig injeksjon via portvenen vil resultere i at blekket blir umiddelbart og spesifikt levert til leveren, og vil ikke resultere i India blekk spredning til lungene (Figure 1B). Videre, ved hjelp av D2A1 mouse mammary tumor-celler som er merket med GFP, spredning av tumorceller gjennom leveren er synlig ved nitti minutter etter injeksjon, noe som bekrefter portvene-injeksjon levering til leveren (figur 1C). Ved høyere forstørrelse blir det tydelig at ved 90 min etter injeksjon, blir tumorceller innenfor sinusformer, så vel som i leveren parenchyma i umiddelbar nærhet til portal triader, hvor portvenen blod inn i lever (figur 1C). Disse dataene tyder på at aktiv tumorcelleekstravasering skjer på 90 min etter tumorcelle-injeksjon. Samlet utgjør disse data bekrefter at portveneinjeksjon modellen leverer injeksjonsvolum direkte til leveren, med blekk eller tumorceller dispergert i leveren og ingen nevneverdig transport av injeksjonsvolumet til lungen.
For å vurdere robustheten til portvenen injeksjon modell, tre separspiste syngeniske mus brysttumorcellelinjer ble testet i voksne Balb / c-mus. Disse brysttumorlinjer ble valgt basert på deres preget oppførsel i melkefett pad modeller og inkluderer den svært aggressive og metastatisk 4T1 cellelinje, jo mindre aggressive metastatisk D2A1 linje, og den lave / ikke-metastatisk D2.OR linje 37,61,73 , 74. 2.000 og 10.000 celler per injeksjon ble testet uten nevneverdige forskjeller i tid til utvikling av utilslørt metastaser med disse lave cellekonsentrasjoner. For disse studiene surrogatmarkører for metastasering ble anvendt slik som mangel på stell, blekhet, og vekttapet til å rettferdiggjøre obduksjon, hvorpå nærvær eller fravær av levermetastaser ble bekreftet ved visuell vurdering av leveren og andre organer for å bekrefte intra-portal levering . Disse data bekrefter tidligere rapporter at 4T1 og D2A1 cellelinjer representerer mer aggressive brysttumorlinjer, som kortere metastase gratis overlevelse er observert i forhold til mus injisertmed mindre aggressive D2.OR linjen (figur 2A). Mus injisert med 4T1 eller D2A1 tumorceller utviklet overt levermetastaser av ~ 30 - 40 dager etter injeksjon, og noen utviklet metastaser så tidlig som 18 dager etter injeksjon (figur 2A), mens bare en mus injisert med D2.OR celler hadde utviklet overt levermetastaser ved studium slutten, som var 60 - 65 dager etter tumorcelle injeksjon. Metastaser ble senere bekreftet ved seksjonering gjennom leveren i 250 um nivåer og analysere hematoxylin og eosin (H & E) farget seksjoner (figur 2B-D).
I tillegg til deteksjon av åpenbare metastatiske lesjoner i muselever, kan portalvenen modellen også benyttes for å studere tidligere hendelser i den metastatisk kaskade, inkludert deteksjon av enkelt-celler / cellegrupper følgende ekstravasasjon, og dannelse av mikrometastatiske lesjoner. Multiplex immunfluorescens-farging ble bruktå detektere 4T1, D2A1, og D2.OR brysttumorceller i leveren når de er tilstede som enkeltceller eller mikrometastatiske lesjoner, som H & E er ikke tilstrekkelig for å bekrefte tilstedeværelsen av små lesjoner. Figur 3A viser et representativt Balb / c mus lever med en antatt mikrometastaser fra D2A1 kreftceller som er positive for epitel keratin CK18, negativ for pan-immune markør CD45, og negativ for hepatocytter markør Heppar-en. Hepatocytter også beis positivt for CK18, nødvendig bruk av Heppar-en i denne fargingen panel. En viktig merknad er at gallegang epitel og lever stamceller beis positivt for CK18, krever nøye diskriminering mellom tumorceller og galleganger, spesielt når man vurderer periportal regioner (figur 3A). Et alternativ til å multiplekse immunfluorescens å identifisere enkelt spres celler og mikrometastaser er å utnytte syngene brysttumorlinjer merket med forbedret grønt fluorescerendeprotein (EGFP) og / eller luciferase og utføre IHC for merkelappen (figur 1C). På grunn av immunogenisitet EGFP, luciferase, og andre proteiner, er det viktig å bruke musemodeller som er tolerisert til disse proteinene, for eksempel romanen immun kompetent "glødende head" mus som uttrykker EGFP og luciferase i fremre hypofysen 75. For identifisering av macrometastatic lesjoner av umerkede syngene linjer som D2A1 svulst linjen, er CK18 / Heppar-1 / CD45 multiplex immunfluorescens ideell (figur 3B).
Figur 1: Portal Vein Injection Leverer tumorceller direkte til leveren. A) Portal vene injeksjon; snittet er gjort mellom median og venstre sagittalplan, fra over planet av den fjerde inguinale melkekjertel spenen og slutter rett nedenfor rib bur. B) Balb / c lever med PBS injeksjon (til venstre). Etter tusj injeksjon via portvenen, leveren (midten), men ikke lungene (til høyre) tar opp blekk. C) Representative tynne delen bilder av D2A1 mus brystsvulstceller merket med GFP i en Balb / c mus lever i 90 min etter injeksjon av 1 x 10 6 tumorceller via portvenen. Livers ble formalinfiksert, parafininnebygd, seksjonert og farget med anti-GFP antistoff for tumorcelle deteksjon. Topp panelet viser mørke brune fargede tumorceller (piler) spredt over hele leveren, betegner stjerne uspesifikk hepatocytter flekker rundt sentrale årer; skala bar = 300 mikrometer. Lavere panelene viser representative bilder av kreftceller på 90 min etter injeksjon fortsatt nært knyttet til blodkar; skala bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: utvekst av Mouse Brysttumorcellelinjer i leveren Etter Portal Vein Injection. A) Kaplan-Meier kurve som viser metastasefrie overlevelsesraten hos mus injisert med 2,000-10,000 4T1, D2A1, eller D2.OR musebrysttumorceller. Mus ble injisert med tumorceller og overvåkes for tegn på metastase inkludert mangel på stell, lyse øyne, og vektendring. Metastase ble bekreftet ved nekropsi og ved H & E på histologiske snitt av leveren. N = 2 4T1 2000-celler; 2 4T1 10000 celler. N = 2 D2A1 2000 celler; 3 D2A1 10.000 celler. N = 3 D2.OR 2000 celler; 3 D2.OR 10.000 celler. Representant H & E bilder av B) 4T1 lesjoner på 21 dager etter injeksjon på 10.000 celler, C) D2A1 lesjoner på 26 dager etter injeksjon på 10.000 kreftceller, og d) D2.OR lesjoner på59 dager etter injeksjon på 10.000 celler; skala barer = 75 mikrometer. Lignende lesjoner observeres når 2000 4T1 eller D2A1 tumorceller ble injisert. Ingen skader ble påvist med 2000 D2.OR celler. Ingen tegn på metastaser i andre organer eller på det kirurgiske innsnitt området var tydelig i alle mus på disse studiene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Påvisning av enkeltceller og metastaselesjoner i muselever bruker Multiplex immunfluorescens. A) Representant multipleks immunfluorescens av D2A1 tumorceller i et Balb / c mus lever på 90 min etter injeksjon ved hjelp av portvenen injeksjon modell. Farging ble gjort ved hjelp av en multiplex kit. Fra venstre til høyre viser DAPI; CD45 å markere leukocytter; Heppar-en til mark hepatocytter; og CK18 å markere kreftceller, hepatocytter og gallegang epitel. Sammenslåtte bildet viser en antatt klynge av CK18 + Heppar-en - CD45 - D2A1 tumorceller tett forbundet med en portal triaden. Pil = D2A1 kreftceller, stjerne = gallegang epitel; skala bar = 25 mikrometer. B) En representant overt D2A1 metastatisk lesjon bruker samme flekker panel som i A. Kreftceller er CK18 + mens tilstøtende hepatocytter er CK18 + Heppar-1 +; skala bar = 25 mikrometer. Bilder ble tatt opp med et mikroskop med 20 x 0,8, 40 x 1,3, og 60 x 1,4 mål og CCD-kamera, ved hjelp av mikroskop-programvaren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Balb / c mus portal vene injeksjon modell tillater studier av melke kreft lesjoner i leveren i fravær av konfunderende multi-organ metastase og i en fullt immun kompetent vert. Vår protokoll er en videreutvikling av tidligere publiserte kirurgiske prosedyrer som tillater tilgang til portalen blodåre for injeksjon av tumorceller direkte inn i leveren 16,55,56. Én utvikling vi har gjort er å vesentlig redusere antall injiserte tumorceller fra ≥ 1 x 10 5 celler / injeksjon 16,55,56 ned til ≤ 10000 tumorceller / injeksjon. Vi har også utvidet modell for studiet av brystkreft metastaser i leveren. Ved hjelp av denne protokollen, to brystkreftcellelinjer med kjent metastatisk potensial utvikle levermetastaser med kortere ventetid enn en mer stillestående brysttumorcellelinje. Videre, på tidlige tidspunkter, blir tumorceller fordelt gjennom leveren parenchyma enkle eller små grupper av enkelt cells etter tumorcelle injeksjon. Modellen er klar til å ta opp spørsmål om metastatisk effektivitet inkludert tumorcelle bloduttredelse, celleoverlevelse, dvalen, og spredning - alle fenotyper som bidrar til utvikling av mikrometastatisk og utilslørt metastatisk sykdom i leveren.
Det er viktig å vurdere mange aspekter av portvenen injeksjon protokollen før oppstart av studier. Nøye avgjøre om cellelinjer, cellekonsentrasjonen, total celle nummer, og slutt interessante basert på mindre utforskende studier er sterkt anbefalt. Videre, er bruken av immun kompetent vert og syngene cellelinjer av største betydning for å forstå vert-tumorcelleinteraksjoner. Den nyutviklede "glødende head" mus som uttrykker EGFP og luciferase fra fremre hypofysen er et viktig verktøy for å fjerne verts svar på eksogene EGFP og luciferase, proteiner ofte brukt til å merke melketumorlinjer 75
Det er viktig å merke seg at portvenen injeksjonen modellen ikke replikere den fulle metastatisk kaskade, men er begrenset til studiet av tumorcelle ekstravasasjon, tumorcelle-nisje interaksjoner følgende ekstravasasjon og tumorvekst. Modeller som nøyaktig gjenskape hele metastatisk kaskade til leveren, slik som forekommer hos pasienter, er sterkt behov. En ekstra begrensning av portvenen injeksjon modellen er at den er blitt til skamme av effekten av kirurgi på verten, med sårtilheling kjent for å påvirke sykdomsprogresjon 76,77.
Portveneinjeksjon modellen representerer en forbedring i forhold til andre injeksjonsmodeller for å studere levermetastaser, inkludert intrakardiell og intrasplenic modeller. Spesifikt, gjør det mulig for portvenen injeksjons modell for studiet av et større utvalg av sykdomsprogresjon enn intrakardiale modellen, som er ofte begrenset av ledsagende metastaser i andre vev. Videre er portvenen modellen ikke kompliseres ved fjerning av milten, slik det gjøres i den intrasplenic modell.
Portveneinjeksjon Modellen kan vise seg å være et nyttig verktøy for studier av levermetastaser generelt. Levermetastaser er den hyppigste stedet for metastaser i adenokarsinomer samlet, med spesielt høye priser i bukspyttkjertel kreft (85% av metastaser er til leveren), tykktarm og endetarm adenokarsinomer (> 70%), samt mage og esophageal (> 30 %) 1. Selv om spontane og ortotopiske primærtumormodeller av bukspyttkjertelen og tykktarm adenokarsinomer lettere metastaserer til leveren 78,79, kan portvenen injeksjon modell prove nyttig å forstå metastatisk prosessen med disse kreftformene som kontrollert levering av tumorceller tillater biokjemiske, molekylære og histologiske vurderinger på bestemte tidspunkter etter tumorcelle ankomst. I sammendraget, representerer portvenen injeksjon modellen en viktig forbedring på tilgjengelige levermetastaser modeller av brystkreft, og kan også være aktuelt for levermetastaser feltet generelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
| Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously |
| Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site |
| anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
| Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
| Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
| Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
| anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
| Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
| DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
| Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
| Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
| Heating Pad, x 2 - 3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
| Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
| Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
| Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
| Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
| Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
| Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
| Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
| Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
| Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
| Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
| Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
| Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
| Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
| Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
| Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
| Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
| Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
| Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
| Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |
References
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
- Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
- Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
- Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
- Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
- Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
- Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
- Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
- Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
- Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer--a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
- Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature reviews. Cancer. 4, 448-456 (2004).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
- Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
- Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
- Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489 (2014).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15, 73-86 (2015).
- Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
- Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
- Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
- Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
- Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
- Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
- Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
- Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
- Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. , e4260 (2012).
- Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
- Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
- Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677 (2014).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469 (2015).
- Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
- Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
- Coligan, J. E., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
- Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
- Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
- Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
- Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
- Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960 (2015).
- Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35 (2016).
- Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
- Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
- O'Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
- Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
- Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
- Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
- Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
- Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
- Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18, 1286-1294 (2012).
- Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32, 39-61 (2013).
