Summary
हम पुरस्कृत उत्प्रेरण और फल मक्खियों (ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर) इनाम राज्यों में परिवर्तन के लिए एक उपाय के रूप में स्वैच्छिक इथेनॉल की खपत का उपयोग करने में अनुभवों nonrewarding के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।
Abstract
हम इनाम राज्यों में परिवर्तन के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में फल मक्खियों में इथेनॉल आत्म प्रशासन (ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर) को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हम, मक्खी इनाम प्रणाली में नल प्राकृतिक इनाम से संबंधित अनुभवों को संशोधित करने, और इनाम राज्यों में परिवर्तन के लिए एक उपाय के रूप में स्वैच्छिक इथेनॉल की खपत का उपयोग करने के लिए एक आसान तरीका प्रदर्शित करता है। दृष्टिकोण न्यूरॉन्स और जीन है कि आंतरिक स्थिति का अनुभव की मध्यस्थता परिवर्तन में एक भूमिका निभा अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक उपकरण के रूप में कार्य करता है। प्रोटोकॉल दो असतत भागों से बना है: पुरस्कृत और nonrewarding अनुभवों को मक्खियों को प्रकाश में लाने, और प्रेरणा का एक उपाय एक दवा इनाम प्राप्त करने के लिए के रूप में स्वैच्छिक इथेनॉल खपत परख करने की क्रिया। दो भागों, आगे बहाव assays के लिए एक प्रारंभिक कदम के रूप में या एक स्वतंत्र दो विकल्प खिला परख के रूप में अनुभव के मॉडुलन प्रेरित करने के लिए क्रमश: स्वतंत्र रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल एक जटिल सेटअप की आवश्यकता नहीं है और इसलिए किसी भी laborator में लागू किया जा सकता हैबुनियादी मक्खी संस्कृति उपकरणों के साथ वाई।
Introduction
अनुभव के जवाब में व्यवहार के संशोधन जानवरों को उनके पर्यावरण 1 में परिवर्तन करने के लिए उनके व्यवहार को समायोजित करने की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया के दौरान, जानवरों के बाहरी वातावरण की बदलती परिस्थितियों के साथ अपने आंतरिक शारीरिक स्थिति को एकीकृत करने और बाद में अस्तित्व और प्रजनन के अपने अवसरों को बढ़ाने के लिए एक दूसरे पर कार्रवाई चुनें। इनाम प्रणाली है कि इस तरह के खाने या पीने, या उन है कि लंबी अवधि के अस्तित्व को सुनिश्चित है, इस तरह के यौन व्यवहार या वंश 2 के लिए देखभाल के रूप में के रूप में व्यवहार कि तत्काल अस्तित्व को बढ़ाने, मजबूत करके व्यक्तियों और प्रजातियों के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं व्यवहार को प्रेरित करने के लिए विकसित किया गया। इस तरह के दुरुपयोग की दवाओं के रूप में कृत्रिम यौगिकों भी सह चुनने तंत्रिका रास्ते है कि प्राकृतिक पुरस्कार 2 मध्यस्थता द्वारा इनाम सिस्टम प्रभावित करते हैं।
पिछले दो दशकों के दौरान, फल molec के अध्ययन के लिए उड़ान भरने के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एक होनहार मॉडल के रूप में स्थापित कर दिया गया हैular और neuronal तंत्र है कि व्यवहार 3,4 पर इथेनॉल के प्रभाव को आकार देने रहे हैं।
इससे पहले, हम दवा पुरस्कार 5 प्राप्त करने की प्रेरणा के लिए एक (एनपीएफ / एनपीएफ रिसेप्टर (आर) न्यूरॉन्स) मक्खियों में पेप्टिडर्जिक न्यूरॉन्स के सबसेट इस तरह के यौन अनुभव के रूप में है कि कुछ प्राकृतिक पुरस्कार, की पहचान की है। एनपीएफ अभिव्यक्ति दोनों यौन अनुभव करने के लिए और इस तरह इथेनॉल नशे के रूप में दवा पुरस्कार, के प्रति संवेदनशील है। एनपीएफ अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन इथेनॉल आत्म प्रशासन 5, जहां उच्च एनपीएफ कम कर देता है और कम एनपीएफ इथेनॉल का उपभोग करने के लिए वरीयता बढ़ जाती है में परिवर्तन करने के लिए परिवर्तित कर रहे हैं। के रूप में वे एक गंध सक्रियण, जो भी कम इथेनॉल की खपत से परिलक्षित होता है के साथ रखा के लिए मजबूत वरीयता प्रदर्शित एनपीएफ न्यूरॉन्स को सक्रिय करने, मक्खियों के लिए फायदेमंद है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, एनपीएफ न्यूरॉन्स की सक्रियता के मक्खियों की क्षमता इथेनॉल नशा और एक गंध क्यू के बीच एक सकारात्मक सहयोग के लिए फार्म के साथ हस्तक्षेप। एनपीएफ / आर के बीच कारण लिंकप्रणाली, इनाम स्मृति, और इथेनॉल की खपत पता चलता है कि एक इनाम राज्यों 5 में परिवर्तन के लिए एक उपाय के रूप में इथेनॉल आत्म प्रशासन उपयोग कर सकते हैं।
इस प्रकाशन में हम मक्खी प्राकृतिक इनाम प्रणाली और इनाम राज्यों में परख करने की क्रिया परिवर्तनों में दोहन के लिए एक एकीकृत दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है। दृष्टिकोण दो अलग अलग हिस्सों, प्राकृतिक इनाम से संबंधित अनुभवों से छेड़छाड़ के लिए एक प्रशिक्षण प्रोटोकॉल, एक दो विकल्प केशिका फीडर परख (कैफे) के बाद इनाम राज्यों में परिवर्तन के लिए एक अनुमान के रूप में इथेनॉल आत्म प्रशासन का आकलन करने के होते हैं। कैफे परख दो बोतल चुनाव दवा आत्म-प्रशासन के लिए कृंतक अध्ययन में इस्तेमाल किया assays के अनुरूप है और मक्खियों 6 में लत की तरह व्यवहार के कुछ गुण प्रतिबिंबित करने के लिए दिखाया गया है।
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Protocol
नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन के जनरल अवलोकन: प्रयोगात्मक डिजाइन प्रेमालाप दमन 7-9, जिसमें पुरुष मक्खियों 4 डी के कोर्स पर लगातार 3 प्रशिक्षण सत्र में पुरस्कृत और nonrewarding अनुभवों को उजागर कर रहे हैं के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल भी शामिल है। 4 डी - अनुभव चरण के अंत में, मक्खियों के लिए 3 एक दो चुनाव स्वैच्छिक इथेनॉल खपत परख में परीक्षण कर रहे हैं। प्रोटोकॉल के साथ साथ, कई तैयारी के चरण, जिनमें से कुछ अग्रिम में किया जा सकता है और अधिक से अधिक एक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा करने के लिए शामिल है, जबकि दूसरों को प्रयोग (1 टेबल) की शुरुआत से पहले एक समय पर ढंग से जगह ले जाना चाहिए।
1. तैयारी के चरण
- केशिका फीडर सिस्टम तैयार कर रहा है
- एक 27 जी सुई गर्मी और इसका इस्तेमाल एक शीशी (चित्रा 1) के साथ छोटे छेद पंचर करने के लिए।
- में आधे (आड़े) शीशी प्लग एक रेजर ब्लेड का उपयोग कट। मार्क प्लग की सतह पर चार अंक, एक squar बनानेई आकार में केशिका धारकों की स्थिति है। प्लग (चित्रा 1 बी) के माध्यम से 4 छेद बनाने के लिए एक 18 जी सुई का प्रयोग करें।
- एक रेजर ब्लेड का प्रयोग micropipets कटौती करने के लिए इतना है कि वे मजबूती से 5 μL कांच केशिकाओं, जो एडाप्टर के रूप में सेवा कर पकड़ सकते हैं।
- तैयार प्लग में 4 केशिका एडेप्टर डालें।
- प्लग पर 2 ethanol- और दो nonethanol युक्त केशिकाओं की स्थिति निशान।
नोट: यह सब शीशियों भर में लगातार केशिकाओं के 2 प्रकार के पदों को रखने के लिए सिफारिश की है। छेद के आकार पर ध्यान देना, बड़े छेद शीशियों से बाहर मक्खियों के भागने की अनुमति के रूप में। इसके अलावा, यह पक्ष यह है कि नीचे का सामना करना पड़ता है, जब शीशी में डाला के रूप में प्लग काटने के कुछ छोटे, ढीले फाइबर कि मक्खियों में उलझ सकता है बनाता है के रूप में (आमतौर पर कटौती की ओर विपरीत) प्लग की चिकनी पक्ष का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । - तैयार शीशियों और एडेप्टर की एक बड़ी संख्या केशिका फीडर सिस्टम के लिए प्रयोग की जाने वाली (कैफे)2.3 कदम में वर्णित प्रयोगों।
- छोटा गिलास भोजन शीशियों तैयारी
- मक्खियों (1.4 कदम) इकट्ठा करने से एक दिन पहले, microcentrifuge ट्यूब रैक पर 200 कांच की शीशियों की व्यवस्था। पिघल (cornmeal गुड़ नुस्खा के अनुसार, सामग्री की तालिका देखें) भोजन के लिए उड़ान भरने एक माइक्रोवेव का उपयोग कर। कांच की शीशियों में मक्खी भोजन के 2 एमएल डालो (शीशी दीवारों पर खाद्य धब्बा की कोशिश नहीं)। खाद्य कठोर करते हैं, और प्लास्टिक की चादर के साथ शीशियों को कवर किया।
नोट: कांच युक्त भोजन शीशियों कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। - मक्खी संग्रह के दिन, रेफ्रिजरेटर से बाहर शीशियों लेते हैं और उन्हें उन का उपयोग मक्खियों के घर से पहले आरटी तक पहुँचने।
नोट: खाद्य शीशियों कई सप्ताह पुराने हैं, तो यकीन है कि भोजन अभी भी बरकरार है और शीशी से अलग नहीं है, के रूप में मक्खियों भोजन और कांच के बीच दरारें में फंस जा सकता है।
- मक्खियों (1.4 कदम) इकट्ठा करने से एक दिन पहले, microcentrifuge ट्यूब रैक पर 200 कांच की शीशियों की व्यवस्था। पिघल (cornmeal गुड़ नुस्खा के अनुसार, सामग्री की तालिका देखें) भोजन के लिए उड़ान भरने एक माइक्रोवेव का उपयोग कर। कांच की शीशियों में मक्खी भोजन के 2 एमएल डालो (शीशी दीवारों पर खाद्य धब्बा की कोशिश नहीं)। खाद्य कठोर करते हैं, और प्लास्टिक की चादर के साथ शीशियों को कवर किया।
- बनाना केशिका फीडर परख के लिए शेयर खाद्य समाधान
- पूर्व कीशेयर खाद्य समाधान (5% sucrose और 5% खमीर निकालने) छाँटना, खमीर निकालने के 5.88 जी और आसुत जल के 100 एमएल में सुक्रोज की 5.88 ग्राम भंग।
ध्यान दें: शेयर समाधान अत्यधिक संदूषण की संभावना है। इसलिए, यह (एक सुखाने चक्र के बिना 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट, और) यह आटोक्लेव की सिफारिश की है और विभाज्य यह 850 काम कर aliquots μL में 4 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर रखा जा सकता है। शेयर समाधान में सामग्री की एकाग्रता 5.88% और 15% इथेनॉल या पानी (premade खाद्य समाधान के 850 μL में 150 μL) सिर्फ 2.3 कदम में इसके उपयोग से पहले के अलावा के बाद 5% की अंतिम एकाग्रता तक पहुंच जाएगा।
- पूर्व कीशेयर खाद्य समाधान (5% sucrose और 5% खमीर निकालने) छाँटना, खमीर निकालने के 5.88 जी और आसुत जल के 100 एमएल में सुक्रोज की 5.88 ग्राम भंग।
- प्रयोगात्मक मक्खियों का संग्रह
- 200 भोले पुरुष एक सीओ 2 पैड का उपयोग मक्खियों लीजिए।
नोट: प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए प्रासंगिक किसी भी प्रयोगशाला तनाव का प्रयोग करें। 250 मक्खियों को आसानी से अपने eclosion लेने चरण में मक्खियों के पांच बोतलों से एकत्र किया जा सकता है। जब मक्खियों इकट्ठा कर्नल करने के लिए सावधान ध्यान देनाlect मक्खियों कि हाल ही में eclosed है (कुंवारी दिखने मक्खियों: अपने पेट पर एक जातविष्ठा स्थान के साथ उज्ज्वल मक्खियों)। प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा से पहले 4 घ वर्ष - प्रायोगिक मक्खियों छोटा गिलास से 3 भोजन और वृद्ध युक्त शीशियों में अकेले रखा जाना चाहिए। - मुलायम प्लग का उपयोग शीशियों बंद हुआ।
नोट: एक ही नरम प्लग प्रशिक्षण चरण के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है जब मुंह आकांक्षा का उपयोग कर अनुभव चरण के दौरान में और शीशियों के बाहर महिलाओं डालने के लिए होगा।
- 200 भोले पुरुष एक सीओ 2 पैड का उपयोग मक्खियों लीजिए।
- ट्रेनर मक्खियों का संग्रह
नोट: सभी एकत्र मक्खियों 25 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) पर एक 12 एच / 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे इनक्यूबेटर में रखा जाना चाहिए। 12 एच / 12 h / प्रकाश अंधेरे चक्र एक सुविधाजनक प्रारंभिक समय पर बदला जा सकता है।- कुंवारी महिला ट्रेनर मक्खियों
- लीजिए 500 कुंवारी महिला ट्रेनर एक गुम्मट शेयर या कुंवारी ग्रहणशील महिलाओं के रूप में उपयोग के लिए एक virginator स्टॉक से मक्खियों। नियमित रूप से आकार भोजन शीशी प्रति 25 के समूह में मादा मक्खियों रखें, और सभीउन्हें प्रयोग में उपयोग करने से पहले 4 घ वर्ष - 3 को उम्र के लिए उन्हें ओउ।
- Mated महिला ट्रेनर मक्खियों
- प्रशिक्षण चरण (कदम 1.6.1) से पहले संभोग से गुजरना करने के लिए एक गुम्मट शेयर या एक virginator शेयर से 300 कुंवारी महिला मक्खियों लीजिए।
नोट: मादा मक्खियों नियमित रूप से आकार भोजन शीशी प्रति 10 महिलाओं के समूह में रखा है और 3 के लिए आयु वर्ग के हैं - प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा से पहले 4 घ वर्ष।
- प्रशिक्षण चरण (कदम 1.6.1) से पहले संभोग से गुजरना करने के लिए एक गुम्मट शेयर या एक virginator शेयर से 300 कुंवारी महिला मक्खियों लीजिए।
- नर मक्खियों mated महिला ट्रेनर मक्खियों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया
- 150 पुरुष मक्खियों (जरूरी नहीं कि कुंवारी) ले लीजिए।
नोट: मक्खियों से 3 नियमित रूप से आकार भोजन शीशी और वृद्ध प्रति 15 पुरुषों के समूह में रखा जाता है - कुंवारी महिला के साथ जोड़ा जा रहा से पहले 4 घ वर्ष mated ट्रेनर महिलाओं को बनाने के लिए मक्खियों।
- 150 पुरुष मक्खियों (जरूरी नहीं कि कुंवारी) ले लीजिए।
- कुंवारी महिला ट्रेनर मक्खियों
- सृजन mated महिला ट्रेनर मक्खियों
- mated महिला उत्पन्न करने के लिए प्रशिक्षकों के रूप में प्रयोग की जाने वाली मक्खियों, 10 कुंवारी महिला की जोड़ी समूहों मक्खियों 15 पुरुष के साथ एक महिला-conta में एक पुरुष युक्त शीशी flipping द्वारा मक्खियोंining शीशी 16 - प्रशिक्षण चरण से पहले 18 घंटे (2.1 कदम) 10।
नोट: यह सामान्य रूप से प्रशिक्षण सत्र से पहले शाम को जगह ले जाना चाहिए। 1.5: पुरुष के बीच 1 के अनुपात मादा मक्खियों के लिए मक्खियों भरोसा दिलाते हैं कि सभी महिलाओं mated किया जाएगा। - प्रयोग के दिन, शीशी एक मुँह खींचने की मशीन का उपयोग कर के बाहर पुरुषों aspirating द्वारा पुरुषों से mated महिलाओं अलग। प्रत्येक प्रशिक्षण दिन की शुरुआत से पहले इस अधिकार का प्रदर्शन करना।
- mated महिला उत्पन्न करने के लिए प्रशिक्षकों के रूप में प्रयोग की जाने वाली मक्खियों, 10 कुंवारी महिला की जोड़ी समूहों मक्खियों 15 पुरुष के साथ एक महिला-conta में एक पुरुष युक्त शीशी flipping द्वारा मक्खियोंining शीशी 16 - प्रशिक्षण चरण से पहले 18 घंटे (2.1 कदम) 10।
2. प्रायोगिक कदम
- अनुभव चरण की स्थापना
- प्रयोग के रूप में संभव के रूप में बंद इनक्यूबेटर में प्रकाश चरण की शुरुआत करने के लिए शुरू करो। व्यवहार कक्ष में ट्रेनर महिलाओं (दोनों कुंवारी और mated) रखें।
नोट: यह एक व्यवहार कक्ष में प्रयोग है, या किसी एकांत वातावरण है कि शांत और 25 डिग्री सेल्सियस और 60 के लिए सेट है प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है - 65% आरएच। 50% से अधिक आर्द्रता रखते हुए बहुत महत्वपूर्ण है, प्रेमालाप और संभोग के बाद से व्यवहारएस फेरोमोन संवेदन, जो नमी के प्रति संवेदनशील हो जाता है पर निर्भर करते हैं।
- प्रयोग के रूप में संभव के रूप में बंद इनक्यूबेटर में प्रकाश चरण की शुरुआत करने के लिए शुरू करो। व्यवहार कक्ष में ट्रेनर महिलाओं (दोनों कुंवारी और mated) रखें।
- पुरस्कृत और nonrewarding अनुभवों के लिए पुरुष मक्खियों उजागर
- कांच microcentrifuge रैक पर एकल पुरुष मक्खियों युक्त शीशियों की व्यवस्था, स्थिति रैक के मार्जिन के साथ शीशियों।
ध्यान दें: यह व्यवस्था प्रयोगकर्ता आसानी से रैक से बाहर शीशियों लेने के बिना मक्खियों कि शयन से गुजरना के जोड़े का पालन करने की अनुमति देता है। - तैयार (कदम 2.2.1 में वर्णित के रूप में) 100 कांच एकल पुरुष युक्त शीशियों के 2 समूहों पुरस्कृत और nonrewarding संभोग के अनुभवों के दौर से गुजर पुरुषों के लिए अलग रैक (यानी खारिज कर दिया और mated) पर मक्खियों।
- महाप्राण ट्रेनर महिलाओं और पुरुष मक्खियों युक्त प्रत्येक शीशी के लिए उन्हें जोड़ने। 1 घंटे के लिए टाइमर सेट। अस्वीकार कर समूह के साथ शुरू, प्रत्येक शीशी एक mated महिला जोड़ें। फिर, पुरुषों mated किया जा करने के लिए आगे बढ़ना है और प्रत्येक शीशी के लिए एक कुंवारी महिला जोड़ें।
- बारीकी से संभोग मुठभेड़ों देखोसुनिश्चित करें कि पुरुषों कुंवारी महिलाओं के साथ बातचीत के पहले घंटे के भीतर और कहा कि पुरुषों के पहले mated महिलाओं के साथ बातचीत के दौरान संभोग नहीं करते सफलतापूर्वक दोस्त बनाने के लिए। 1 घंटे के पाठ्यक्रम पर खारिज कर दिया पलटन की निगरानी, 15 मिनट के लिए एक दूसरे टाइमर सेट और पुरुषों हर 15 मिनट देखने के लिए।
- अस्वीकार कर दिया पलटन कि संभोग करने में कामयाब रहे और mated पलटन कि पहले प्रशिक्षण सत्र के अंत तक संभोग के अंत नहीं था से पुरुषों से पुरुषों के निर्वहन।
- एक नियमित रूप से मक्खी भोजन शीशी में पहले से mated महिला प्रशिक्षकों बाहर श्वास से पहले प्रशिक्षण सत्र खत्म, और उन्हें अगले सत्र के लिए कंडीशनिंग रहते हैं। धीरे mated पुरुष समूह से महिलाओं श्वास द्वारा इस कदम का पालन करें।
- मक्खियों 1 घंटे के लिए आराम करते हैं।
- दो बार 2.2.7 - दोहराएँ 2.2.3 कदम।
- कदम 2.2.3 में प्रशिक्षण सत्र दोहराएँ - 2.2.8 के लिए 3 और डी प्रत्येक दिन है।
- कांच microcentrifuge रैक पर एकल पुरुष मक्खियों युक्त शीशियों की व्यवस्था, स्थिति रैक के मार्जिन के साथ शीशियों।
- रिकॉर्डिंग की खपत (कैफे)
- पिछले conditionin के अंत मेंजी सत्र (चौथा दिन), केशिका फीडर शीशियों में एकल पुरुषों और उन्हें समूह aspirate। मक्खियों डालने जबकि केशिका फीडर शीशी को कवर करने के लिए एक नरम प्लग का उपयोग, और इसे जल्दी बदलने के लिए तैयार कर दिया केशिका फीडर प्लग के साथ के बाद सब मक्खियों डाला गया है। समूह 6 - एक शीशी में प्रयोगात्मक समूहों में से प्रत्येक से 8 मक्खियों, हालत प्रति कोई कम से कम 8 शीशियों बनाने।
- धीरे प्लग के शीर्ष करने के लिए पानी की 5 एमएल जोड़कर प्लग गीले। सावधान रहो, पानी जोड़ने शीशियों में बहाव से बचने के लिए करते हैं। प्रत्येक शीशी पानी की बराबर राशि जोड़ें।
नोट: यह कदम केशिकाओं से वाष्पीकरण कम करने के लिए किया जाता है। इसलिए, यह प्रयोग के आराम के लिए हर दिन दोहराया है। सापेक्ष आर्द्रता पर निर्भर करता है, बाद के दिनों प्लग करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए कम पानी की आवश्यकता हो सकती है। - 15% की एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए शेयर खाद्य aliquots के लिए इथेनॉल या पानी जोड़कर दो अलग-अलग खाद्य समाधान तैयार करें।
- capill भरने के लिएदो भोजन के समाधान के साथ मेष, 5 μL तरल भोजन एक प्रयोगशाला फिल्म पट्टी पर बूँदें बना सकते हैं और समाधान केशिका भरने के लिए जब तक यह 5 μL निशान तक पहुँच अनुमति देते हैं। केशिका, जो 5 μL काला निशान लाइन के करीब है की स्पष्ट अंत का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।
नोट: - 8 केशिका एडाप्टर के एक साथ हैं और उन्हें एक डालने के रूप में उपयोग केशिकाओं धारण करने के लिए एक बार में कई केशिकाओं भरने के लिए, यह 6 कनेक्ट करने के लिए संभव है। - काला निशान पर बिल्कुल खाद्य समाधान की स्थिति के लिए आयल पट्टी पर धीरे केशिकाओं टैप करें। खनिज तेल की छोटी बूंदों में प्रत्येक केशिका के अंत सूई से केशिकाओं सील। यह कदम खाद्य समाधान की क्षमता का वाष्पीकरण कम करता है।
- प्लग में जब तक केशिकाओं के उजागर पक्षों मुश्किल से शीशी (1 मिमी या प्लग सतह से कम) के इंटीरियर से झांकना दो इथेनॉल युक्त केशिकाओं और 4 एडेप्टर / धारकों के माध्यम से दो nonethanol युक्त केशिकाओं डालें।
ध्यान दें:गीला प्लग के करीब केशिकाओं के उद्घाटन रखते हुए वाष्पीकरण कम होता है और भोजन के लिए आसान पहुँच की अनुमति देता है, के रूप में मक्खियों सामान्य रूप से प्लग पर बैठते हैं और उजागर केशिका को खिलाने के लिए पर नीचे चढ़ाई। - शीशियों कि प्रयोगात्मक मक्खियों को रोकने के लिए इसके अलावा, मक्खियों के बिना एक नकली शीशी तैयार करते हैं। यह नियंत्रण प्राकृतिक वाष्पीकरण आकलन करने के लिए कार्य करता है।
नोट: के रूप में मतभेद चर वाष्पीकरण के लिए और खपत के आंकड़ों को गुमराह करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, केशिका उद्घाटन प्लग की तुलना में अपेक्षाकृत बराबर स्थिति बनाए रखने के लिए प्रयास करें। प्रयोग के दौरान पर्याप्त मात्रा में नमी बनाए रखें और गीला गीला प्लग से प्लग करने के लिए निकट के रूप में संभव के रूप में केशिका खुलने की स्थिति, कम नमी और बड़ी दूरी के रूप में अनियंत्रित वाष्पीकरण में दोनों परिणाम कर सकते हैं। - एक शासक का उपयोग कर मिमी में काला निशान लाइन के संबंध में केशिकाओं में से प्रत्येक में तरल के रिश्तेदार की स्थिति रिकॉर्ड है, और इन मूल्यों को नीचे लिखें।
नोट: समाधान काले एल पर बिल्कुल तैनात किया जाता है तोine, शून्य मान के बराबर होना चाहिए, और अगर यह ऊपर या नीचे है, यह सकारात्मक या नकारात्मक मूल्यों, क्रमशः होना चाहिए। तरल के प्रारंभिक स्तर अंतिम हे / एन की खपत मूल्यों के लिए संदर्भ बिंदु निर्धारित किया है। - शीशियों 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस सेट करें। पूरे प्रयोग के दौरान एक निरंतर समय में केशिकाओं बदलें।
- शीशियों से धीरे केशिकाओं निकालें और काला अंकन लाइन के संबंध में तरल के स्तर को मापने।
- ध्यान से नकली शीशी में तरल स्तर की जाँच करें।
नोट: स्तर और अधिक से अधिक 2 मिमी गिरा दिया है, यह इंगित करता है कि वाष्पीकरण अधिक है और खपत के स्तर विश्वसनीय नहीं हैं। - पानी के 2 एमएल के साथ धीरे प्लग गीला हो जाना और के रूप में कदम 2.3.3 में संकेत दिया है, केशिकाओं का एक नया सेट डालने - 2.3.10। शीशियों 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस सेट करें।
- निर्धारण वरीयता
- मैं से अंतिम स्तर घटाकर द्वारा प्रत्येक केशिका की कुल खपत की गणनाप्रारंभिक बिंदु पर nitial स्तर।
- (इथेनॉल युक्त केशिकाओं से अलग यानी nonethanol केशिकाओं) एक ही भोजन के साथ दोनों केशिकाओं के मूल्यों का मिश्रण।
- राशि राशि इथेनॉल युक्त केशिकाओं से भस्म से गैर-इथेनॉल केशिकाओं से भस्म को घटाकर इथेनॉल वरीयता की गणना और एक ही शीशी के सभी केशिकाओं से कुल खपत मूल्यों से मूल्य विभाजित।
- एक ही प्रयोगात्मक समूह के सभी शीशियों की वरीयता अनुक्रमित औसत।
नोट: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), इथेनॉल 1 (ई 1), इथेनॉल 2 (E2), कुल nonethanol (कुल NE) = NE1 + NE2, कुल इथेनॉल (कुल ई) = E1 + E2, कुल योग खपत (कुल योग) = कुल NE + कुल ई, और इथेनॉल वरीयता सूचकांक (पीआई)
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Representative Results
FPreviously, Devineni एट अल। पता चला है कि जब फल मक्खियों इथेनॉल युक्त भोजन का उपभोग करने के लिए विकल्प दिया जाता है, वे भोजन 6 युक्त nonethanol से अधिक इथेनॉल युक्त भोजन के लिए एक मजबूत वरीयता प्रदर्शित करते हैं। यहाँ दिखाया कुछ प्रतिनिधि परिणाम हम प्राप्त जब भोले पुरुष मक्खियों की जन्मजात इथेनॉल प्राथमिकता है कि प्रशिक्षण प्रोटोकॉल गुजरना नहीं किया परख करने की क्रिया कर रहे हैं।
भोले गुआंगज़ौ एस नर मक्खियों eclosion पर एकत्र किए गए थे, 4 दिन पुरानी है जब तक आयु वर्ग के, और 4 डी (चित्रा 2) के पाठ्यक्रम पर इथेनॉल का उपभोग करने के लिए उनकी जन्मजात वरीयता के लिए यत्न किया। मात्रा ethanol- और nonethanol युक्त समाधान शो से भस्म कि प्रदर्शनी nonethanol भोजन पर लेने वाली 15% इथेनॉल के भोजन के लिए एक मजबूत वरीयता मक्खियों (चित्रा 2) का विश्लेषण।
का प्रयोग यौन का विरोधअनुभव है, हम पहले से दिखा दिया है कि पुरुष मक्खियों कि समूहों में दोस्त के लिए अनुमति दी गई थी ( "mated-बांटा") अकेले रखे पुरुषों है कि पहले-mated महिलाओं ( "अस्वीकार कर दिया पृथक") द्वारा खारिज कर दिया गया तुलना में प्रदर्शन कम इथेनॉल वरीयता। हम संभोग से संबंधित अनुभव से आवास अनुभव अलग करना कई नियंत्रण का इस्तेमाल किया और पता चला कि अंतर वरीयता संभोग अनुभव 5 से यह परिणाम है।
यहाँ वर्णित प्रशिक्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम अकेले-mated उत्पन्न होता है और पुरुष मक्खियों कि इसी तरह के आवास और संभोग शासनों कराना पड़ा खारिज कर दिया। एकल पुरुष गुआंगज़ौ एस मक्खियों 4 डी के पाठ्यक्रम असमान संभोग अनुभवों को खत्म करने के अधीन थे। पुरुषों में से एक पलटन बातचीत और कुंवारी महिला मक्खियों (एकल mated पलटन) के साथ संभोग करने के लिए अनुमति दी गई थी, और अन्य पलटन पहले mated मादा मक्खियों (एकल खारिज कर दिया पलटन) के साथ प्रशिक्षित किया गया था। प्रशिक्षण चरण के बाद ही इधर-उधर पुरुषोंमीटर दो साथियों वर्गीकृत किया गया (8 / शीशी) और केशिका फीडर शीशियों में रखा; उनकी स्वैच्छिक इथेनॉल की खपत 4 डी (चित्रा 3) के लिए दर्ज किया गया था। इथेनॉल का उपभोग करने के लिए पसंद की खपत के आंकड़ों से गणना की गई 2.4 कदम (चित्रा 3 बी) में सूत्र का उपयोग। सकारात्मक मूल्यों इथेनॉल युक्त भोजन के लिए वरीयता का संकेत है, और नकारात्मक मूल्यों इथेनॉल युक्त भोजन करने के लिए घृणा का संकेत मिलता है।
वर्तमान प्रयोग हमारे पिछले निष्कर्षों का समर्थन करता है, सुझाव यौन अनुभव है, और नहीं आवास शर्त यह है कि, इथेनॉल की खपत modulates। सफल संभोग के आंतरिक इनाम स्तर है, जो बारी में इथेनॉल की खपत को कम करती है बढ़ जाती है। Rejections, इनाम की कमी के रूप में माना जाता है, इनाम की मांग व्यवहार (चित्रा 3 बी) में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व।
चित्रा 2. सहज पसंद का एक उदाहरण इथेनॉल का उपभोग करने के लिए। भोले गुम्मट पुरुषों 8 पुरुषों / शीशी के समूहों में वर्गीकृत किया गया है, और ethanol- और nonethanol युक्त समाधान के अपने खपत 96 घंटे के पाठ्यक्रम पर दर्ज किए गए। मक्खियों 15% इथेनॉल containin की एक बड़ी राशि का सेवनजी भोजन (** पी <0.01, *** पी <0.001, दो तरह दोहराया उपायों Bonferroni के बाद परीक्षण के साथ एनोवा, एन = 8)। दिखाया गया डेटा मतलब + SEM हैं या मतलब है - SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. का विरोध संभोग अनुभव mModulate इथेनॉल पसंद। (ए) संयुक्त प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध। एकल वर्जिन गुम्मट पुरुषों कुंवारी महिलाओं के साथ संभोग करने के लिए अनुमति दी जाती है या (दर्शाया के रूप में "टी") बाकी के 1 घंटे (के रूप में "आर" दर्शाया) द्वारा स्थान दिया गया है 1 के प्रेमालाप-दमन प्रशिक्षण सत्र 3x के अधीन हैं। प्रशिक्षण 4 घ के लिए दोहराया है। प्रत्येक दिन के अंत में, मक्खियों इनक्यूबेटर (के रूप में "पर" दर्शाया) में रखा जाता है। बाद प्रशिक्षण के 4 डी, पुरुषों शीशियों वे कहाँ से खिलाने के लिए चुन सकते हैं में रखा गयासाथ या 15% इथेनॉल के बिना भोजन समाधान युक्त केशिकाओं। (बी) के एकल पुरुषों के एकल mated पुरुषों (अधिक से अधिक इथेनॉल वरीयता प्रदर्शन किया खारिज कर दिया ** पी <0.01, दो तरह Bonferroni के बाद परीक्षण के साथ दोहराया उपायों एनोवा, एन = 9, तुलना के अंत के बाद भर में 3 डी उपचार समूहों के बीच हैं प्रशिक्षण)। दिखाया गया डेटा मतलब + SEM हैं या मतलब है - SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| संदर्भ अनुभाग | टिप्पणियाँ |
| 1.1 | कई प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है |
| 1.2 | कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में रखा जा सकता |
| 1.3 | आटोक्लेव के बाद 4 डिग्री सेल्सियस रखें |
| 1.4 | इससे पहले 4 डी - करने के लिए 3 वृद्धप्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा है |
| 1.5 | यह कदम प्रत्येक प्रशिक्षण सत्र से पहले जगह शाम लेना चाहिए |
| 2.1 | यह कदम प्रत्येक प्रशिक्षण सत्र की सुबह जगह ले जाना चाहिए |
| 2.2 | 4 डी के कोर्स पर लगातार 3 प्रशिक्षण सत्र में दोहराया जा |
| 2.3 | पानी के साथ प्लग डाल दो, खपत को मापने और 4 डी के पाठ्यक्रम पर केशिकाओं की जगह |
| 2.4 | यह कदम दो विकल्प परख के दौरान केशिकाओं जगह से पहले हर बार किया जाता है |
तालिका 1 प्रोटोकॉल विभिन्न चरणों के लिए आदेश और समय के प्रवाह के चित्रण का अवलोकन।
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Acknowledgments
हम लंबे समय तक चलने वाले विचार विमर्श और तकनीकी सलाह के लिए यू और ए Heberlein Devineni धन्यवाद। हम यह भी Shohat-ओपीर प्रयोगशाला के सदस्यों, ए Benzur, एल Kazaz, और ओ एसएचएलओएम, विधि का प्रदर्शन के साथ मदद के लिए धन्यवाद। विशेष सराहना प्रयोगशाला में मक्खी प्रणालियों की स्थापना के लिए एलीएजेर Costi को जाता है। इस काम में इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (384/14) और मैरी क्यूरी कैरियर एकता अनुदान (CIG 631127) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene 25 x 95 mm Vials | FlyStuff | 32-109 | |
| narrow plastic vials flugs | FlyStuff | 42-102 | |
| Disposable Sterile Needle 18 G and 27 G | can be acquired by any company | 1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2") | |
| 10 x 75 mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes | kimble chase | 73500-1075 | |
| calibrated pipets 5 μL | VWR | 53432-706 | color coded white to contain 5 μL |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Sucrose, Molecular Biology Grade | CALBIOCHEM | 573113 | |
| Yeast extract Powder for microbiology | can be acquired by any company | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | |
| standard pipette Tips (micro-pipetts) | ThermScientific | T114R-Q | volume: 0.1 - 20 μL (ultramicro) |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-A | fits opening 6 - 13 mm |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-D | fits opening 35 - 45 mm |
| virginator fly stock | bloomington drosophila stock center | #24638 | |
| Narrow Vials, Tray Pack (PS) | Genesee Scientific Corporation | # 32-109BR | |
| Drosophila Media Recipes and Methods | Bloomington Drosophila Stock Center | http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm | |
| propionic acid | Sigma-Aldrich | P5561 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Methl 4-Hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H3647 | |
| Agar Agar | can be acquired by any company | ||
| corn meal | can be acquired by any company | ||
| Grandma's molasses | B&G Foods, Inc | not indicated | |
| instant dry yeast | can be acquired by any company |
References
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