Introduction
心肌梗死（MI）是全球死亡和残疾的主要原因。冠状动脉心脏疾病是主要原因; MI缺血连续冠脉事件，如阻塞造成的。当未在第一6小时内进行再灌注，局部缺血诱导的不可逆的心肌坏死。在患者中，心肌梗死的表征依赖于不同的诊断工具，包括临床体征，心电图，生物标志物，超声心动图，MRI影像的血浆水平的评估，以及组织学分析1。急性和慢性心肌梗塞是根据相对于冠状动脉闭塞时的心肌坏死的定时列为损伤的两个不同阶段。急性期，在第7天发生，与心肌细胞的损失，广泛炎症，和成纤维细胞的招募相关联。亚急性期，其特征在于所述心脏组织和瘢痕形成的愈合，发生1和4之间 - 6周。梗死，心室壁变薄，心室扩张的扩张表征慢性期。左心室重构粗放逐步导致严重的心脏衰竭2。
MI永久左前降支（LAD）结扎引起慢性代表心肌梗死的标准啮齿动物模型。冠状动脉结扎模仿冠状动脉闭塞。梗塞的大小取决于该结扎的部位上。是用经典的生物标志物血浆水平，如肌钙蛋白执行在啮齿动物模型心肌缺血损伤的表征我和T 3，超声心动图，MRI和组织学4,5。生物标记水平与心肌死亡的程度相关。超声心动图检查评估从区域室壁运动异常导致左心功能受损。此外，非侵入性的成像技术，如MRI或高分辨率超声心动图，允许在壁运动的减少的评估，以减少灌注和存活心肌，和壁变薄的瘢痕区域的体积。 LV尺寸允许梗死面积的准确的评价。最后，可行和死心肌的量化可以用收获内心的组织切片的特殊污渍的进行尸检，并允许梗死面积（IS）的验证。另一个重要的特征是梗塞膨胀指数（EI）6的评价。在EI与内的第3天透梗死并启动有关。在EI的特征在于在壁厚的逐步减少，增加了在LV空腔尺寸，并在左心室的形状随之变化。
为了评估的新的治疗方法的治疗效果 - 尤其是，根据细胞，基质再生策略，以及在啮齿动物中的MI的基因递送精确的评估是极其重要的。当在乳头肌水平而获得的单个横截面测得，在IS大小可能由于存在于梗塞的发展以下LAD结扎的大变异被偏置;心尖梗塞可能会再遮掩。重要的是，更准确的方法来确定的梗死面积已为7-9小鼠或大鼠10所示。然而，IS不足以准确量化左室重构或重塑的治疗引起的减少（或预防措施）。事实上，IS通常表示为评估对心脏的横截面总左心室体积的百分比。虽然这种方法是有效的急性心肌梗死，重塑过程中发生的左心室壁的变薄仍在评估11,12。梗塞大小和结构变化的完整形态量化应量化的几个参数，如心内膜和心外膜的长度和直径，以及梗塞和健康领域。我们描述一个方法论APPRoach准确评估MI和重构的一种慢性大鼠模型。
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Protocol
所有的动物在符合欧洲公约动物保健收到人文关怀。获得国家兽医局，弗里堡，瑞士联邦兽医办公室，瑞士批准同意后按照瑞士动物保护法进行外科手术。
1.心收获
注：所有手术干预措施，异氟烷麻醉下进行的。作出了努力，以减少动物的痛苦。特别是，所有动物接受0.1毫克/千克丁丙诺啡预麻醉的皮下注射。外科协议诱导心肌梗塞先前已在别处13中所述。
- 麻醉（插管动物，2.5％异氟烷麻醉适当通过爪子捏反射确认）下一个的心肌梗死的动物进行胸骨。
- 通过切割皮肤，然后肌肉打开动物用手术剪。削减左，右肋骨，然后取出胸部。
- 删除以前的手术（LAD结扎）后剩余的粘连。切开主动脉并取出心脏。把在1M氯化钾（在PBS中）的组织，然后用PBS清洗。
2.组织准备
- 把梗死心脏在纵向的丙烯酸大鼠心脏矩阵。保持在-20℃1小时。
- 直接使用具有横向刀片矩阵切心脏。确保每片厚2毫米。切割约5 - 为每个心脏（基于重构级）7滑动;这就是所谓的系统抽样。
- 在此步骤中，执行2,3,5-氯化三苯基四唑（TTC）染色是可选的（保持心脏切片基站至顶点的方向）。
- 在37℃孵育，在PBS中的1％TTC 50分钟。孵育它在4％低聚甲醛（PFA）进行20分钟至1小时。把部分betweeÑ与2-毫米间隔物的两块玻璃板和拍照与15X放大率耦合有相机的体视显微镜。
警告！多聚甲醛是有毒的。
- 在37℃孵育，在PBS中的1％TTC 50分钟。孵育它在4％低聚甲醛（PFA）进行20分钟至1小时。把部分betweeÑ与2-毫米间隔物的两块玻璃板和拍照与15X放大率耦合有相机的体视显微镜。
- 幻灯冻结（ 第一选择）
- 把每个幻灯片在塑料模具（10×10×5毫米）的带安装为cryotomy介质（最佳切割温度，OCT）保持取向（放置部的面向顶点侧倒在模具的底部）。冷冻液态氮冷却10下与2-甲基丁烷蒸气块 - 15分钟。最后，保存在-80℃的组织。
- 石蜡化（ 第二选项）
- 放置在包埋盒的每个滑板（通过将部分向下在盒的底部的面向顶点侧保持的取向），然后在4％PFA 24小时。把它放在纸巾处理器的机器过夜。
- 孵育它在乙醇中的70％2小时。孵育它伊桑醇95％2小时。孵育它在乙醇100％，持续3小时。孵育它在二甲苯4小时。孵育它在石蜡（熔融在60℃下在烘箱中）5小时。最后，通过嵌入在石蜡每个心脏幻灯片制作块。
- 放置在包埋盒的每个滑板（通过将部分向下在盒的底部的面向顶点侧保持的取向），然后在4％PFA 24小时。把它放在纸巾处理器的机器过夜。
3.马森Goldner三色染色
- 使从石蜡块组织切片用手动切片（厚度：5微米），或从OCT块设置为-18℃的低温恒温器（厚度：7微米）。
- 从染色心脏各部分一张幻灯片每只大鼠（3 -每张幻灯片4横向剖面的）用Masson-Goldner三色染色（ 见附件 ）。
注：这一步的石蜡切片开始。- 熔化在60℃下将载玻片在烘箱。根据通风橱，deparaffinize它们二甲苯两次，每次10分钟。水化它们在100％乙醇，95％乙醇，70％乙醇和蒸馏水对每个3分钟。
注：从这一步骤的开始冰冻切片秒。 - 解决这些问题的解决方案，布安一夜之间。然后，冲洗他们在流动的自来水10 - 15分钟。冲洗他们在蒸馏水中。孵育他们在Mayer的苏木3分钟。
- 删除的幻灯片，让他们在蒸馏水中5分钟。然后，孵育它们在酸性品红-丽春5分钟。冲洗他们在1％乙酸1分钟。
- 其次，培养他们磷钼酸橙G 1分钟。冲洗他们在1％乙酸，1分钟，孵育它们在光绿色染料10分钟，并冲洗它们在1％乙酸1分钟。
- 脱水它们在70％的乙醇（30秒），95％的乙醇（30秒），和100％的乙醇（5分钟）。放在组织切片的树脂封固剂一滴，用盖玻片覆盖他们，让他们干。
- 熔化在60℃下将载玻片在烘箱。根据通风橱，deparaffinize它们二甲苯两次，每次10分钟。水化它们在100％乙醇，95％乙醇，70％乙醇和蒸馏水对每个3分钟。
4.梗死大小分析
- 来自再加上相机立体显微镜（放大15倍），每张幻灯片获得一个图像。照片统治者具有相同的设置秒。
- 使用图像分析软件来测量梗塞，隔膜的厚度，左心室（LV）腔区域，该梗塞区域，使用LV组织区域的中间疤痕的厚度。
- 设定标尺图像（ 图1A）的规模。
- 点击测量 ，然后选择设置转换系数 。绘制校准栏上的一条线。右键点击图片，然后点击结束校准 。注意栏值，然后单击确定 。
- 从染色心脏的图像（ 图1B）的LV。使用多段工具。选择LV逐点，然后右键单击 复制/粘贴的任何地方。
- 采用单段测量工具测量瘢痕及室间隔厚度（ 图1C
- 自动检测的LV腔，梗塞，以及使用在RGB模式（ 图1D）的自动区域测量工具的LV面积。
- 点击工具。 仅激活边框和 连续 RGB模式。最后，点击所关注的区域内检测到它。如有必要，使用精密工具。
- 设定标尺图像（ 图1A）的规模。
- 计算梗塞大小作为梗塞面积与左心室面积的比率。
- 计算膨胀指数如下：[LV腔面积/整个LV面积] / [梗塞厚度/隔膜厚度]，与整个LV区域包括了LV腔和LV组织区域。
- 最后，如下计算每个心脏一个“平均”：从幻灯片梗死扩张平均指数] * [梗死幻灯片数/总幻灯片的数量。
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Representative Results
六个星期后LAD结扎，心从Lewis大鼠收获。 2毫米组织切片获得从顶点基地。被执行的TTC染色过程可视化的梗塞面积，这出现在白色，与健康心肌，它出现在红（ 图2）。根据法援署结扎的部位，梗死面积变化。对于大型MI，从顶点观察到基地（ 图2A）透梗死。较小的梗塞呈现白色梗塞组织从顶点到心脏（ 图2B）的中间部分是可见的。对于小的非透梗塞，观察到在从顶点（ 图2C）只有一个或两个部分纤维组织。
从每个心脏切片薄5微米切片，并与马森Goldner三色染色。心脏的整个截面的照片被在立体显微镜下获得（ 图3）。健康组织中出现的红色和结缔组织中的绿色。每种颜色区分可以用一个图像分析软件容易地进行。
进行测量和计算，计算EI（ 表1）的梗塞和隔膜，左心室腔区和低压总面积的厚度。该EI计算各部分。取决于心脏大小，部分的数目从5变化到7.对于每个心脏中，EI是EI的从各部分的平均。在EI变化从0到0.278，显示出更广泛的心肌梗死，有58％的简历。相比之下，梗塞的到低压的百分比的平均变化从0到0.241，用54％（ 表1）的CV。 EI和心肌梗死的比例分别显著相关;非参数Spearman分析获得的相关系数r-VA0.491的略（p值= 0.005）（ 图4A）。为紧密EI值，例如0.11和0.13，梗塞的百分比变化从5.8到24.1％。
心脏功能通过高分辨率超声心动图在对麻醉动物6周LAD后结扎评估和心脏收获之前进行一次。从组织学定量计算的EI与EF显著相关。非参数Spearman分析提供-0.709（p值= 0.005）（ 图4B）的r值。
图1. 步骤一步的插图图像 分析软件 的使用 。自动色彩划界和长度测量包括几个步骤。 A.校准：图像的规模成立。的图片尺子溶解在相同的条件下的心脏部分。标尺的长度被标记以限定比例转换因子。进行像素到毫米的转换。 B. LV的选择：右心室是使用软件的选择工具的图像中切出。 C.左心室壁与隔膜厚度测量：单测量工具用于定量距离。刻度条表示3毫米。 D.自动区域量化：在RGB模式下进行自动色彩划界。选择自动选择模式后进行自动选择。基于颜色的选择可以进行修改;研究者进行的选择的绿色组织的可视化控制和增加的或所选择的区域下降是必要的。刻度条表示3毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图2. 心脏切片染色，TTC。完整心脏的2毫米切片用TTC染色。健康心肌出现在红和纤维化组织为白色。不同梗死面积三心介绍。 答：大透梗死，B：中等梗塞，和C：小梗塞。刻度条表示3毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.心脏切片用Masson-Goldner三色染色。 5微米的部分，从获得6周LAD后结扎心脏各部分切割。站INED切片置于立体显微镜下。用放大15倍，获得完整的部分图片。代表图像，在乳头肌（背面箭头）的电平获得的，示出在绿色的红色和纤维化组织健康心肌。图像示出了与图像分析软件中的自动颜色划界，以及在该梗塞和隔膜厚度进行测定的位点（黑线）。刻度条表示3毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 关联扩展指数（EI）和梗死相关的百分比之间LV（A）或射血分数（EF）（B）。线性回归（黑线）和95％吐露NCE间隔（虚线）来表示。据报道，非参数Spearman r值。 答：梗死和EI的比例显著相关（r = 0.567，P = 0.003）。梗塞扩张指数（EI）计算为[LV腔面积/ LV全区域] / [梗塞厚度/室间隔厚度。整个LV面积测量为合并的低压腔和LV组织区域。梗塞的百分比计算为LV组织区域/梗塞的组织区域。 B：将功能使用一个高分辨率超声心动图与EI显著相关6周LAD后结扎评估。这两个参数显著相关（r = -0.709，P = 0.005）。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1： 测量马尾松Goldner染色的心脏切片参数。
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Discussion
该议定书中的关键步骤
纤维组织可在使用心脏收获和图像的系统抽样一种慢性心肌梗死大鼠模型准确地评估分析从基地获得到顶点三色染色组织切片。两个步骤是成功的协议实现尤为重要。首先，对于心脏收获使用氯化钾使心肌以松弛状态被维持。本步骤是从不同的心梗塞尺寸的比较重要的。第二，在布安溶液中的部分的过夜固定是至关重要的，以获得明亮的三色染色。
修改和故障排除
染色的缺失可能在布安溶液，例如降低的培养时间段的固定期间是由于困难或过期布安溶液。该TTC染色是可选的，库仑D是用于可视化的梗塞大小以快速的但非定量的方式。要注意的是TTC可以为同一个心脏中纳入任一OCT或石蜡之前进行是很重要的。
该技术的局限性
本方法允许一个石蜡包埋和低温保存的心脏部分之间，并且可以用于免疫染色进行选择。尽管如此，完整的心脏必须被剖开，并且组织不能被用于进一步的分析，如免疫印迹或RT-PCR对蛋白和基因表达分析。
关于到现有/替代方法的技术意义
由于量化步骤和，特别是分析部分的数量变化很大调查之间，定义必要获得可靠的定量是至关重要的部分的最小数目。 Takagawaêt铝，。 9表明可靠性最大化为6最小心脏切片号码-使用1毫米的间隔小鼠的全心脏的8个部分。在本协议中，5 - 进行2毫米厚的切片时，获得整个大鼠心脏的7个部分。此外，2毫米的部分是用于TTC染色标准和经常使用的尺寸。此外，该系统的采样是简单应用和呈现周期性的方面，允许整个心脏的表征。
从各2毫米片，5微米切片，并染色。对于每一个5微米部，进行隔垫的厚度，疤痕的厚度和长度，总瘢痕面积，总的LV面积，和LV腔区域的定量，并且每只动物计算每个参数的平均值。我们使用薄切片，而不是2毫米切片TTC染色马森Goldner染色同时提高了自动色彩检测和评估的准确性长度。事实上，TTC染色是在危险8,14-早期相或缺血再灌注模型的检测面积的大多有趣，而不是为慢性阶段。
MI从LAD结扎诱导可以取决于结扎部位不同而不同。在所提出的慢性梗死模型中，结扎大小被有意修改为每个动物，以及用于梗死大小和重塑的各种条件的结果分别为6周后本。因此，计算出的EI透露广泛心梗，并支持与EF相关的心脏功能观察到的差异。当梗塞段的广泛变薄发生后，梗塞的面积在透纤维化的情况下大大降低。在这种条件下，通过计算相对于整个LV（表示为LV的百分比）的梗塞组织的面积限定梗塞大小将弱评价梗塞程度。缺乏的consideration重塑引起的左室扩张和梗塞的LV壁的极端变薄可以在95％的置信以外低估梗塞大小，而存在于无壁变薄的梗塞会高估梗死大小，如表示由数值间隔。这个缺点可以通过EI计算被淘汰。
它已经显示了LV形状变化是正与EI和壁变薄15,16相关。虽然EI可以左室功能的预测，它强调的是，超声心动图是重要的和组织学分析是互补的方法，在功能和组织水平，分别评估心肌梗死。超声心动图可纵向研究，组织学分析提供基础终点试验，让LV形态的额外量化，如壁厚。
船尾未来应用或方向呃掌握这种技术
评估慢性心肌梗塞当整个心脏的全身采样和EI的计算是特别感兴趣的。此外，这种方法将适合于治疗功效的评价，特别是用于新型治疗方法，如细胞和基质的基于旨在减少梗塞面积和重塑治疗。梗死扩展的可靠的量化是对非治疗和治疗的动物之间的比较非常重要，因为终点组织学分析排除梗死面积预处理和后处理的比较。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic rat heart matrix 2 mm | 72-5015 | Harvard Appartus | |
| Inspira advanced volume controlled ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| O.C.T | BDHA361603E | VWR | |
| TTC | T8877-10G | Sigma Aldrich | |
| Mayer hematoxylin | MHS32-1L | Sigma Aldrich | |
| Acid Fuchsin CI 42685 |
F8129-50G | Sigma Aldrich | |
| Ponceau Xylidin CI 16150 |
P2395-25G | Sigma Aldrich | |
| Orange G CI 16230 |
O3756-100G | Sigma Aldrich | |
| Light green CI 42095 |
L5382-25G | Sigma Aldrich | |
| KCl | P9333-500G | Sigma Aldrich | |
| Xylol | 10315083 | HoneyWell | |
| Ethanol absolute | 10303990 | HoneyWell | |
| 2-methylbutane | M32631-1L | Sigma Aldrich | |
| Stereogical microscope | SM2800 | Nikon | |
| Formaldehyde | 99340 | Reactolab | |
| Embedding cassette | K113.1 | Carl Roth | |
| Bersoft Image measurement Software | Bersoft.com | Licensed software |
References
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