Introduction
心筋梗塞（MI）は、世界中の死亡および障害の主要な原因です。冠状動脈性心臓病は、主な原因です。 MIは、閉塞などの冠動脈イベントの連続虚血に起因します。再灌流の最初の6時間以内に行われていない場合、虚血は、不可逆的心筋壊死を誘発します。患者では、MIの特徴付けは、臨床徴候、心電図、バイオマーカー、心エコー検査、MRIイメージングの血漿レベルの評価を含む様々な診断ツールに依存し、そして組織1を解析します 。急性および慢性MIは、冠動脈閉塞の時間に対する心筋壊死のタイミングに応じてけがの二つの異なる相として分類されています。最初の7日の間に起こる急性期は、心筋細胞の損失、大規模な炎症、および線維芽細胞の動員と関連しています。心臓組織の治癒および瘢痕の形成を特徴と亜急性期、発生し、1〜4から6週間。梗塞の拡大、心室壁の菲薄化、および心室の拡張は、慢性期を特徴づけます。左心室の大規模な改造が次第に重症心不全2になります。
永久左前下行枝（LAD）結紮によって誘導される心筋梗塞、慢性心筋梗塞の標準的なげっ歯類モデルを表します。冠動脈結紮を冠動脈閉塞を模倣します。梗塞の大きさは、合字のサイトに依存します。げっ歯類モデルにおける心筋虚血損傷の特徴付けは、古典的に、このようなトロポニンIおよびT 3、心エコー検査、MRI、および組織学4,5などのバイオマーカーの血漿レベルを用いて行われます。バイオマーカーのレベルは、心筋細胞死の程度と相関しています。心エコー検査は、局所壁運動異常に起因する左心室機能障害を評価します。例えばMRIや高解像度などの他に、非侵襲的イメージング技術、心エコー検査、壁運動の減少、減少した灌流および生存心筋と瘢痕領域の容量、および減肉の評価を可能にします。 LV寸法は梗塞サイズの正確な評価を可能にします。最後に、生存可能であり、死んだ心筋の定量化は、収穫の心の組織切片の特定の汚れを使用して、死後を行い、梗塞サイズ（IS）の検証を可能にすることができます。別の重要な特徴は、梗塞拡大指数（EI）6の評価です。 EIは、最初の3日以内に貫梗塞と開始と関連しています。 EIは、壁の厚さの漸進的な減少、LV腔サイズの増大、およびLV形状の結果として変化することを特徴とします。
新規の治療の治療効果を評価するために - 特に、再生戦略細胞、マトリックスに基づいて、および齧歯類におけるMIの遺伝子送達の正確な評価は極めて重要です。乳頭筋のレベルで得られた単一の断面で測定した場合、ISサイズは、LAD結紮後により梗塞発達に存在する大きな変動にバイアスされてもよいです。頂点梗塞は、その後、掩蔽されることがあります。重要なことは、決定MIサイズに、より正確な方法は、マウス7-9またはラット10について記載されています。それにもかかわらず、IS正確LVリモデリングやリモデリングの治療誘発される減少（または予防策）を定量化するには不十分です。実際、一般的に心臓の断面で評価総LV容積のパーセンテージとして表されています。この方法は、急性心筋梗塞のために有効ですが、改造中に発生したLV壁の菲薄化は、11,12評価の下で、残っています。梗塞サイズ、構造的な変更の完全な形態学的定量は、心内膜および心外膜の長さや直径、ならびに梗塞や健康分野などのいくつかのパラメータを、定量化する必要があります。私たちは、方法論的APPRを記述します正確慢性ラットモデルにおいてMIおよびリモデリングを評価するoach。
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Protocol
すべての動物は動物ケアに関する欧州条約に準拠した人道的なケアを受けました。外科的手順は、フリブール、スイス連邦獣医局、スイスで承認され、国家獣医局の許可を得た後、スイスの動物保護法に従って行われました。
1.ハート収穫
注：すべての外科的介入は、イソフルラン麻酔下で実施しました。努力が動物の苦痛を軽減するために行われました。具体的には、全ての動物は、0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィン予め麻酔の皮下注射を受けました。心筋梗塞入校するための外科的プロトコルは、以前に他の場所13に記載されています。
- 麻酔下myocardially梗塞動物（挿管動物、2.5％イソフルラン、足のピンチ反射により確認し、適切な麻酔）に胸骨切開を行います。
- 皮膚を切断することにより、動物を開き、筋肉手術用ハサミで。左右のリブをカットしてから、胸を削除します。
- 以前の手術（LAD結紮）の後に、残りの癒着を削除します。大動脈をカットし、心を取り除きます。 （PBS中）1 MのKClに組織を入れ、その後、PBSで洗ってください。
2.組織標本
- アクリルラット心臓マトリックス中に縦方向に梗塞心を置きます。 1時間-20℃で保管してください。
- 横方向とカミソリの刃を使用して、マトリックスに直接心をカット。各スライスは2ミリメートルの厚さであることを確認してください。 ;（改造レベルに基づいて）各心臓のための7のスライド - 約5をカットこれは、体系的なサンプリングと呼ばれています。
- このステップでは、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色を行うこと（心臓スライスのベース - 頂点の向きを保つ）は任意です。
- 37℃で50分間、PBS中の1％TTCでインキュベートします。 1時間20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）でそれをインキュベートします。 betweeセクションを入れてnは2 mmのスペーサーを有する2枚のガラス板とは15X倍率でカメラに接続された立体顕微鏡で写真を撮ります。
注意！パラホルムアルデヒドは有毒です。
- 37℃で50分間、PBS中の1％TTCでインキュベートします。 1時間20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）でそれをインキュベートします。 betweeセクションを入れてnは2 mmのスペーサーを有する2枚のガラス板とは15X倍率でカメラに接続された立体顕微鏡で写真を撮ります。
- スライド凍結（1 番目のオプション）
- （金型の底に下り区間の頂点指向側を配置）方向を維持、cryotomy用培地（最適切断温度、10月）を取り付けたプラスチック金型（10×10×5ミリメートル）で、各スライドを置きます。 15分 - 10用の液体窒素冷却下、2-メチルブタン蒸気でブロックをフリーズします。最後に、-80℃で組織を保存します。
- パラフィン除去（2 番目のオプション）
- 24時間、4％PFAで各カセットを埋め込んでスライド（ダウンカセットの底の部分の頂点指向側を配置することによって方向を維持）とを配置します。ティッシュプロセッサマシンで一晩でそれを置きます。
- 2時間エタノール70％でそれをインキュベートします。イーサンでそれをインキュベート2時間95％をオール。 3時間エタノール100％でそれをインキュベートします。 4時間キシロールでそれをインキュベートします。 5時間（オーブンで60℃で溶融）パラフィンでそれをインキュベートします。最後に、パラフィンの各心臓スライドを埋め込むことにより、ブロックを作ります。
- 24時間、4％PFAで各カセットを埋め込んでスライド（ダウンカセットの底の部分の頂点指向側を配置することによって方向を維持）とを配置します。ティッシュプロセッサマシンで一晩でそれを置きます。
3.マッソン - ゴールドナートリクローム染色
- （：厚さ5μm）または-18℃に設定したクライオスタットと10月のブロックから（厚さ：7μm）のマニュアルミクロトームでパラフィンブロックから組織切片を作成します。
- マッソン-ゴールドナートリクローム染色で- （スライドあたり4横断セクション3）（ 附属書を参照 ）、各ラットについて各心部からのスライドを染色します。
注：パラフィン切片について、このステップから開始します。- オーブンで60℃でスライドを溶かします。ヒュームフードの下で、10分間ずつ二回キシロールでそれらを脱パラフィン。 3分ごとに100％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、蒸留水に再水和します。
注：凍結切片に対して、この手順から開始します秒。 - ブアン液に一晩でそれらを修正しました。 15分 - そして、10のために水道水でそれらを洗い流してください。蒸留水でそれらを洗い流してください。 3分間マイヤーのヘマトキシリンでそれらをインキュベートします。
- スライドを削除し、5分間蒸留水にそれらを残します。その後、5分間酸フクシン、ポンソーでそれらをインキュベートします。 1分間1％酢酸でそれらを洗い流します。
- 次に、1分間リンモリブデン酸オレンジGでそれらをインキュベートします。 、1分間1％酢酸でそれらを洗い流し10分間ライトグリーン色素でそれらをインキュベートし、1分間1％酢酸でそれらをすすぎます。
- 70％エタノール（30秒）、95％エタノール（30秒）、及び100％エタノール（5分）でそれらを脱水します。 、組織切片上の樹脂封入剤の1滴を入れてカバースリップでそれらをカバーし、それらを乾燥させてください。
- オーブンで60℃でスライドを溶かします。ヒュームフードの下で、10分間ずつ二回キシロールでそれらを脱パラフィン。 3分ごとに100％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、蒸留水に再水和します。
4.梗塞サイズ分析
- カメラに結合された実体顕微鏡（15X倍率）上の各スライドから1つの画像を取得します。同じ設定で定規を撮影秒。
- 、梗塞の中間に隔壁厚さ、左心室（LV）腔面積、梗塞領域、およびLVの組織領域を使用して瘢痕の厚さを測定するために画像解析ソフトウェアを使用します。
- 定規の画像（ 図1A）とのスケールを設定します。
- セット変換係数を選択し測定をクリックします。キャリブレーションバー上に線を描画します。右の写真をクリックすると、エンド・キャリブレーションをクリックしてください。バー値をメモして、[OK]をクリックします。
- 染色されたハートの絵（ 図1B）からLVを選択します。 複数のセグメントのツールを使用します。 LVポイントバイポイントを選択し、右クリック コピー/どこにでも貼り付けます。
- 単一セグメントの測定ツールを使用して傷や隔壁の厚さを測定する（ 図1C
- 自動LV腔、梗塞を検出し、LV領域はRGBモード（ 図1D）における自動面積測定ツールを使用して。
- ツールをクリックします。アクティブにのみ罫線と RGBモードでの連続 。最後に、それを検出するために、関心領域内をクリックします。必要に応じて、精密なツールを使用しています。
- 定規の画像（ 図1A）とのスケールを設定します。
- LV面積に対する梗塞面積の割合としての梗塞サイズを計算します。
- 次のように拡張インデックスを計算します[LV腔面積/全LV面積] / [梗塞厚さ/隔壁厚さ]、LV空洞とLVの組織領域の両方を含む全LVエリアと。
- 次のように最後に、それぞれの心のための「平均」を算出：[梗塞スライドから拡張インデックスの平均] * [梗塞スライド/スライドの総数の数]。
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Representative Results
6週間後のLAD結紮、心臓をLewisラットから採取しました。 2mmの組織切片は、頂部から基部に得られました。 TTC染色手順は、白で表示され、梗塞面積、および赤で表示され、健康な心筋（ 図2）を可視化するために行きました。 LADの結紮の部位に応じて、梗塞サイズが異なります。大MIについて、貫梗塞は、ベース（ 図2A）に頂点から観察されました。小さい梗塞、心臓（ 図2B）の中央部分に頂点から見える白い梗塞組織を提示しました。小さな非貫梗塞の場合は、線維性組織は、頂点（ 図2C）からの1つまたは2つのセクションで観察されました。
各心臓スライスから薄い5μmの切片を切り出し、マッソン - ゴールドナートリクロームで染色しました。心の全体の断面の写真でした実体顕微鏡下で取得（ 図3）。健康な組織は、赤と緑の中の結合組織に登場しました。各色間の識別を容易に画像解析ソフトウェアを用いて行うことができます。
梗塞及び隔壁の厚さ、LV腔面積およびLVの総面積は、EI（ 表1）を計算するために測定され、計算されました。 EIは、セクションごとに計算しました。心臓の大きさに応じて、セクションの数は、それぞれの心のために5から7に変化させ、EIは、各セクションからEIの平均です。 EIは、0から0.278まで変化し、58％のCVで、心筋梗塞の広い範囲を明らかにしました。比較では、LVの梗塞の割合の平均は、54％のCV（ 表1）を用いて、0から0.241まで変化しました。 EIおよび梗塞の割合が有意に相関しました。ノンパラメトリックスピアマン分析は、相関係数r-VAを提供しました0.491のLUEた（p = 0.005）（ 図4A）。このような0.11と0.13の近くEI値については、梗塞の割合は、5.8から24.1％に変化しました。
心機能は、麻酔した動物に6週間後LAD結紮で高分解能心エコー検査によって評価し、前の心臓収穫に一回行いました。 EIはEFと有意に相関し、組織学的定量化から計算します。ノンパラメトリックスピアマン分析は-0.709（P = 0.005）（ 図4B）のR値を提供しました。
画像解析ソフトウェア の使用図 1. ステップ・バイ・ステップのイラスト 。自動カラー区切りと長さの測定には、いくつかのステップが含まれます。 A.キャリブレーション：画像のスケールが設定されました。絵定規は、心臓部と同じ条件で撮影しました。定規の長さは、スケール変換係数を定義するためにマークしました。ピクセルからミリメートルへの変換を行いました。 B. LVの選択：右心室は、ソフトウェアの選択ツールを使用して、画像から切り出しました。 C. LV壁と中隔の厚さ測定値：単一の測定ツールが距離を定量しました。スケールバーは、3ミリメートルを示しています。 D.自動エリア定量：自動色の区切りは、RGBモードで行いました。自動選択は、自動選択モードを選択した後に行きました。色ベースの選択を変更することができます。研究者は、選択された緑色組織の視覚的な制御を行い、必要に応じて選択された領域を増加または減少しました。スケールバーは、3ミリメートルを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 
図2. ハートセクションは、TTCで染色しました。完全な心臓の2 mmの切片をTTCで染色しました。健康な心筋は白に赤と線維性組織で登場しました。異なる梗塞サイズの三つの心が提示されています。 ：大貫梗塞、B：ミディアム梗塞、およびC：小梗塞。スケールバーは、3ミリメートルを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マッソン-ゴールドナートリクロームで染色した図3.心臓切片。 5μmの切片を、6週間後にLAD結紮得られた各心臓部分から切断しました。駅INEDセクションは実体顕微鏡下に置きました。フルセクションの写真は、15X倍率で得られました。乳頭筋（戻る矢印）のレベルで得られた代表的な画像は、緑、赤と線維性組織における健全な心筋を示しています。画像は、画像解析ソフトによる自動色限界、ならびに梗塞及び隔壁厚さを測定した部位（黒線）を示します。スケールバーは、3ミリメートルを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
拡張指数（EI）と（A）をLVする梗塞関連のパーセンテージまたは駆出率（EF）（B）との間には 図4 の相関。線形回帰（黒線）および95％打ち明けますNCE間隔（点線）が表されています。ノンパラメトリックスピアマンr値が報告されています。 ：有意な相関梗塞とEIの割合（R = 0.567; P = 0.003）。梗塞拡大指数（EI）は、[LV腔面積/全LV面積] / [梗塞厚さ/隔壁厚さ]として算出しました。全LV領域を合わせLV腔とLVの組織領域として測定しました。梗塞のパーセンテージは、LVの組織領域/梗塞組織の領域として算出しました。 B：機能が大幅にEIと相関の高解像度心エコー検査を使用して6週間後LAD結紮で評価。両方のパラメータが有意に相関していた（r = -0.709; P = 0.005）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1： マッソンゴールドナー染色心臓切片上で測定されたパラメータ。
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Discussion
プロトコル内の重要なステップ
線維性組織は正確に採取し、心臓や画像の系統的なサンプリングを使用して、慢性MIラットモデルで評価することができる頂点にベースから得た三色染色した組織切片の分析。 2つのステップが成功したプロトコル実装のために特に重要です。まず、心臓の収穫のためのKClを使用することは、心臓の筋肉が弛緩した状態に維持することができます。このステップは、異なる心臓から梗塞寸法の比較のために重要です。第二に、ブアン液中のセクションの一晩の固定は明るいトリクローム染色を得るために重要です。
修正およびトラブルシューティング
染色の不在は、このような減少インキュベーション時間として、ブアン液中のセクションの固定中に問題が原因であるか、ブアンソリューションを満了してもよいです。 TTC染色はオプションとcoulです急速が、非定量的な方法で、梗塞の大きさを可視化するために使用されるDはTTCは前10月またはパラフィンのどちらかに含めるに同じ心のために実行することができることに留意することが重要です。
テクニックの制限事項
本発明の方法は、パラフィン包埋および凍結保存の心臓部との間で選択するために1つを可能にし、免疫染色のために使用することができます。それにもかかわらず、完全な心が区分されなければならない、そして組織は、タンパク質および遺伝子発現解析のためのウェスタンブロットまたはRT-PCRのように、さらなる分析のために使用することができません。
既存の/代替方法に関して技術の意義
定量手順ため及び、特に、分析セクションの数は、信頼できる定量化が最も重要である得るために必要な部分の最小数を定義し、調査の間で大きく変化します。高川電子トンアル。 1 mmの間隔を用いて、マウスの心臓全体の8つのセクション- 9は、信頼性が6の最小心臓スライス番号で最大になることを実証しました。現在のプロトコルでは、5から2ミリ厚の切片を行う際に全体のラット心臓の7セクションが得られました。さらに、2 mmのセクションでは、TTC染色のための標準と頻繁に使用されるサイズです。また、全身のサンプリングは、適用が簡単で、心臓全体の特徴付けを可能にする周期的な側面を提示しています。
2mmのスライスのそれぞれから、5μmの切片を切断し、染色しました。各5μmの部分については、隔壁厚さ、瘢痕の厚さと長さ、総瘢痕面積、総LV面積、及びLV腔面積の定量化を行い、各パラメータの平均値を動物ごとに計算しました。我々は、自動色検出及び評価の両方の精度を向上させることなく2 mmの切片をTTC染色より薄い切片をマッソン・ゴールドナー染色を使用しました長さの。確かに、TTC染色ではなく、慢性期に比べて、リスク8,14の領域を検出するための初期段階または虚血性再灌流モデルにとってとても興味深いものです。
LAD結紮から誘導されたMIは、結紮部位に応じて異なる場合があります。提示慢性心筋梗塞モデルでは、ライゲーションサイズは意図的に、それぞれの動物のために修正し、梗塞サイズおよびリモデリングの様々な条件についての結果は、6週間後に存在しました。したがって、計算されたEIは、心筋梗塞の広い範囲を明らかにし、EFと相関し、心機能に観察された差を支持しました。梗塞セグメントの大規模な間伐が発生した場合には、梗塞の面積を大幅に貫線維症の場合に減少しました。この状態で、全LVに関して梗塞組織の領域を計算することにより、梗塞サイズを定義する（LVのパーセンテージとして表される）弱い梗塞の程度を評価するであろう。 Cの欠如減肉の不在中に存在する梗塞は、梗塞サイズをオーバー見積もるでしょうが、95％の信頼の外の値で表されるように改造によって誘発されるLVの拡張および梗塞LV壁の極端な薄型化onsiderationは、梗塞サイズを過小評価することができます間隔。この欠点は、EIの計算によって排除することができます。
LVの形状変化を積極EI及び減肉15,16と相関することが示されています。 EIは、LV機能の予測因子であることができますが、その心エコー検査を強調することが重要であり、組織学的分析は、それぞれの機能や組織レベルで心筋梗塞を評価するための補完的な方法です。心エコー検査は、縦断的研究を可能にし、そして組織は、壁の厚さとしてLV形態の付加的な定量化を可能にする基本的なエンドポイントアッセイを提供する分析します。
将来のアプリケーションまたは方向後方えー、このテクニックをマスターします
慢性MIを評価する際に心臓全体の全身標本とEIの計算は、特に重要です。また、この方法は、梗塞サイズおよびリモデリングの低減を目指して細胞およびマトリックスベースの治療としての新規治療法のために、特に、治療効果の評価に適しています。エンドポイント組織は梗塞サイズの前および後処理の比較を排除分析として梗塞拡張の信頼できる定量化は、非処理及び処理した動物との比較のために極めて重要です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic rat heart matrix 2 mm | 72-5015 | Harvard Appartus | |
| Inspira advanced volume controlled ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| O.C.T | BDHA361603E | VWR | |
| TTC | T8877-10G | Sigma Aldrich | |
| Mayer hematoxylin | MHS32-1L | Sigma Aldrich | |
| Acid Fuchsin CI 42685 |
F8129-50G | Sigma Aldrich | |
| Ponceau Xylidin CI 16150 |
P2395-25G | Sigma Aldrich | |
| Orange G CI 16230 |
O3756-100G | Sigma Aldrich | |
| Light green CI 42095 |
L5382-25G | Sigma Aldrich | |
| KCl | P9333-500G | Sigma Aldrich | |
| Xylol | 10315083 | HoneyWell | |
| Ethanol absolute | 10303990 | HoneyWell | |
| 2-methylbutane | M32631-1L | Sigma Aldrich | |
| Stereogical microscope | SM2800 | Nikon | |
| Formaldehyde | 99340 | Reactolab | |
| Embedding cassette | K113.1 | Carl Roth | |
| Bersoft Image measurement Software | Bersoft.com | Licensed software |
References
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