Summary
हम चूहों में आस्तीन तकनीक का उपयोग कर एक orthotopic महाधमनी प्रत्यारोपण मॉडल पेश करते हैं । यह एक बहुत तेजी से सम्मिलन विधि है, जो संवहनी रोग के अध्ययन में नियोजित किया जा सकता है ।
Abstract
Orthotopic महाधमनी ट्रांसप्लांटेशन आस्तीन तकनीक का उपयोग केवल 10-20% की विफलता दर के साथ महाधमनी को चोट कम कर देता है । समय आस्तीन विधि का उपयोग चूहों में महाधमनी anastomose करने के लिए कम और आसान था औसत 20 मिनट, आईएसओ/एलो भ्रष्टाचारियों के अध्ययन की अनुमति । निंनलिखित लेख हमारी प्रयोगशाला में प्रयुक्त महाधमनी ट्रांसप्लांटेशन प्रक्रिया का वर्णन करता है । चूहों को एक फेस मास्क के जरिए १.५% वॉल्यूम isoflurane और १००% ऑक्सीजन के मिश्रण से anesthetized गया । इस बिंदु पर, गुर्दे की धमनियों और उसके विभाजन के बीच महाधमनी के खंड वेना कावा से अलग किया गया था, स्वतंत्र रूप से तैयार किया और एक रेशम सीवन के साथ समीपस्थ और बाहर के क्षेत्रों clampedat । महाधमनी के हटाने से पहले, हेपरिन युक्त एक खारा समाधान अवर वेना कावा में इंजेक्ट किया गया था । फिर महाधमनी clamps के बीच कट गया था और एक खारा हेपरिन समाधान लुमेन फ्लश करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । monofilament टांके के साथ आस्तीन तकनीक orthotopic स्थिति में उदर महाधमनी प्रत्यारोपण करने के क्रम में इस्तेमाल किया गया था ।
Introduction
के रूप में एक पिछले अध्ययन में बताया, महान ध्यान murine महाधमनी प्रत्यारोपण मॉडल जो विशिष्ट संवहनी खुद को और कुछ प्रणालीगत एक arteriogenic पर्यावरण के साथ जुड़े कारकों की वजह से प्रतिक्रियाओं के बीच भेदभाव की अनुमति देने के लिए भुगतान किया गया है 1 , 2 , 3. प्रमुख कारक है कि यहां एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है नॉकआउट और ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता है । इस तरह के एक मॉडल में उनकी भागीदारी की पहचान करने और नए pathophysiological atherosclerosis और धमनीविस्फार गठन के रूप में अपक्षयी संवहनी रोग, के विकास के साथ जुड़े रास्ते निर्धारित करने की संभावना प्रदान करता है4, 5.
यह ध्यान देने योग्य बात है कि प्रत्यारोपण के लिए इरादा जहाजों के लिए एक आंतरिक ischemia/reperfusion चोट भ्रष्टाचार के दौरान दिखाई दे सकता है । इसलिए, के साथ विशिष्ट समस्याओं की घटना भ्रष्टाचार अखंडता या एक अप्रत्याशित भड़काऊ प्रतिक्रिया पोस्ट-ऑपरेटिव अवधि के दौरान शामिल नहीं किया जा सकता संभवत: अपक्षयी संवहनी रोगों में precluding pathophysiological परिवर्तन3 ,4,5,6,7. आस्तीन सम्मिलन एक से कम एक मिलीमीटर के व्यास के साथ जहाजों की धमनी सम्मिलन के लिए वैकल्पिक अंत में अंत विधि है और गुर्दे और जो बाद में महाधमनी के लिए अनुकूलित किया गया था में हृदय प्रत्यारोपण में सफलतापूर्वक लागू किया गया है Dambrin एट अल द्वारा चूहों में प्रत्यारोपण । 8 , 9 , 10 , 11.
महाधमनी आस्तीन प्रत्यारोपण तकनीक का उपयोग कर नुकसान एक बहुत कम तकनीकी विफलता दर के साथ कम है, यह औसत पर केवल 20 मिनट तक चलने की वजह से । हमारे पिछले परिणामों में एक isograft के उत्कृष्ट कार्यात्मक और संरचनात्मक गुणों का प्रदर्शन किया है vivo में ट्रांसप्लांटेशन के बाद आस्तीन तकनीक1का उपयोग कर । Dambrin एट अल का वर्णन है कि एक छोटी सीखने की अवस्था के बाद सफलता की दर ७८%10से अधिक था । ऐसी घनास्त्रता के रूप में जटिलताओं दुर्लभ हैं, उदाहरण के लिए Engelbrecht एट अल. घनास्त्रता चूहे में गुर्दे प्रत्यारोपण में आस्तीन तकनीक का उपयोग कर8का पालन नहीं किया ।
आस्तीन anastomoses के साथ murine महाधमनी प्रत्यारोपण मॉडल एक तेजी से और आसान उपकरण प्रत्यारोपित पोत में आईएसओ/allograft प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए है । यह वीडियो हमारी प्रयोगशाला में किए गए महाधमनी ट्रांसप्लांटेशन प्रक्रिया को दिखाता है । इस प्रत्यारोपण मॉडल संवहनी अपक्षयी रोग के अंतर्निहित रोग तंत्र को परिभाषित करने में उपयोगी हो सकता है और आणविक और औषधीय हस्तक्षेप के आगे मूल्यांकन के लिए योगदान कर सकते हैं12.
Protocol
- संक्रमण से बचने के लिए शल्य चिकित्सा के दौरान बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए बाँझ सामग्री और उपकरणों का उपयोग करें ।
- एक चेहरा मुखौटा के माध्यम से मात्रा isoflurane और १००% ऑक्सीजन द्वारा १.५% का एक मिश्रण के साथ प्रत्येक माउस Anesthetize । लापरवाह स्थिति में एक मंच पर माउस रखना और ऑपरेटिंग टेबल के लिए अपने सभी पैरों टेप । हिंद पैर चुटकी द्वारा अपनी सजगता की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि माउस पर्याप्त anesthetized है । प्रक्रिया के दौरान सुखाने को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं ।
- एक लोमनाशक जेल का उपयोग कर पेट से सभी बाल निकालें या एक शेविंग का उपयोग करें । बाँझ शर्तों के तहत कार्रवाई करते हैं । chlorhexidine और बाँझ पानी के बारी सफ़ाई के साथ पेट को संक्रमित.
- कैंची या स्केलपेल के साथ एक midline उदर चीरा के माध्यम से दाता महाधमनी निकालें । आंत को मैन्युअल रूप से सही करने के लिए वापस लेना. धीरे मैन्युअल पाउडर मुक्त दस्ताने का उपयोग कर पक्ष के लिए पर आंतों को प्रतिबिंबित.
- यह नम रखने के लिए खारा के साथ गीला धुंध के एक टुकड़े पर मल जगह ।
- टुकड़े दूर पेट महाधमनी चिमटी के साथ एक कुंद विच्छेदन का उपयोग आसपास के ऊतकों से बहुत ध्यान से ।
- गुर्दे की धमनियों और इसके विभाजन के बीच महाधमनी के खंड को चिमटी के साथ वेना कावा से अलग करें ।
- इस खंड के सभी छोटे शाखाओं को सुरक्षित बहुत ध्यान से 11-0 monofilament एकल सीवन का उपयोग कर । महाधमनी को हटाने से पहले
- , ०.५ मिलीलीटर (एमएल) खारा समाधान के ५० यू युक्त हेपरिन के अवर वेना कावा में सुई ।
- को महाधमनी के खंड से निकलने के बाद दाता पशु exsanguinate चलो ।
- पूरी तरह से खारा के साथ भ्रष्टाचार कुल्ला और फिर यह बर्फ के एक कंटेनर को तुरंत हस्तांतरण-ठंडा खारा ।
- Anesthetize प्राप्तकर्ता पशु मात्रा isoflurane और १००% ऑक्सीजन एक चेहरा मुखौटा के माध्यम से १.५% के मिश्रण के साथ, तो बाल और संक्रमित (खंड 1) हटा दें । एक स्केलपेल के साथ श्रोणि के लिए असिरूप से एक मिड लाइन चीरा बनाओ और पेट की दीवारों को वापस लेना । प्रक्रिया के दौरान सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं ।
- लपेटें खारा समाधान में आंत्र लपेटो और विस्थापन बहुत धीरे पशु & #39; एस सही करने के लिए ।
- टुकड़े infrarenal महाधमनी को समीपस्थ गुर्दे की धमनियों और चिमटी के साथ विभाजन के बीच मुक्त ।
- इस खंड के सभी छोटे शाखाओं को सुरक्षित बहुत ध्यान से 11-0 monofilament एकल सीवन का उपयोग कर ।
- 6-0 एकल रेशम सीवन के साथ महाधमनी के समीपस्थ और बाहर के भागों दबाना ।
- के बीच में महाधमनी विभाजित clamps और heparinized खारा के साथ कटौती समाप्त होता है लुमेन खुला फ्लश करने के लिए सिंचाई ।
- जगह खिला पोत के साथ orthotopic स्थिति में भ्रष्टाचार 11-0 monofilament के साथ suturing के बाद प्राप्त करने के लिए ठीक से दाता और प्राप्तकर्ता संरेखित द्वारा महाधमनी के किसी भी मरोड़ से बचने के लिए देखभाल लेने के पोत में डाला अंत ( < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ) < सुप वर्ग = "xref" > १० .
- ध्यान लिगेचर्स के एक निरीक्षण के संचालन के बाद सम्मिलन जारी । सबसे पहले बाहर की क्लैंप छोड़ें । कम दबाव में यह परिणाम एक साथ दीवार जोत समीपस्थ उच्च दबाव पक्ष को रिहा करने से पहले ।
- Perfuse तुरंत भ्रष्टाचार और एक दिखाई नाड़ी के लिए जांच करें । धीरे से रेशम के अवशेष निकालें । दाता और प्राप्तकर्ता महाधमनी के बीच इष्टतम ओवरलैप लंबाई 1-2 mm. है
- उदर गुहा के लिए उदर सामग्री वापस और एक चल 3-0 polyglycolic एसिड सीवन के साथ पूरे घाव बंद ।
- दे माउस buprenorphine (०.०५ मिलीग्राम/शरीर के वजन चमड़े के नीचे (एससी)) संज्ञाहरण समाप्त करने से पहले ।
- एक जानवर जब तक यह पूरी तरह से होश में है उपेक्षित छोड़ मत करो । buprenophine के साथ दर्द थेरेपी प्रबंधित करें ०.०५ मिलीग्राम/kg शरीर का भार प्रशासित अनुसूचित जाति संस्थागत पर्यवेक्षण निकाय द्वारा अनुमोदित ऑपरेशन के बाद तीन दिनों के लिए एक दिन में तीन बार. ऊतक कटाई के लिए
- , anesthetize ऊपर वर्णित के रूप में प्राप्तकर्ता चूहों और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) द्वारा 4% formaldehyde/पंजाबियों, (पीएच = ७.४) हृदय पंचर द्वारा पीछा के साथ जहाजों फ्लश । भ्रष्टाचारियों को धीरे से हटा दें । 4% formaldehyde/पंजाब, प्रक्रिया नमूनों में रातोरात निर्धारण के बाद आगे और तेल में एंबेड ।
Representative Results
चूहों नहीं मनाया शारीरिक हानि के साथ 15-30 मिनट के भीतर संज्ञाहरण से बरामद किया, हालांकि वहां घनास्त्रता का एक ऊंचा जोखिम था । अल्ट्रासाउंड विश्लेषण पश्चात अनुवर्ती कार्रवाई के दौरान इस्तेमाल किया गया था । अध्ययन में इस्तेमाल किया जंगली प्रकार चूहों उनके लुमेन के आयामों में कोई बदलाव नहीं दर्शाया गया. तदनुसार, न तो stenoses और न ही aneurysmal संरचनाओं मनाया गया । प्रत्यारोपण जानवरों पोत दीवारों की पट्टिका विकास (चित्रा 2) प्रदर्शित करने में विफल ।
ऐसे immunohistology के रूप में पारंपरिक धुंधला प्रक्रियाओं पट्टिका, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के पैटर्न, और मैक्रोफेज के संचय का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे अध्ययन में ऊतकीय और immunohistochemical धुंधला 6 सप्ताह के प्रदर्शन के लिए भ्रष्टाचार की अखंडता का परीक्षण करने के बाद किया गया । ऊतकीय धुंधला (Hematoxylin और eosin (वह) और immunohistochemical धुंधला (चिकनी मांसपेशी Actin (SMA) और Macrophage (MAC2)) (चित्रा 3) हमें चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के अपरिवर्तित वितरण पैटर्न दिखाया, बरकरार endothelial सेल अस्तर, और कोई intima में कोशिकाओं का संचय । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि कोई महत्वपूर्ण घाव या कोशिका सक्रियण में भ्रष्टाचारी जहाजों (चित्रा 3) का पता लगाया गया था ।
चित्र 1 : आस्तीन तकनीक । उदर महाधमनी आस्तीन तकनीक का उपयोग कर प्रत्यारोपण किया गया था । इस कार्यविधि में दाता के महाधमनी को खिला पोत में मौजूद सतही काटने के साथ orthotopic स्थिति में रखा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : Intraoperative और अल्ट्रासाउंड छवियों. भ्रष्टाचार के intraoperative (necropsy) दृश्य के उदाहरण 6 प्रत्यारोपण के बाद सप्ताह (ए), अपने तीन आयामी अल्ट्रासाउंड (बी), और बी मोड दृश्य (ग) । पश्चात फ़ॉलो अप अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर आयोजित किया गया था । चित्र लुमेन आयामों में कोई बदलाव नहीं के साथ भ्रष्टाचार के प्रत्यक्षता दिखाओ । इसके अतिरिक्त, कोई stenoses या aneurysmal संरचनाओं मनाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : ऊतकीय और immunohistochemistry छवियां. प्रत्यारोपण के बाद 6 सप्ताह में प्रत्यारोपण पशुओं के ऊतकीय और immunohistochemistry प्रतिनिधि छवियों । प्रोटोकॉल (Hematoxylin और eosin, वह, 100X आवर्धन, स्केल बार = ५० µm), immunohistochemical धुंधला (चिकनी मांसपेशी Actin SMA (लाल), या Macrophage MAC2 (हरा), 200X आवर्धन, स्केल बार = द्वारा प्रत्यारोपित aortas में कोई महत्वपूर्ण घावों मनाया गया 25 µm) । नाभिक थे DAPI (नीला) से सना हुआ मुकाबला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
इस अध्ययन से पहले चूहों में विभिन्न अन्य ट्रांसप्लांटेशन मॉडल अच्छी तरह से विश्लेषण किया गया था3,6,7,10,13,14. महाधमनी ट्रांसप्लांटेशन के मॉडल Dambrin एट अल द्वारा संशोधनों के साथ आस्तीन तकनीक का उपयोग कर के रूप में यह हमारे मानदंडों से मेल खाता था और पारंपरिक अंत करने के लिए अंत सीवन तरीकों की तुलना में आस्तीन सम्मिलन की एक उच्च विश्वसनीयता दिखाया चुना गया था 1 , 10.
इस तकनीक को पार के साथ कई मायनों में अनुकूल है, समय काफी कम सर्जरी के दौरान महाधमनी को नुकसान ंयूनतम घटा । घनास्त्रता की एक कम घटना दाता और प्राप्तकर्ता के बीच पोत नली का व्यास में एक संभावित बेमेल से बचने के अलावा में मनाया गया । उपरोक्त अवलोकन इस तकनीक को चूहों में महाधमनी प्रत्यारोपण में संवहनी रोग की जाँच के लिए अत्यधिक उपयुक्त बनाते हैं.
एक अनुवर्ती अध्ययन में एक अल्ट्रासाउंड के 8 सप्ताह के प्रत्यारोपण के बाद प्रदर्शन किया गया था में, कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगाया गया । इस मांयताओं की पुष्टि की है कि शल्य चिकित्सा के दौरान महाधमनी को किसी भी नुकसान कम से1होगा ।
इस अनुच्छेद में प्रस्तुत प्रक्रिया भ्रष्टाचार भ्रष्टाचार अखंडता और अपने कार्य में दोनों कोई हानि की गारंटी देता है । इसलिए, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि इस प्रायोगिक प्रत्यारोपण मॉडल आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों में अपक्षयी पोत रोग के भविष्य आणविक और औषधीय जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
हमें विश्वास है कि वीडियो गाइड शिक्षण सामग्री के रूप में कार्य कर सकते है इस सरल arterio-धमनी मॉडल के उपयोग illustrating और है कि यह संवहनी विकृतियों में कई महत्वपूर्ण मुद्दों पर आगे उपयोगी बहस के लिए योगदान देगा । यह बहुत तेजी से सम्मिलन विधि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों में संवहनी रोग का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह भी प्रत्यारोपण के साथ संयुक्त धमनीविस्फार मॉडल में एक संशोधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
वहां प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण बिंदु हैं । सीवन की जगह ही सबसे महत्वपूर्ण कदम है । सर्जन के लिए दाता और प्राप्तकर्ता के उचित संरेखण द्वारा महाधमनी के किसी भी मरोड़ से बचने के लिए ध्यान रखना है । सम्मिलन के निरीक्षण के बाद clamps को सावधानी से हटा दिया जाता है । बाहर की ओर दबाना हमेशा पहले कम दबाव में एक साथ समीपस्थ उच्च दबाव पक्ष रिहाई के लिए दीवारों को पकड़े हुए जिसके परिणामस्वरूप जारी किया जाना चाहिए । ठीक से जारी करने के अनुक्रम का पालन नहीं का परिणाम खून बह रहा होगा ।
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
हम उनके उत्कृष्ट संपादन सहायता के लिए रोमा Wieczorek और पीटर Kurdybacha शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और लियोन डेकर और Uli Heuter उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halsey Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Dumont #5 Forceps - | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lexer-Baby Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vannas Scissors | Aesculap, Germany | Typ OC498R | |
| Castroviejo Suture Forceps | Geuder, Germany | 19015 | |
| 6-0 silk black (Silk) | Deknatel, Research Triangle Park NC, USA | 18020-60- FST | |
| 11-0 monofilament (Ethilon) | Ethicon, Norderstedt, Germany | EH7438G | |
| 3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) | Serag-Wiessner, Naila, Germany | 60203214 | |
| Isofluorane | Any genericon | ||
| Heparin | Any genericon | ||
| 0.9% saline | Any genericon | ||
| Buprenorphine | Any genericon | ||
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
| Microscop | Zeiss | Opmi MDO/S5 | |
| Vaporiser | Eickemeyer | TEC3 | |
| Ultrasound | Vevo, Canada | 770,2100 |
References
- Rowinska, Z., et al. Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging. Eur J Radiol. 81 (2), 244-249 (2012).
- Daugherty, A. Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci. 323 (1), 3-10 (2002).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc .Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Zernecke, A., Shagdarsuren, E., Weber, C. Chemokines in atherosclerosis: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (11), 1897-1908 (2008).
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. J Surg Res. 111 (2), 171-176 (2003).
- Koulack, J., McAlister, V. C., Giacomantonio, C. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat. J Heart Lung Transplant. 17 (11), 1057-1064 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 946-951 (1999).
- Siemionow, M. Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique. J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354 (6), 610-621 (2006).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18 (6), 368-371 (1998).
- Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease. J Vis Exp. (69), e4338 (2012).
