Summary
Apresentamos um modelo de aórtica transplante ortotópico utilizando a técnica de manga em ratos. É um método de anastomose muito rápida, que pode ser empregado em estudos de doença vascular.
Abstract
Ortotópico aórtica transplante utilizando a técnica de manga reduz lesões na aorta com taxa de falha de apenas 10-20%. O tempo que se anastomosam da aorta em camundongos, usando o método de manga foi curto e fácil, em média 20 min, permitindo estudos de iso/allo enxertos. O seguinte artigo descreve o procedimento de transplante aórtica usado em nosso laboratório. Os ratos foram anestesiados com uma mistura de isoflurano volume de 1,5% e 100% de oxigênio através de uma máscara facial. Neste ponto, o segmento da aorta entre as artérias renais e sua bifurcação foi separado da veia cava, livremente preparado e clampedat os segmentos proximais e distais, com uma única sutura de seda. Antes da remoção da aorta, uma solução salina contendo heparina foi injetada na veia cava inferior. Então a aorta foi cortada entre as pinças e uma solução de heparina salina foi usada para irrigar o lúmen. A técnica de manga com suturas monofilamento foi usada para a aorta abdominal na posição ortotópico de transplante.
Introduction
Como apontado em estudo anterior, foi dada grande atenção murino aórtica transplante modelos que permitem a discriminação entre respostas vasculares específicas causadas por enxerto em si e certos fatores sistêmicos conectados com um ambiente de arteriogenic 1 , 2 , 3. o principal fator que desempenha um papel crucial aqui é a disponibilidade de nocaute e ratos transgénicos. Seu envolvimento em tal modelo oferece a possibilidade de identificar e determinar novos caminhos fisiopatológicos associados com o desenvolvimento da doença vascular degenerativa, tais como a arteriosclerose e aneurisma formação4, 5.
É interessante notar que, durante a enxertia uma intrínseca isquemia/reperfusão lesão aos vasos destinados o transplante pode aparecer. Portanto, a ocorrência de problemas específicos com integridade de enxerto ou reação inflamatória inesperada durante o período pós-operatório não pode ser excluída possivelmente impedindo alterações fisiopatológicas em doenças vasculares degenerativas3 ,4,5,6,7. Anastomose de manga é o método alternativo de fim-de-final para anastomose arterial dos navios de menos de um milímetro de diâmetro e tem sido aplicada com sucesso em transplante renal e cardíaca em ratos, que foi posteriormente adaptado para aórtica transplante em camundongos por Dambrin et al 8 , 9 , 10 , 11.
Dano da aorta, usando a técnica de transplante de manga é minimizado com uma taxa de falha técnica muito baixa, devido à sua duração apenas de 20 min em média. Nossos resultados anteriores têm demonstrado excelentes propriedades funcionais e estruturais de um isograft na vivo após transplante usando a técnica de manga1. Dambrin et al descrevem que, depois de uma curta curva de aprendizado, a taxa de sucesso foi superior a 78%10. Complicações como trombose são raras, por exemplo. Engelbrecht et al não observaram trombose utilizando a técnica de manga em transplante renal no rato8.
O modelo murino transplante da aorta com anastomose de manga é uma ferramenta rápida e fácil para estudar reações de iso/aloenxerto no vaso transplantado. Este vídeo ilustra o procedimento de transplante aórtica realizado em nosso laboratório. Este modelo de transplante pode ser útil na definição dos mecanismos patológicos subjacentes da doença degenerativa vascular e pode contribuir para a nova avaliação de intervenções molecular e farmacológica12.
Protocol
procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) na RWTH Aachen University, AZ 84-02.04.2012.A234.
Nota: O procedimento é demonstrado usando ratos macho adulto selvagem tipo com fundo CD1. Manter os ratos em uma unidade de laboratório especializado antes e após a cirurgia, assegurando acesso adequado à comida, tratamento e controlo veterinário especializado. Se os animais são comprados lá fora, permitir uma semana aclimatação antes de realizar a cirurgia.
1. preparação do doador
- usa materiais estéreis e instrumentos para manter condições estéreis durante a cirurgia para evitar infecções.
- Anestesiar cada rato com uma mistura de 1,5% por volume isoflurano e 100% de oxigênio através de uma máscara facial. Coloque o mouse sobre uma plataforma na posição supina e fita todas suas pernas para a mesa de operação. Seus reflexos beliscando as patas para certifique-se de que o mouse é suficientemente anestesiado. Coloque pomada oftálmica nos olhos para impedir a secagem durante o procedimento.
- Retirar todos os pelos do abdome usando um gel depilatório ou usar uma máquina de barbear. Execute a operação em condições estéreis. Desinfectar o abdômen com a alternância de esfoliantes de clorexidina e água estéril.
- Remove a aorta de doador através de uma incisão abdominal com tesoura ou bisturi. Retrai o intestino manualmente para a direita. Delicadamente manualmente refletem os intestinos sobre para o lado usando luvas livre de pó.
- Coloque o intestino em um pedaço de gaze humedecido com soro fisiológico para mantê-lo úmido.
- Distância dissecar a aorta abdominal com muito cuidado do tecido circundante usando uma dissecção romba com pinça.
- Separar o segmento da aorta entre as artérias renais e sua bifurcação da veia cava com uma pinça.
- Seguro todos os ramos pequenos deste segmento muito cuidadosamente com sutura simples do monofilamento de 11-0.
- Antes de remover a aorta, injetar 0,5 mililitros (mL) de solução salina contendo 50 U de heparina para a veia cava inferior.
- Deixa o animal dador extrair sangue depois que o segmento da aorta é removido.
- Lavar a prótese totalmente com solução salina e em seguida, transferi-lo imediatamente para um recipiente de solução salina gelada.
2. Preparação do destinatário
- anestesiar o animal destinatário com uma mistura de 1,5% por volume isoflurano e 100% de oxigênio através de uma máscara de rosto, em seguida, remover o cabelo e desinfectar (secção 1). Faça uma incisão de linha média de xifoide até a pélvis com um bisturi e retrair as paredes abdominais. Coloque pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante o procedimento.
- Wrap o intestino em solução salina umedecido gaze e deslocar suavemente ao animal ' s certo.
- Dissecar a aorta infra-renal livre entre as artérias renais proximalmente e distalmente com pinças bifurcação.
- Seguro todos os ramos pequenos deste segmento muito cuidadosamente com sutura simples do monofilamento de 11-0.
- Braçadeira as porções proximais e distais da aorta com uma sutura de seda única 6-0.
- Dividir a aorta no meio entre as pinças e irrigar as extremidades cortadas com soro fisiológico heparinizado para lavar o lúmen aberto.
- Colocar o enxerto na posição ortotópico com o fim de navio alimentação inserido no navio receptor seguido de sutura com monofilamento de 11-0, tendo o cuidado de evitar qualquer torção da aorta alinhando adequadamente o doador e receptor ( a Figura 1) 10.
- cuidadosamente solte as ligaduras após a realização de uma inspeção da anastomose. Libere a pinça distal primeiro. Isso resulta em baixa pressão, segurando as paredes juntos antes de liberar o lado de alta pressão proximal.
- Perfundir o enxerto imediatamente e verifique o pulso visível. Retire com cuidado os restos da seda. O comprimento ideal de sobreposição entre o dador e o receptor aorta é 1-2 mm.
- Retornar o conteúdo abdominal para a cavidade abdominal e fechar toda a ferida com uma sutura ácido poliglicólico de execução 3-0.
- Dar a rato buprenorfina (0,05 mg/kg peso corporal por via subcutânea (SC)) antes de encerrar a anestesia.
- Não abandone um animal até que esteja totalmente consciente. Controlar a dor terapia com buprenophine 0,05 mg/kg de peso corporal administrado SC três vezes ao dia por três dias após a operação conforme aprovado pelo órgão de fiscalização institucional.
- Para tecido colheita, anestesiar os ratos destinatários como descrito acima e irrigue os vasos com tampão fosfato salino (PBS) seguiram de 4% de formaldeído/PBS, (pH = 7,4) por punção cardíaca. Retire os enxertos suavemente. Após a fixação da noite em 4% formaldeído/PBS, espécimes de processo mais e incorporar em parafina.
Representative Results
Os ratos recuperaram da anestesia dentro de 15-30 min com nenhum comprometimento físico observado, embora houvesse um risco elevado de trombose. Análise de ultra-som foi usada durante o seguimento pós-operatório. Os tipo selvagem ratos utilizados no estudo não exibiram nenhuma alteração nas dimensões de seu lúmen. Por conseguinte, estenoses nem aneurismática formações foram observadas. Os animais de transplante não apresentam desenvolvimento de placa das paredes dos vasos (Figura 2).
Procedimentos de coloração convencionais tais como immunohistology podem ser usados para determinar a placa, o padrão das células musculares lisas e acúmulo de macrófagos. Em nosso estudo a histológica e coloração imuno-histoquímica foi realizada seis semanas após a enxertia para testar a integridade da prótese. Coloração histológica (hematoxilina e eosina (HE) e imuno-histoquímico de coloração (actina de músculo liso (SMA) e macrófagos (MAC2)) (Figura 3) nos mostrou inalterada padrões de distribuição de células de músculo liso, forro de célula endotelial intacta e não acúmulo de células na íntima. Esses achados indicam que nenhuma ativação significativa da lesão ou célula foi detectada nos vasos enxertados (Figura 3).
Figura 1 : Técnica da luva. A aorta abdominal foi transplantada usando a técnica de manga. Neste procedimento, aorta do doador foi colocado na posição ortotópico com picadas superficiais presentes no recipiente alimentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Intra-operatória e imagens de ultra-som. Exemplos de exibição de intra-operatória (necropsia) os enxertos 6 semanas após o transplante (A), o ultra-som tridimensional (B) e exibição de modo-B (C). O acompanhamento pós-operatório foi realizado utilizando o ultra-som. As fotos mostram a patência do enxerto com nenhuma mudança nas dimensões do lúmen. Além disso, sem estenoses ou aneurismática formações foram observadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Histológico e imuno-histoquímica imagens. As imagens representativas histológicas e imuno-histoquímica de animais transplantados com 6 semanas após o transplante. Sem lesões significativas foram observadas na aorta transplantada pela histologia (hematoxilina e eosina, ele, ampliação de 100 X, barra de escala = 50 µm), imuno-histoquímica coloração (SMA de actina de músculo liso (vermelho), ou macrófago MAC2 (verde), ampliação de X 200, escala bar = 25 µm). Núcleos Counter-foram corados por DAPI (azuis). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Antes deste estudo vários outros modelos de transplante em camundongos foram exaustivamente analisadas3,6,7,10,13,14. O modelo de transplante da aorta, usando a técnica de manga com modificações por Dambrin et al foi selecionado como combinado nossos critérios e mostrou uma alta confiabilidade de anastomose em comparação com métodos convencionais-to-end de sutura manga 1 , 10.
Esta técnica é favorável em muitos aspectos com grampear tempo consideravelmente reduzido, minimizando os danos para a aorta durante a cirurgia. Observou-se uma baixa incidência de trombose, além de evitar uma potencial incompatibilidade no calibre de navio entre o dador e o receptor. As observações acima fazem esta técnica altamente apropriado para investigar doença vascular em aorta transplantes em ratos.
Em um estudo de acompanhamento, em que um ultra-som foi realizado a 8 semanas após o transplante, sem alterações significativas foram detectadas. Isto confirmado suposições que qualquer dano na aorta durante a cirurgia seria mínimo1.
O procedimento de enxerto apresentado neste artigo não garante nenhum comprometimento tanto em sua função e a integridade do enxerto. Portanto, pode-se concluir que este modelo experimental de transplante pode servir como uma ferramenta valiosa para futuras investigações moleculares e farmacológicas da doença degenerativa do navio em camundongos geneticamente modificados.
Acreditamos que o guia vídeo pode funcionar como ilustrando o uso deste modelo simples de artério-arterial de material de ensino e que contribuirá para mais frutífero debate em muitas questões importantes em patologias vasculares. Este método de anastomose muito rápida pode ser usado para estudar a doença vascular em ratos geneticamente modificados. Ele também pode ser usado como uma modificação no modelo de aneurisma, combinado com o transplante.
Há pontos críticos durante o procedimento. A colocação da sutura em si é o passo mais crítico. O cirurgião tem que ter cuidado para evitar qualquer torção da aorta por alinhamento adequado do doador e do receptor. Os grampos são cuidadosamente removidos após a inspeção da anastomose. A pinça distal sempre deve ser lançada primeiro, resultando em baixa pressão, segurando as paredes juntos antes do lançamento do lado de alta pressão proximal. A consequência de não corretamente seguindo a sequência de lançamento poderia estar sangrando.
Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Roma Wieczorek e Peter Kurdybacha por sua excelente assistência de edição e Leon Decker e Uli Heuter para sua assistência técnica excelente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halsey Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Dumont #5 Forceps - | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lexer-Baby Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vannas Scissors | Aesculap, Germany | Typ OC498R | |
| Castroviejo Suture Forceps | Geuder, Germany | 19015 | |
| 6-0 silk black (Silk) | Deknatel, Research Triangle Park NC, USA | 18020-60- FST | |
| 11-0 monofilament (Ethilon) | Ethicon, Norderstedt, Germany | EH7438G | |
| 3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) | Serag-Wiessner, Naila, Germany | 60203214 | |
| Isofluorane | Any genericon | ||
| Heparin | Any genericon | ||
| 0.9% saline | Any genericon | ||
| Buprenorphine | Any genericon | ||
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
| Microscop | Zeiss | Opmi MDO/S5 | |
| Vaporiser | Eickemeyer | TEC3 | |
| Ultrasound | Vevo, Canada | 770,2100 |
References
- Rowinska, Z., et al. Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging. Eur J Radiol. 81 (2), 244-249 (2012).
- Daugherty, A. Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci. 323 (1), 3-10 (2002).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc .Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Zernecke, A., Shagdarsuren, E., Weber, C. Chemokines in atherosclerosis: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (11), 1897-1908 (2008).
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. J Surg Res. 111 (2), 171-176 (2003).
- Koulack, J., McAlister, V. C., Giacomantonio, C. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat. J Heart Lung Transplant. 17 (11), 1057-1064 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 946-951 (1999).
- Siemionow, M. Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique. J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354 (6), 610-621 (2006).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18 (6), 368-371 (1998).
- Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease. J Vis Exp. (69), e4338 (2012).
