Summary
Vi presenterar en ortotop aorta transplantation modell med ärm-tekniken hos möss. Det är en mycket snabb anastomos metod, som kan användas i studier av vaskulär sjukdom.
Abstract
Ortotop aorta transplantation med ärm-tekniken minskar skador på aorta med Felfrekvens för bara 10-20%. Tid att anastomose aorta i möss med metoden sleeve var kort och enkelt genomsnitt 20 min, tillåter studier av iso/allo ympkvistar. Följande artikel beskriver det aorta transplantation förfarande används i vårt laboratorium. Mössen var bedövas med en blandning av 1,5% volym isofluran och 100% syre genom en ansiktsmask. Vid denna punkt, segmentet av aorta mellan njurartärerna och dess bifurkation avskildes från vena cava, fritt beredd och clampedat proximala och distala segment med en enda silk sutur. Före avlägsnande av aorta injicerades en saltlösning som innehåller heparin i den sämre vena cava. Då aorta sänktes mellan klämmorna och en saltlösning heparin lösning användes att spola lumen. Ärm tekniken med monofilament suturer användes för att transplantera bukaorta i ortotop position.
Introduction
Som påpekat i en tidigare studie, har stor uppmärksamhet ägnats åt murina aorta transplantation modeller som tillåter diskriminering mellan specifika vaskulär reaktioner orsakade av graften själv och vissa systemiska faktorer i samband med en arteriogenic miljö 1 , 2 , 3. den viktigaste faktorn som spelar en avgörande roll här är tillgången på knockout och transgena möss. Deras deltagande i en sådan modell erbjuder möjligheten att identifiera och fastställa nya patofysiologiska vägar är associerad med utveckling av degenerativa kärlsjukdom, såsom åderförkalkning och aneurysm bildas4, 5.
Det är värt att notera att skada till fartyg avsedda för transplantation kan visas under ympning en inneboende ischemi/reperfusion. Därför kan förekomsten av specifika problem med transplantat integritet eller en oväntad inflammatorisk reaktion under den postoperativa perioden uteslutas genom att eventuellt utesluter patofysiologiska förändringar i degenerativa vaskulära sjukdomar3 ,4,5,6,7. Ärm anastomos är den alternativa slut i metoden för arteriell anastomos för fartyg med en diameter på mindre än en millimeter och har tillämpats i njur- och hjärt transplantation hos råttor som anpassades därefter till aorta benmärgstransplantation hos möss av Dambrin et al. 8 , 9 , 10 , 11.
Aorta skador med ärm transplantation teknik minimeras med en mycket låg teknisk felfrekvens, på grund av det varar bara 20 min i genomsnitt. Våra tidigare resultat har visat utmärkta funktionella och strukturella egenskaper i en isograft i vivo efter transplantation använder ärm teknik1. Dambrin et al. beskriver som efter en kort inlärningskurva framgång var över 78%10. Komplikationer såsom trombos är sällsynta, till exempel Engelbrecht et al. inte iakttog trombos med ärm-tekniken i njurtransplantation i råtta8.
Murina aorta transplantation modellen med ärm anastomoser är en snabb och lätt verktyg att studera iso/transplantatavstötning reaktioner i transplanterade fartyget. Denna video illustrerar det aorta transplantation förfarande som utförs i vårt laboratorium. Denna transplantation modell kan vara användbara i att definiera de underliggande patologiska mekanismerna av vaskulär degenerativ sjukdom och kan bidra till ytterligare utvärdering av molekylära och farmakologiska interventioner12.
Protocol
förfaranden som omfattar animaliska ämnen godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid RWTH Aachen University, AZ 84-02.04.2012.A234.
Obs: förfarandet demonstreras med vuxna manliga vildtyp möss med CD1 bakgrund. Hålla möss i ett specialiserat laboratorium enhet före och efter operationen, att säkerställa ordentlig tillgång till mat, specialiserad veterinär kontroll och behandling. Om djuren är köpt från utanför, tillåta en veckas acklimatisering innan du utför kirurgi.
1. beredning av givaren
- Använd sterila material och instrument för att upprätthålla sterila förhållanden under operation för att undvika infektioner.
- Söva varje mus med en blandning av 1,5% av volymen isofluran och 100% syre genom en ansiktsmask. Lägga musen på en plattform i ryggläge och tejpen på alla sina ben till operationsbordet. Kontrollera dess reflexer genom att nypa bakfotarna för att vara säker på att musen är tillräckligt sövd. Placera oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra uttorkning under förfarandet.
- Bort allt hår från buken med hjälp av en hårborttagningsprodukter gel eller använda en rakapparat. Utför åtgärden under sterila förhållanden. Desinficera buken med omväxlande scrubs av klorhexidin och sterilt vatten.
- Ta bort givaren aorta via en mittlinjen buk snitt med sax eller skalpell. Dra tillbaka tarmen manuellt till höger. Försiktigt manuellt reflektera tarmarna över till sidan använder pulver gratis handskar.
- Placera tarmen på en bit kompress fuktad med koksaltlösning att hålla den fuktig.
- Dissekera bort bukaorta mycket noggrant från den omgivande vävnaden med en trubbig dissektion med pincett.
- Separat segmentet av aorta mellan njurartärerna och dess bifurkation från vena cava med pincett.
- Säkra alla små grenar inom detta segment som är mycket noga med 11-0 monofilament enstaka sutur.
- Innan du tar bort aorta, injicera 0,5 milliliter (mL) av koksaltlösning innehållande 50 U av heparin i den sämre hålvenen.
- Låt donatordjuret exsanguinate efter segmentet av aorta avlägsnas.
- Skölj graften fullt med koksaltlösning och sedan överföra den direkt till en container med iskallt saltlösning.
2. Beredning av mottagaren
- söva mottagarens djuret med en blandning av 1,5% av volymen isofluran och 100% syre genom en ansiktsmask, och sedan ta bort håret och desinficera (avsnitt 1). Gör en mittlinjen snitt från xiphoid till bäckenet med en skalpell och dra in buken väggarna. Placera oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra torrhet under förfarandet.
- Wrap tarmen i saltlösning fuktad kompress och förskjuter mycket försiktigt att djuret ' s rätt.
- Analysera infrarenala aorta gratis mellan njurartärerna proximalt och distalt med pincett bifurkation.
- Säkra alla små grenar inom detta segment som är mycket noga med 11-0 monofilament enstaka sutur.
- Klämma den proximala och distala delen av aorta med en 6-0 enda silk sutur.
- Dela aorta i mitten mellan klämmorna och vattna skär ändarna med hepariniserad koksaltlösning att spola lumen öppna.
- Placera transplantat i ortotop position med utfodring fartyget slutet infogas i det mottagande fartyget följt av suturering med 11-0 monofilament för att undvika någon vridning av aorta genom att korrekt anpassa givare och mottagare) figur 1) 10.
- försiktigt släppa ligaturer efter en kontroll av anastomos. Släpp den distala klämman först. Detta resulterar i lågtryck håller väggarna tillsammans innan den proximala högtrycks sidan.
- BEGJUTA graften omedelbart och kontrollera om en synlig puls. Ta försiktigt bort resterna av silke. Den optimala överlappning mellan givare och mottagare aorta är 1-2 mm.
- Återvända buk innehållet till bukhålan och Stäng hela såret med en löpande 3-0 polyglycolic syra suturen.
- Ge mus buprenorfin (0,05 mg/kg kroppsvikt subkutant (SC)) innan avslutande anestesi.
- Lämna inte ett djur utan uppsikt tills den är fullt medvetna. Hantera smärta terapi med buprenophine 0,05 mg/kg kroppsvikt administrerat SC tre gånger om dagen i tre dagar efter operationen som godkänts av institutionella tillsynsorganet.
- För vävnad skörd, söva mottagarens mössen som beskrivs ovan och spola fartyg med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 4% formaldehyd/PBS, (pH = 7.4) av hjärt punktering. Ta försiktigt bort grafterna. Efter övernattning fixering i 4% formaldehyd/PBS, processen exemplar ytterligare och bädda in i paraffin.
Representative Results
Mössen återhämtat sig från anestesi inom 15-30 min utan någon observerade fysisk nedsättning, även om det fanns en förhöjd risk för trombos. Ultraljud undersökning användes under postoperativ följa. Vildtyp möss används i studien uppvisade inga förändringar i dimensioner av deras lumen. Således observerades varken stenoser eller aneurysmal formationer. Transplantationen djuren inte uppvisar plack utveckling av kärlväggen (figur 2).
Konventionell färgning förfaranden såsom immunohistology kan användas för att avgöra plack, mönster av glatta muskelceller, och ansamling av makrofager. I vår studie som är den histologiska och immunhistokemisk färgning utfördes 6 veckor efter ympning testa integriteten för transplantatet. Histologiska färgning (Hematoxylin och eosin (han) och immunhistokemisk färgning (Smooth Muscle aktin (SMA) och makrofag (MAC2)) (figur 3) visade oss oförändrad spridningsmönster av glatta muskelceller, intakt endotelceller foder och nr ansamling av celler i intima. Dessa fynd tyder på att ingen betydande lesion eller cell aktivering identifierades i de ympade fartyg (figur 3).
Figur 1 : Hylsa teknik. Bukaorta var transplanteras med ärm-tekniken. I den här proceduren placerades givarens aorta i ortotop position med ytliga biter i utfodring fartyget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Intraoperativa och ultraljudsbilder. Exempel av intraoperativ (obduktion) beskådar av grafterna 6 veckor efter transplantation (A), dess tredimensionellt ultraljud (B) och B-läge Visa (C). Postoperativ uppföljning genomfördes med hjälp av ultraljud. Bilderna visar patency av graften med ingen förändring i lumen dimensioner. Dessutom observerades inga stenoser eller aneurysmal formationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Histologiska och immunohistokemi bilder. De histologiska och immunohistokemi representativa bilderna av transplanterade djur på 6 veckor efter transplantation. Inga signifikanta lesioner observerades hos transplanterade artärer med histologi (Hematoxylin och eosin, han, 100 X förstoring, skalstapeln = 50 µm), immunhistokemisk färgning (Smooth Muscle aktin SMA (röd) eller makrofag MAC2 (grön), 200 X förstoring, skala bar = 25 µm). Atomkärnor var kontra färgas av DAPI (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Innan denna studie var olika andra transplantation modeller hos möss grundligt analyserade3,6,7,10,13,14. Modell av aorta transplantation med ärm-tekniken med ändringar av Dambrin et al. valdes som det matchade våra kriterier och visade en hög tillförlitlighet av ärm anastomos i jämförelse med konventionella end-to-end sutur metoder 1 , 10.
Denna teknik är gynnsamt på många sätt med cross-clamp tid minskat betydligt minimerar skadorna på aorta under operation. En låg incidens av trombos observerades förutom att undvika en potentiell felmatchning i fartyg kaliber mellan givaren och mottagaren. Ovanstående gör denna teknik mycket lämplig för att utreda kärlsjukdom i aorta transplantationer hos möss.
I en uppföljande studie där ett ultraljud utfördes 8 veckor efter transplantation, upptäcktes inga betydande förändringar. Detta bekräftade antaganden att eventuella skador på aorta under operation skulle vara minimal1.
Det ympning förfarande som presenteras i denna artikel garanterar ingen försämring både i transplantat integriteten och dess funktion. Slutsatsen kan därför dras att denna experimentella transplantation modell kan tjäna som ett värdefullt verktyg för framtida molekylär och farmakologiska undersökningar av degenerativa fartyget sjukdom hos genetiskt modifierade möss.
Vi anser att den video guiden kan fungera som undervisningsmaterial som åskådliggör denna enkla arterio-arteriella modell och att den kommer att bidra till ytterligare givande debatt på många viktiga frågor i vaskulära sjukdomar. Denna mycket snabba anastomos metod kan användas att studera kärlsjukdom i genetiskt modifierade möss. Det kan också användas som en ändring i aneurysmet modellen kombineras med transplantation.
Det finns kritiska punkter under förfarandet. Utsläppande av suturen själv är det mest kritiska steget. Kirurgen måste vara noga med för att undvika någon vridning av aorta vid korrekt justering av givare och mottagare. Klämmorna avlägsnas noggrant efter inspektion av anastomos. Den distala klämman ska alltid släppas först vilket resulterar i lågtryck håller väggarna tillsammans före proximala högtrycks sida utgivningen. Konsekvensen av att inte riktigt följer release skulle blödning.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Roma Wieczorek och Peter Kurdybacha för deras utmärkta redigering hjälp, och Leon Decker och Uli Heuter för deras utmärkta tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halsey Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Dumont #5 Forceps - | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lexer-Baby Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vannas Scissors | Aesculap, Germany | Typ OC498R | |
| Castroviejo Suture Forceps | Geuder, Germany | 19015 | |
| 6-0 silk black (Silk) | Deknatel, Research Triangle Park NC, USA | 18020-60- FST | |
| 11-0 monofilament (Ethilon) | Ethicon, Norderstedt, Germany | EH7438G | |
| 3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) | Serag-Wiessner, Naila, Germany | 60203214 | |
| Isofluorane | Any genericon | ||
| Heparin | Any genericon | ||
| 0.9% saline | Any genericon | ||
| Buprenorphine | Any genericon | ||
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
| Microscop | Zeiss | Opmi MDO/S5 | |
| Vaporiser | Eickemeyer | TEC3 | |
| Ultrasound | Vevo, Canada | 770,2100 |
References
- Rowinska, Z., et al. Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging. Eur J Radiol. 81 (2), 244-249 (2012).
- Daugherty, A. Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci. 323 (1), 3-10 (2002).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc .Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Zernecke, A., Shagdarsuren, E., Weber, C. Chemokines in atherosclerosis: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (11), 1897-1908 (2008).
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. J Surg Res. 111 (2), 171-176 (2003).
- Koulack, J., McAlister, V. C., Giacomantonio, C. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat. J Heart Lung Transplant. 17 (11), 1057-1064 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 946-951 (1999).
- Siemionow, M. Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique. J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354 (6), 610-621 (2006).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18 (6), 368-371 (1998).
- Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease. J Vis Exp. (69), e4338 (2012).
