Summary
Vi presenterer en orthotopic aorta transplantasjon modell ved hjelp av ermet teknikk i mus. Det er en svært rask anastomose metode, som kan brukes i studier av vaskulær sykdom.
Abstract
Orthotopic aorta transplantasjon ved hjelp av ermet teknikken reduserer skader aorta med failure rate av bare 10-20%. Tid til å anastomose aorta i mus med metoden ermet var kort og enkelt snitt 20 min, tillater studier av iso/allo grafts. Følgende artikkel beskriver aorta transplantasjon fremgangsmåten brukes i vårt laboratorium. Mus var anesthetized med en blanding av 1,5% volumet isoflurane og 100% oksygen gjennom en ansiktsmaske. Foreløpig segmentet av aorta mellom den nyre arteries og dens bifurkasjonen ble skilt fra vena cava, fritt forberedt og clampedat de proksimale og distale segmentene med en enkelt silke Sutur. Før fjerning av aorta, ble en saltvannsoppløsning som inneholder heparin injisert i den underlegne vena cava. Deretter aorta ble kuttet mellom klemmer og en saltvann heparin-oppløsningen ble brukt til å tømme lumen. Ermet teknikken med monofilament suturer ble brukt for å transplantere abdominal aorta i orthotopic posisjon.
Introduction
Som påpekt i en tidligere studie, er stor oppmerksomhet betalt til murine aorta transplantasjon modeller som tillater diskriminering mellom bestemte vaskulær svar forårsaket av graftet selv og visse systemiske faktorer forbundet med et arteriogenic miljø 1 , 2 , 3. den viktigste faktoren som spiller en avgjørende rolle her er tilgjengeligheten av knockout og transgene mus. Deres engasjement i slik modell tilbyr muligheten til å identifisere og bestemme nye patofysiologiske veier knyttet til utviklingen av degenerative vaskulær sykdom, som åreforkalkning og aneurisme formasjon4, 5.
Det er verdt å merke seg at under pode en iboende iskemi/reperfusion skade fartøyene ment for transplantasjon kan vises. Derfor kan ikke forekomsten av problemer med pode integritet eller en uventet inflammatorisk reaksjon i postoperativ perioden være utelukket muligens utelukker patofysiologiske endringer i degenerative vascular sykdommer3 ,4,5,6,7. Ermet anastomose er alternativ i ende-metoden for arteriell anastomose av fartøy med en diameter på mindre enn en millimeter og har vært brukt med hell i nyre og kardiale transplantasjon i rotter som senere ble tilpasset til aorta transplantasjon i mus ved Dambrin et al. 8 , 9 , 10 , 11.
Aorta skade ved hjelp av ermet transplantasjon teknikken er minimert med en svært lav teknisk svikt rente, på grunn av det varer bare 20 minutter i gjennomsnitt. Våre tidligere resultater har vist gode funksjonelle og strukturelle egenskapene for en isograft i vivo etter transplantasjon bruker ermet teknikk1. Dambrin et al. beskrive etter en kort læringskurve suksessraten var over 78%10. Komplikasjoner som blodpropp er sjeldne, for eksempel Engelbrecht et al. ikke observerer trombose ved hjelp av ermet teknikk i nyre transplantasjon i rotte8.
Murine aorta transplantasjon modellen med ermet forekomst er en rask og enkel verktøyet å studere iso/allograft reaksjoner hos transplanterte fartøyet. Denne videoen viser aorta transplantasjon prosedyren i vårt laboratorium. Transplantasjon modellen kan være nyttig i å definere underliggende patologisk mekanismer for vaskulær degenerativ sykdom og kan bidra til videre evaluering av molekylære og farmakologiske intervensjoner12.
Protocol
prosedyrer som involverer dyr fag ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på RWTH Aachen University, AZ 84-02.04.2012.A234.
Merk: prosedyren er demonstrert med voksne mannlige vill-type mus med CD1 bakgrunn. Holde mus i en spesialisert laboratorium enhet før og etter operasjonen, sikre riktig tilgang til mat, spesialisert veterinær kontroll og behandling. Dyrene er kjøpt fra utenfor tillate ukes Akklimatisering før utføre kirurgi.
1. utarbeidelse av Donor
- Bruk sterilt materialer og instrumenter til å vedlikeholde sterile forhold under operasjonen unngå infeksjoner.
- Bedøve hver musen med en blanding av 1,5% av volumet isoflurane og 100% oksygen gjennom en ansiktsmaske. Plasser musen på en plattform i supine posisjon og tape alle sine ben i drifts tabellen. Sjekk dens reflekser ved pinching bakben feet for å forsikre at musen er tilstrekkelig anesthetized. Plasser ophthalmica salve på øynene for å hindre tørking under prosedyren.
- Fjerner alle hår fra magen med en depilatory gel eller bruke en barbermaskin. Utføre operasjonen under sterile forhold. Desinfiser magen med vekslende scrubs av chlorhexidine og sterilt vann.
- Fjerne donor aorta via en midtlinjen abdominal snitt med saks eller skalpell. Trekke tarm manuelt til høyre. Forsiktig manuelt reflekterer tarmen til side ved hjelp av pulver gratis hansker.
- Plasser tarm på et stykke gasbind wetted med saltvann å holde dem fuktige.
- Dissekere unna abdominal aorta nøye fra de omkringliggende vev med en stump disseksjon med pinsett.
- Skille segmentet av aorta mellom den nyre arteries og dens bifurkasjonen fra vena cava med pinsett.
- Sikre alle små grenene i dette segmentet svært forsiktig med 11-0 monofilament enkelt Sutur.
- Før du fjerner aorta, injisere 0,5 ml (mL) saltvannsoppløsning som inneholder 50 U av heparin i de underlegne vena cava.
- La donor dyr exsanguinate etter segmentet av aorta fjernes.
- Skyll graftet fullt med saltvann og deretter overføre det umiddelbart av iskalde saline.
2. Utarbeidelse av mottakeren
- bedøve mottaker dyret med en blanding av 1,5% av volumet isoflurane og 100% oksygen gjennom en ansiktsmaske, deretter fjerne håret og desinfisere (del 1). Gjør en midtlinje snitt fra xiphoid bekkenet med skalpell og trekke abdominal veggene. Plasser ophthalmica salve på øynene for å hindre tørrhet under prosedyren.
- Brytes tarm i saltvann fuktet gasbind og fortrenge svært forsiktig til dyret ' s rett.
- Analysere infrarenal aorta gratis mellom den nyre arteries proximally og bifurkasjonen distally med pinsett.
- Sikre alle små grenene i dette segmentet svært forsiktig med 11-0 monofilament enkelt Sutur.
- Klemme de proksimale og distale del av aorta med en 6-0 enkelt silke Sutur.
- Dele aorta midt mellom klemmer og vanne kutt endene med heparinized saltvann å spyle lumen åpne.
- Plasserer graftet i orthotopic posisjon med fôring fartøyet slutten inn mottar fartøyet etterfulgt av suturing med 11-0 monofilament ta vare for å unngå noen torsjon aortabuen ved riktig justering av giver og mottaker ( figur 1) 10.
- nøye slipper ligaturer etter gjennomfører en inspeksjon av anastomose. Løsne distale klemmen først. Dette fører til lavt trykk holder veggene sammen før den proksimale høytrykks siden.
- Perfuse graftet umiddelbart og se etter en synlig puls. Forsiktig fjerne restene av silke. Optimal overlapping mellom giver og mottaker aorta er 1-2 mm.
- Tilbake abdominal innholdet til bukhulen og lukker hele såret med en kjører 3-0 polyglycolic syre Sutur.
- Gi musen buprenorfin (0,05 mg/kg kropp vekt subcutaneously (SC)) før avslutte anestesi.
- Ikke la et dyr uovervåket før det er fullt bevisst. Administrere smerte behandling med buprenophine 0,05 mg/kg kroppsvekt administrert SC tre ganger om dagen i tre dager etter operasjonen som er godkjent av selve institusjonelle forglemmelse.
- For vev høsting, bedøve mottaker musene som beskrevet ovenfor og flush fartøyene med fosfat-bufret saltvann (PBS) etterfulgt av 4% formaldehyd/PBS, (pH = 7.4) av cardiac punktering. Fjerne graftene forsiktig. Etter natten fiksering på 4% formaldehyd/PBS, prosessen prøver videre og bygge inn i parafin.
Representative Results
Mus utvinnes fra anestesi i 15-30 min med ingen observert fysisk svekkelse, men det var forhøyet risiko for trombose. Ultralyd analyse ble brukt under postoperativ følge. Wild type musene som brukes i studien viste ingen endringer i dimensjonene av deres lumen. Følgelig ble stenoses verken aneurisme formasjoner observert. Transplantasjon dyrene kunne forevise plakk utviklingen av fartøy vegger (figur 2).
Konvensjonelle flekker prosedyrer som immunohistology kan brukes til å bestemme plakk, mønster av den glatte muskelcellene og akkumulering av makrofager. I vår studie av histologiske og immunohistochemical flekker ble utført 6 uker etter pode å teste integriteten til graftet. Histologiske flekker (Hematoxylin og eosin (han) og immunohistochemical flekker (glatt muskel utgangen (SMA) og Macrophage (MAC2)) (Figur 3) viste oss uendret distribusjonsmønstrene glatte muskelcellene, intakt endothelial celle fôr og no akkumulering av celler i intima. Disse funnene tyder på at ingen betydelig leksjonen eller celle aktivering ble oppdaget i podet fartøyer (Figur 3).
Figur 1 : Ermet teknikk. Abdominal aorta ble transplantert ved hjelp av ermet teknikk. I denne fremgangsmåten ble donor aorta plassert i orthotopic posisjon med overfladiske biter i fôring fartøyet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Intraoperativ og ultralyd bildene. Eksempler på intraoperativ (obduksjon) visningen av graftene 6 uker etter transplantasjon (A), tredimensjonal ultralyd (B) og B-modus-visning (C). Postoperative oppfølging ble utført ved hjelp av ultralyd. Bildene viser patency av graft med ingen endring i lumen dimensjoner. I tillegg, ble ingen stenoses eller aneurisme formasjoner observert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Histologiske og immunohistochemistry bilder. Histologiske og immunohistochemistry representant bilder av transplantert dyrene på 6 uker etter transplantasjon. Ingen betydelige lesjoner ble observert i transplantert aortas av histology (Hematoxylin og eosin, han, 100 X forstørrelse, skala bar = 50 µm), immunohistochemical flekker (glatt muskel begrepsordbok SMA (rød) eller Macrophage MAC2 (grønn), 200 X forstørrelse, skala bar = 25 µm). Kjerner var mot farget av DAPI (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Før denne studien var ulike andre transplantasjon modeller i mus grundig analysert3,,6,,7,,10,,13,,14. Modell av aorta transplantasjon bruke ermet teknikken med modifikasjoner av Dambrin et al. ble valgt som det passer våre kriterier og viste en høy pålitelighet av ermet anastomose i forhold til konvensjonelle ende-til-ende Sutur metoder 1 , 10.
Denne teknikken er gunstig på mange måter med kryss-klemme tid betraktelig redusert minimere skader aorta under operasjonen. En lav forekomst av tromboser ble observert i tillegg til å unngå en potensiell feil i fartøyet kaliber mellom donor- og mottaker. Observasjonene ovenfor gjør denne teknikken velegnet for å undersøke vaskulær sykdom i aorta transplantasjoner hos mus.
I en oppfølgingsstudie der en ultralyd ble utført 8 uker etter transplantasjon, ble ingen vesentlige endringer oppdaget. Dette bekreftet forutsetninger at skade aorta under operasjonen vil være minimal1.
Pode prosedyren presenteres i denne artikkelen garanterer ingen verdifall både i pode integritet og dens funksjon. Derfor kan det konkluderes at denne eksperimentelle transplantasjon modellen kan tjene som et verdifullt verktøy for fremtidige molekylære og farmakologiske undersøkelser av degenerative fartøyet sykdom i genmodifiserte mus.
Vi tror at det video guiden kan fungere som undervisningsmateriell illustrerer bruken av denne enkle arterio-arteriell modellen og at det vil bidra til videre fruktbar debatt mange viktige saker i vaskulær patologi. Denne svært rask anastomose metoden kan brukes til å studere vaskulær sykdom i genmodifiserte mus. Det kan også brukes som en endring i aneurisme modellen kombinert med transplantasjon.
Det er kritiske punkter under prosedyren. Plassering av suture selv er det viktigste trinnet. Kirurgen må ta for å unngå eventuelle torsjon aortabuen ved riktig justering av giver og mottaker. Klemmer fjernes nøye etter inspeksjon av anastomose. Distale klemmen skal alltid være utgitt første resulterer i lavtrykk holder veggene sammen før proksimale høytrykks siden utgivelsen. Konsekvensen av ikke følge sekvensen av utgivelsen ville være blødning.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Roma Wieczorek og Peter Kurdybacha for deres utmerkede redigering assistanse og Leon Decker og Uli Heuter for deres utmerket kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halsey Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Dumont #5 Forceps - | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Lexer-Baby Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Castroviejo Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vannas Scissors | Aesculap, Germany | Typ OC498R | |
| Castroviejo Suture Forceps | Geuder, Germany | 19015 | |
| 6-0 silk black (Silk) | Deknatel, Research Triangle Park NC, USA | 18020-60- FST | |
| 11-0 monofilament (Ethilon) | Ethicon, Norderstedt, Germany | EH7438G | |
| 3-0 polyglycolic acid suture (Serafit) | Serag-Wiessner, Naila, Germany | 60203214 | |
| Isofluorane | Any genericon | ||
| Heparin | Any genericon | ||
| 0.9% saline | Any genericon | ||
| Buprenorphine | Any genericon | ||
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | ||
| Microscop | Zeiss | Opmi MDO/S5 | |
| Vaporiser | Eickemeyer | TEC3 | |
| Ultrasound | Vevo, Canada | 770,2100 |
References
- Rowinska, Z., et al. Non- invasive in vivo analysis of a murine aortic graft using high resolution ultrasound microimaging. Eur J Radiol. 81 (2), 244-249 (2012).
- Daugherty, A. Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci. 323 (1), 3-10 (2002).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc .Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Zernecke, A., Shagdarsuren, E., Weber, C. Chemokines in atherosclerosis: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (11), 1897-1908 (2008).
- Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. J Surg Res. 111 (2), 171-176 (2003).
- Koulack, J., McAlister, V. C., Giacomantonio, C. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Development of a mouse aortic transplant model of chronic rejection. Microsurgery. 16 (2), 110-113 (1995).
- Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
- Baxter, K., Hao, P. M., Howden, B. O., Saunder, A., Jablonski, P. Modified technique of abdominal heart transplantation in the rat. J Heart Lung Transplant. 17 (11), 1057-1064 (1998).
- Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 946-951 (1999).
- Siemionow, M. Histopathology of microarterial anastomoses: end-to-end versus end-in-end (sleeve) technique. J Hand Surg Am. 15, 619-625 (1990).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354 (6), 610-621 (2006).
- Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18 (6), 368-371 (1998).
- Guo, L., Agarwal, A., George, J. F. Orthotopic aortic transplantation in mice for the study of vascular disease. J Vis Exp. (69), e4338 (2012).
