En optimerad protokoll för att analysera Glycolysis och mitokondrie respiration i lymfocyter

Abstract

Lymfocyter svara på en mängd olika stimuli genom att aktivera intracellulära signalvägar, vilket i sin tur leder till snabb cellulär proliferation, migration och differentiering, och cytokin produktion. Alla dessa händelser är tätt kopplade till energistatus av cellen, och därför att studera de energiproducerande reaktionsvägar kan ge ledtrådar om den totala funktionaliteten hos dessa celler. Den extracellulära flödesmätare är ett vanligt förekommande anordning för utvärdering av glykolys och mitokondriell andning i många celltyper. Detta system har använts för att studera immunceller i några publicerade rapporter, men ändå en omfattande protokoll speciellt optimerad för lymfocyter saknas. Lymfocyter är ömtåliga celler som överlever dåligt i ex vivo-betingelser. Ofta lymfocytundergrupper är sällsynta, och arbetar med låga cellantal är oundviklig. Således är en experimentell strategi som inriktar sig på dessa problem krävs. Här ger vi ett protokollsom möjliggör snabb isolering av livskraftiga lymfocyter från lymfvävnad, och för analys av deras metaboliska tillstånd i den extracellulära flödes analysatorn. Dessutom ger vi resultaten av experiment där metaboliska aktiviteter flera lymfocyt subtyper vid olika celldensiteter jämfördes. Dessa observationer antyder att våra protokoll kan användas för att uppnå konsekvent, väl standardiserade resultat även vid låga cellkoncentrationer och sålunda kan den ha breda tillämpningar i framtida studier som fokuserar på karakterisering av metaboliska händelser i immunceller.

Introduction

Immunsvaret mot antigen är en hårt reglerad balans mellan immunaktivering och immunsuppression. Immunaktivering driver snabb cellproliferation och migration, såväl som cytokinproduktion, antikroppsutsöndring och ökad fagocytos som svar på den stimulerande, medan immunsuppression inhiberar helt enkelt dessa händelser och är därför viktig för att förhindra onödiga immunresponser ^1-6. Nyligen genomförda studier har visat att en direkt koppling mellan aktiveringsstatus av immunceller och aktiviteten hos olika metaboliska vägar ^7. Immunceller kan växla mellan vilande och aktiverade tillstånd genom att byta energiproducerande banor på och av. Vidare har det visat sig att olika immuncelltyper kan använda olika metaboliska strategier för att driva sina ökade energibehovet under aktiveringen. Till exempel, medan aktivering av T-lymfocyter leder celler till en nästan helt glykolytiska state ⁸ 9,10. Dessa studier pekar på vikten av att undersöka effekterna av immuncellsaktivering på cellulär metabolism.

Realtid samtidiga mätningar av syreförbrukning (OCR) och extracellulära försurning hastighet (ECAR), som indikatorer på oxidativ fosforylering och glykolysen är en gemensam strategi för att ta itu med de stater i energiproducerande banor ^11-13. För att uppnå detta, en extracellulär flux analysator, såsom Seahorse XF 96, som rutinmässigt används. Ett sådant instrument kan snabbt jämföra förändringar i OCR och ECAR över celltyper eller på olika stimuleringsförhållanden. Hittills, olika celltyper, inkluderande immunceller, varit har studerats med hjälp av dessa enheter. Emellertid är inte tillgängligt ett optimerat protokoll speciellt avsedd för immunceller.

Immunceller, i synnerhet lymfocyter, skiljer sig från othennes celltyper i flera kritiska sätt. Lymfocyter är ömtåliga celler som inte överlever för långa löptider i ex vivo förhållanden ^14-16. Detta är en ännu större problem när de odlas i suboptimalt tillväxtmedier som saknar essentiella näringsämnen, såsom de som används i extracellulära flödesanalys. Till skillnad från makrofager och många cellinjer, inte lymfocyter inte följer plastytor; Därför är det viktigt att fästa dem till analysplattan utan att generera stress. Slutligen kan vissa lymfocytsubpopulationer vara extremt sällsynt och skörda dem vid de erforderliga, optimala mängder kan vara utmanande ^17-19.

Här ger vi en optimerad protokoll som är särskilt utvecklad för lymfocyter. Använda splenocyter, B-lymfocyter och naiva CD4 ⁺ T-lymfocyter isolerade från musmjälte och lymfkörtlar ^20, visar vi egenskaperna hos deras vilotillstånd glykolys och oxidativ fosforylering vid skillt celltätheter. Data normaliserades för att ta hänsyn till skillnaderna i de initiala cellantalet för varje brunn genom mätning av slutanalys cellysat proteinkoncentrationer, som var direkt proportionell mot antalet celler. Vår protokoll ger inte bara riktlinjer för snabb isolering av livskraftiga lymfocyter för extracellulära flödesanalyser, men det gör det också möjligt för att arbeta vid suboptimala cellkoncentrationer utan att kompromissa med kvaliteten på uppgifterna.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med LIG-4 djur protokollet, som godkändes av NIAID Animal Care och användning kommittén.

1. Beredning av reagenser

1. Förbereda magnetisk separation (MS) buffert: PBS (pH 7,2) kompletterad med 0,5% BSA och 2 mM EDTA eller automatisk separation lösning kompletterad med 0,5% BSA. Sterilt filter (0,22 pm) och förvara vid 2-8 ° C.
2. Förbereda RF10 medium: RPMI 1640-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 50 U / ml penicillin, 50 | iM streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 50 pM 2 merkaptoetanol, 10 mM HEPES. Använd sterila reagens. Sterilt filter och förvara vid 2-8 ° C.
3. Förbereda mitokondriell stresstest medium: XF basmedium kompletterat med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin och 25 mM glukos.
4. Förbered glykolysen stresstest medium: XF basmediet supplemented med 2 mM L-glutamin.
5. Justera pH i både det mitokondriella och glykolys stresstest media till 7,4 sterilt filter och förvara vid 2-8 ° C. Varma media till 37 ° C och justera pH före användning (genomföra pH-mätningar vid 37 ° C).
   OBS: Om du använder XF medium, som saknar bikarbonat, är kritisk. Sedan atmosfären i den extracellulära flödes analysatorn innehåller endast omgivande _CO2 varje bikarbonat i mediet, vid bindning till protoner som frigörs som en biprodukt av glykolys, kommer dissociera för att bilda _CO2 och vatten. _CO2 kommer degas under försöket, som orsakar drift i pH som skulle dölja glykolytiska försurning signalen.
6. Förbered oligomycinkänslig: Förbered 10 mM stamlösning i DMSO; lagra vid -20 ° C.
7. Förbered 2,4-DNP: Bered en M stamlösning i DMSO; lagra vid -20 ° C.
8. Förbered antimycin A: Förbered 10 mM stamlösning i DMSO; lagra vid -20 ° C.
9. Förbered rotenon: Förbered 10 mM stock lösning i DMSO; lagra vid -20 ° C.
10. Förbered glukos: Lös glukos i glykolysen stresstest medium för att bilda en 250 mM lösning; förbereda färsk före varje experiment och inte frysa.
11. Förbered två-DG: Lös solid 2-DG i glykolysen stresstest medium för att bilda en 500 mM lösning; förbereda färsk före varje experiment och inte frysa.

2. Skörd mjälte och lymfkörtlar från möss

1. Euthanize musen genom CO ₂ kvävning följt av halsdislokation.
2. Spraya musen med 70% etanol.
3. För efterföljande T-cellisolering, skörda mjälten, ytliga livmoderhalscancer, ytlig / djup armhålan, underkäken, inguinal, och kröslymfknutor.
4. För efterföljande B-cell isolering, skörd endast mjälten.
   OBS: Använd en biosäkerhet skåp och hålla skördade organ i PBS eller RF10 media på is tills behandling. Använd sterila labb och steril teknik för all bearbetning och isolation steg. Håll alla buffertar och medier på is för att öka isoleringen effektiviteten och minska celldöd.

3. Vävnadsbearbetning

1. Placera en 70 | im cellfilter över en 50 ml koniskt rör och överför organen på silen. För T-cell isolering, kombinera alla organ och för B-cellisolerings överföring endast mjälten.
2. Med hjälp av kolven från en steril 3 ml spruta, mosa vävnaden genom silen. Under mosa, se till att filtret och organen är fuktig vid alla tidpunkter och fukta dem vid behov genom att tillsätta MS buffert. Detta kommer att både hålla cellviabilitet hög och förhindra igensättning av filtret.
3. Efter mosa, tillämpa 5-10 ml MS buffert till filtret för att öka cellåtervinning. Centrifugera suspensionen vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C. (Utför alla ytterligare centrifuge under dessa förhållanden, om inte annat anges).
4. Häll vätskan och suspendera pelleten i 5 ml ACK röda blodkroppar lysbuffert. Incubate under 5 minuter på is för att lysera röda blodkroppar (röda blodkroppar måste avlägsnas eftersom de interfererar med magnetisk separering). Lägg 10-20 ml MS buffert och centrifugera.
5. Placera en 30 ìm cell filter över en 15 ml koniska rör och fyll den med en ml MS-buffert (denna filtrering tar bort skräp från erytrocytlys). Häll vätskan från centrifugerade röret, suspendera pelleten i 5 ml MS buffert och passerar den genom filtret. Tvätta första röret med 4 ml MS buffert för att öka cellåtervinning, och använda detta för att skölja filtret.
6. Med användning av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare, fastställa det totala antalet celler. Detta mobilnummer kommer att användas för att bestämma mängden av magnetiska separationsreagens som krävs i avsnitt 4. Om splenocyter ska användas i den efterföljande extracellulära flödesanalys, upphäva lämpligt antal celler vid denna tidpunkt.
7. Centrifugera suspensionen och vidare till magnetisk separation. Resuspendera splenocyter används inteför B-cellsisolering i 5 ml RF10 och hålla på is tills den extracellulära flödesanalysen.

4. Magnetisk separation av B-celler och naiva CD4 ⁺ T-celler

1. Fastställa nödvändiga volymerna av biotin-antikropp cocktail, anti-biotin mikropärlor, och MS-buffert. Använd följande volymer för 10 ⁸ celler som en guide och skala upp eller ner efter behov.
   OBS: Inkubera proverna i ett kylskåp i stället för på is sedan inkubation på is kan minska antikroppsbindning effektivitet och längre inkubationstider kan krävas.

Reagens för naiva CD4 + T-cellseparation	Volym 10 8 celler
	(skala lämpligt)
Biotin-antikroppscocktail	100 ^
MS buffert för första inkubation	400 ^
Anti-biotin mikropärlor	200 ^
CD44-mikropärlor	100 ^
MS buffert för andra inkubation	200 ^
Inkubera biotin-antikropp-cocktail och celler vid 4 ° C under 5 min. Lägg anti-biotin mikropärlor, CD44-mikropärlor, MS buffert och inkubera vid 4 ° C under 15 min.

Tabell 1: T-cellisoleringsvolymerna och instruktioner.

Reagenser för B-cellseparation	Volym 10 8 celler
	(skala lämpligt)
Biotin-antikroppscocktail 100 ^
MS buffert för första inkubation	400 ^
Anti-biotin mikropärlor	200 ^
MS buffert för andra inkubation	300 pl
Inkubera biotin-antikropp-cocktail och celler vid 4 ° C under 15 min. Tillsätt en lämplig volym av biotin-antikroppscocktail och MS-buffert, och inkubera blandningen vid 4 ° C under 15 min. Tillsätt en lämplig mängd av anti-biotin mikropärlor och MS buffert och inkubera blandningen vid 4 ° C under 15 minuter. Efter den andra inkubationen, fylla röret med MS-buffert och centrifugera.

Tabell 2: B-cellsisoleringsvolymer och instruktioner.

2. Återsuspendera pelleten i MS-buffert: 500 | j, l för manuell separation, 3-4 ml för automatisk separation.
3. Fortsätt med antingen manuella eller automatiska separationersom följer:
   1. Manuell separation:
      1. Sätt en LS kolumn i separationsmagneten, placera en steril 15 ml koniskt rör nedan för att samla flödet genom, och prime kolonnen genom tvättning med 3 ml MS-buffert. Kassera flödet genom.
      2. Överför cellsuspensionen till den grundade LS kolumnen och göra det möjligt att passera igenom; tvätta röret används under inkubation med 3 ml MS buffert och passerar detta genom kolonnen också. Eluatet kommer att innehålla de renade cellerna. För B-cell isolering, passerar de renade cellerna genom kolonnen en andra gång i en ny 15 ml tub, och upprepa tvättningssteget. Detta kommer att öka renhet och utbyte.
   2. Automatiserad Separation:
      1. Slå på den automatiska separatorn och kontrollera nivåerna av körningsbuffert, sköljning lösning och 70% etanol. Se till att avfallet är tom innan separationen.
      2. Välj lämplig kylda rack beroende på rörets storlek tHan orenade prov (t.ex. 15 ml). För att hålla cellerna livskraftiga under separationsprocessen, använder ställningar som tidigare har kylda vid 2-8 ° C under 3-4 timmar, eller tills kylmediet blir fast.
      3. Montera kylda rack på provstadiet hos den automatiska separatorn.
      4. Placera provröret i kortplats A1, ett rör för den negativa fraktionen i slitsen B1, och ett rör för den positiva fraktionen i C1. Om att samla mer än ett prov, placera ytterligare rör i nästa kolumn (A2, B2, C2, etc.).
      5. Välj fliken separation på pekskärmen, och anger arrangemanget av rören på hyllan. Från separations menyn, välj "utarmar" program och avsluta programmet cykeln med lämplig typ av tvätt (se nedan).
         OBS! "Utarmar" program genomför utarmning använder maskinen mest känsliga läge som prioriterar renhet. Dessutom finns tre olika tvättalternativ: quick skölj, skölj och sömn. Om proverna är från samma källa och skall kombineras väljer snabb sköljning. Om proverna skall hållas åtskilda, välj sköljning. Välj sömn alternativet om inga ytterligare isoleringar kommer att genomföras den dagen och om maskinen stängs av efter isolering
      6. Starta isolering genom att trycka på "Run" och bekräfta buffertnivåer när det efterfrågas. När programmet har avslutats, kommer den negativa fraktionen innehålla renade celler.
   3. Fyll koniska röret upp till 15 ml med MS buffert och centrifugera.
   4. Häll av MS buffert och återsuspendera cellerna i 5 ml RF10 media. Håll celler på is tills den extracellulära flödesanalysen.
      OBS: I idealfallet bör den extracellulära flux assay utföras omedelbart efter isolering. Men i preliminära experiment inga signifikanta skillnader i analysresultaten observerades i celler som används inom 3 h av isolering kontra färska isolerade sådana.

OBS: det protokoll som beskrivs här är för 96-brunnsformatet av instrumentet. Volymerna kommer att behöva justeras, om ett annat format används.

1. Hydrering av sensorhuvudet
   1. Lyft upp sensorhuvudet, fyll varje brunn av verktyget plattan med 200 ul av kalibreringslösning och sänka sensorhuvudet på verktyget plattan, dränka sensorerna i kalibreringslösningen.
      OBS: Kontrollera att kalibreringslösningen nivån är tillräckligt hög för att hålla sensorerna nedsänkta. Patronen hamnar fluoroforer associerade till O ₂ och H ⁺ för varje brunn; dessa måste hydrerad för att de ska fungera korrekt.
   2. Placera kassetten i en 37 ° C inkubator inte kompletterad med _CO2 eller syre / kväve. Utför alla ytterligare inkubationer under dessa förhållanden, om inte annat anges. Inkubera patronen över natten för att hydratisera.
2. preparation av bindemedelsbelagda Plates
   1. Förbereda 2,5 ml av en 22,4 | j, g / ml lim lösning i 0,1 M natriumbikarbonat, pH 8,0 (vätekarbonat ger det optimala pH för adhesiv adsorption).
   2. Applicera 25 | il av lösningen till varje brunn i analysplattan och inkubera på bänken vid rumstemperatur under 20 min.
   3. Aspirera lim och tvätta varje brunn två gånger med 200 ul sterilt vatten. Vänta tills brunnarna är torra innan sådd cellerna.
3. Sådd Celler i bindemedelsbelagda Plates
   1. Centrifugera cellerna vid rumstemperatur vid 200 xg under 5 min. Resuspendera cellerna i 5 ml av den lämpliga analysmedium (se ovan för beredning av mitokondriell stress och glukos påkänning media). Centrifugera cellerna igen och återsuspendera vid den önskade koncentrationen i analysmedium (resuspension volym varierar beroende på koncentration, varje brunn innehåller 180 pl cellsuspension).
      OBS: Så länge som de lämpliga analysmedier och förenings används, den extracellulära flödes analysatorn kan samtidigt köra mitokondriella och glykolys stresstester på samma platta.
   2. Platta 180 l cellsuspension i varje brunn. Använd brunnar A1, A12, H1, och H12 för bakgrundstemperaturkorrigering: lägg 180 pl analysmedium i dessa brunnar (inga celler).
   3. Inkubera plattorna under 25 min vid 37 ° C.
   4. Centrifugera plattan vid 200 xg under 5 min med ingen broms för att säkerställa att alla celler är helt har fäst. bekräftar visuellt att cellerna är stabilt vidhäftad till odlingsytan, som bildar ett monoskikt, genom att titta i mikroskopet. Överföra plattorna tillbaka till inkubatorn i ytterligare 30 min.
4. Framställning av 10x koncentrationer av föreningar, och lastning av Injector Ports
   1. För den mitokondriella stresstest, förbereda 2,5 ml vardera av 10 | iM oligomycin, 1 mM DNP, och en blandning av 10 pM rotenon och 10 pM antimycin A, alla i mitokondriell spänningsanalys medium.
      OBS: Koncentrationen av 2,4-DNP är baserat på tidigare publicerade studier; ²¹ detta är en allmän riktlinje men koncentrationen av kopplare för varje celltyp som används bör bestämmas av forskaren.
   2. För glykolysen stresstestet, förbereda 2,5 ml vardera av 250 mM glukos, 10 | iM oligomycinkänslig, och 500 mM 2-deoxiglukos (2-DG) i glykolysen spänningsanalysmediet.
   3. Varma 10x lösningar till 37 ° C och justera pH till 7,4.
   4. Ladda föreningarna i lämpliga injektor hamnar i kassetten med hjälp av en flerkanalig mikropipett och lastningslinjer, enligt följande:

      Hamn	Mitokondriell Stress Assay	Glykolys Stress Assay
      en	20 pl oligomycinkänslig	20 pl glukos
      B	22 | j, l 2,4-DNP	22 | il oligomycin
      C	25 | j, l antimycin A / rotenon	25 pl 2-DG

      Tabell 3: Sammansatta volymer.
      
      OBS: Varje serie portar (t.ex. alla portar A) måste innehålla samma volym. Det är viktigt att alla brunnar i en viss serie är laddade, även dem som inte används i försöket, annars föreningarna inte kommer att injiceras (hamnar i oanvända brunnar kan laddas med samma volym av analysmedium).
   5. Inkubera patronen när du installerar programmet.
5. Konfigurera Extracellulär Flux analysprotokoll
   1. Ställ in följande program (tabell 4).

      Steg	Slinga	Kalibrering	-
      ekvilibrering	-
      baslinjevärdena	3 gånger: Blanda 3 minuter, vänta 0 min, åtgärd 3 min
      end loop	-
      Injicera Port A	-
      mätningar	3 gånger: Blanda 3 minuter, vänta 0 min, åtgärd 3 min
      end loop	-
      Injicera Port B	-
      mätningar	3 gånger: Blanda 3 minuter, vänta 0 min, åtgärd 3 min
      end loop	-
      Injicera Port C	-
      mätningar	3 gånger: Blanda 3 minuter, vänta 0 min, measure 3 min
      end loop	-
      programslut	-

      Tabell 4: Program layout.
      OBS: Under vissa omständigheter, till exempel vid användning av aktiverade celler, försurning kan fortsätta under längre tid än i naiva celler. Av denna anledning kan det vara nödvändigt att förlänga de "WAIT" gånger i ovanstående program eller upprepa varje mätcykel fler gånger.
   2. Påbörja programmet. Efter kalibreringssteget, byt ut kalibreringsplattan för analysplattan (när det efterfrågas).
      OBS: Med hjälp av programvaran, är det möjligt att ange grupper av brunnar som har liknande förhållanden. Dessutom är det viktigt att ange vilka brunnar är kontrollbrunnarna (i detta protokoll, är de fyra hörnen på plattan) och ange vilka brunnar är tomma. För en mer detaljerad steg-för-steg, protokoll för att ställa in maskinen och detmjukvaru bör tillverkarens webbplats höras.
6. Mätning Proteininnehåll
   1. Ta bort resterande analysmediet från varje brunn utan att störa cellerna.
      OBS: Om det inte är praktiskt att gå vidare med analysproteinkoncentrationen, är det möjligt att frysa hela plattan vid -20 ° C fram till analys. Om fryst, tina innan du fortsätter.
   2. Bered en 1x lösning av proteasinhibitorer (100x stock) i RIPA lys-medium (tillräckligt för 50 | j, l / brunn).
   3. Tillsätt 50 | il RIPA lys-medium kompletterat med proteashämmare till varje brunn. Agitera plattan på en skakapparat under 5 min, och sedan inkubera plattan på is under 30 min för att fullständigt lysera celler.
   4. Snurra plattan vid 200 xg under 5 min vid rumstemperatur för att ge lipider och andra molekyler till botten av plattan så att de inte interfererar med bicinkoninsyra (BCA) -analys.
   5. Mät proteinkoncentration av BCA-analys enligt tillverkarens &# 39; s rekommendationer.

Representative Results

Eukaryota celler använder ett integrerat nätverk av glykolys, till trikarboxylsyra (TCA) cykel och oxidativ fosforylering möta de flesta av sina energibehov och att ge mellan krävs för celltillväxt och proliferation. Dessa vägar börja med den intracellulära infångning av fri glukos i form av glukos-6-fosfat, som därefter blir bearbetas till pyruvat. Pyruvat är antingen reducerad till laktat eller transporteras in i mitokondrierna, där den bildar acetyl koenzym A (CoA). Acetyl-CoA inträder sedan i TCA-cykeln. Hög energi mellanprodukter av TCA-cykeln framdriva förflyttningen av elektroner i elektrontransportkedjan (ETC), som i sin tur driver ut H ⁺ från den mitokondriella matrisen för att alstra en H ⁺ gradient över det inre mitokondriemembranet. Syre fungerar som den slutliga elektronmottagare, och H ⁺ återvända tillbaka till den mitokondriella matrisen genom F _O / F <sub> en komplex, där deras potentiella energi används för att generera ATP (Figur 1A).

Funktionsprincipen av den extracellulära flödesanalysen beror på att störa glykolys och oxidativ fosforylering på specifika punkter, och bedöma de resulterande effekter. För detta ändamål använde vi glukos för att propagera glykolysen i svultna celler och 2-deoxiglukos (2-DG), som omvandlas till 2-deoxiglukos-6-fosfat, en kompetitiv hämmare av phosphoglucoisomerase ^23, av hexokinas, för att blockera glykolys. Rotenon (en komplex I-specifik hämmare av ETC), antimycin A (en komplex III-specifik hämmare av ETC), oligomycinkänslig (hämmare av ATP-syntas ^24), och frånkoppling agent 2,4-dinotrophenol (DNP) ²⁵ var utnyttjas för att ingripa specifika händelser i samband med elektrontransport, proton gradient och ATP-syntes (Figur 1A). I stället för 2,4-DNP, karbonyl cyanide-4- (trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP) kan också användas, men ytterligare optimering kan krävas. I båda fallen bör uncouplers alltid titreras för en specifik celltyp före användning för att bestämma den optimala koncentration som är nödvändig.

Glykolysen stresstest (Figur 1B) börjar med en baslinje mätning av den extracellulära försurning hastigheten (ECAR) i de tidigare svultna celler. Eftersom dessa celler är som basala minimum, och kan därför i praktiken anses vara icke-glykolytiska är ECAR mäts vid denna tidpunkt kallat icke-glykolytiska försurning. Denna försurning sannolikt motsvarar andnings _CO2 genereras i TCA-cykeln omvandlas till _HCO3 ^- och H ^+. Detta följs av insprutning av glukos för att aktivera glykolys, som presenterar som en ökning av den extracellulära försurning på grund av bildandet av laktat.Ökningen motsvarar den normala glykolys. Cellerna stryks sedan utmanas med injektionen av oligomycin, som blockerar alstringen av ATP genom oxidativ fosforylering. Celler svarar på denna dramatiska minskning av ATP-produktion genom att aktivera glykolys till sin högsta nivå, och som resulterar i en sekundär ökning av ECAR nivå (glykolytiska reserv). Testet avslutas genom total hämning av glykolys använder glukos analoga 2-DG, som returnerar ECAR till dess icke-glykolytiska nivå. Intressant nog har det föreslagits att, i motsats till tillverkarens rekommendationer, maximal glykolys inte nödvändigtvis uppnås genom injektion av oligomycinkänslig ^26. I celler med en hög glykolytiska kapacitet, om det inte finns en betydande ökning av ATP efterfrågan kan glykolys vara helt klara med förlusten av mitokondriell ATP utan att det behöver vara uppreglerat. Den glykolytiska takt med oligomycinkänslig kan överträffas genom att tillsätta andnings hämmareSåsom rotenon och myxothiazol, som ger några fördelar över oligomycinkänslig: 1) De ökar ATP efterfrågan, eftersom de orsakar återföring av ATP-syntas, med ATP-hydrolys, att pumpa protoner i ett försök att återvinna den mitokondriella membranpotential ^26; 2) De förhindrar respiratorisk surgörning av mediet, vilket kan förvirra de ECAR resultat (se nedan). Andra sätt att öka ATP efterfrågan innefatta tillsats av föreningar som stimulerar hydrolys av ATP genom plasmamembranet ATPaser ^26. Allt detta bör övervägas noga av forskare vid planering av en glykolys stresstest.

Den mitokondriella stresstest (Figur 1C) börjar med en baslinje mätning av syreförbrukningshastigheten (OCR) i icke-svalt celler. Detta följs av insprutning av oligomycin, som hämmar återlämnande av protoner genom F _O / F _ett komplex och därmed snabbt hyperpolarizes mitokondriemembranet. Hyperpolarisation förhindrar ytterligare proton pumpning genom komplex andnings och andningsfrekvensen minskar. Den återstående andning kallas proton läcka, som representerar flödet av protoner genom lipider eller andra kanaler. Denna hyperpolariserade tillstånd snabbt reverseras genom tillsatsen av det frikopplande medlet 2,4-DNP, som fungerar som en proton jonofor. Som svar, celler försöka återställa membranpotentialen i ett fruktlöst försök genom att öka transporthastigheten elektron till sitt maximum, och detta i sin tur ökar OCR. Slutligen, med tillägg av två ETC-hämmare (antimycin A och rotenon), mitokondrie andning helt stannar och OCR minskar till sin lägsta nivå. På denna nivå är syreförbrukningen inte beror på mitokondriell aktivitet (icke-mitokondriell). Skillnaden i OCR som genereras av dessa inhibitorer kallas högsta mitokondriell andning, som är summan av baslinjen andning och den reservkapacitet.

B och T-cells isoleringar ger mycket livskraftiga rena lymfocytpopulationer.

B-celler och naiva CD4 ⁺ T-celler isolerades som beskrivs i avsnitt 4 i protokollet, och splenocyter helt enkelt erhållas genom att lysera röda blodkroppar som beskrivs i avsnitt 3.3.

Känsligheten hos cell typspecifika metaboliska analyser beror på livsdugligheten och renheten hos utgångscellpopulationen. Därför, för att verifiera viabiliteten hos de isolerade mus-T-celler, splenocyter, och B-celler, och renheten av T- och B-celler, tillsattes små alikvoter av celler färgades för flödescytometrisk analys (Figur 2). I framåtspridning området mot sidospridning området (FSC-A mot SSC-A) plot, lymfocyter gated, och inom denna grind befolkningen längs diagonalen i Forward Scatter-Height (FSC-H) mot FSC-A plot bestämdes som sing. Inom singpopulationen, var viabilitet mäts genom slussning av celler som färgades negativa för den levande / döda markör (figur 2A); T-cell-livsduglighet var 97,9%, splenocyt viabilitet var 92% och B cellviabiliteten var 94%. B-cell-renhet, mätt med B220 ⁺ CD19 ⁺ populationen ^26, var 99%, medan CD4 ⁺ T-cell renhet, mätt med CD44 ^- CD4 ⁺ -populationen ^27, var 98,3% (Figur 2B).

Proteinkoncentration av cellysatet kan användas som en direkt indikator av pläterad cellantal.

Isolerade lymfocyter och splenocyter ströks ut i en klisterbelagda 96-brunnars analysplatta vid 5 x 10 ⁵ celler / brunn, 2,5 x 10 ⁵ celler / brunn, 1,25 x 10 ⁵ celler / brunn, och 0,625 x 10 (figur 3A). Som väntat, sammanflödet korreleras med de inledande plätering densitet. Vid fullbordande av den extracellulära flux assay, ströks cellerna lyseras och deras proteinkoncentrationer kvantifierades med användning av BCA-analys. För alla celltyper, var lysat proteinkoncentrationer visat sig vara linjärt korrelerad med de inledande plätering densitet (figur 3B), vilket bekräftar att lysat proteinkoncentrationer kan användas som ett exakt mått för normalisering av cellantal vid tolkningen av extracellulära flödesdata. Pläteringsförhållandena tätheter som används i detta experiment har optimerats för naiva, ostimulerade lymfocyter. Om stimulerade eller tidigare odlade celler ska användas, kan ytterligare optimering krävas.

Mitokondriell och glykolytiska stress analyser är beroende av pläterade mobilnummer.

OCR mättes för varje celltyp och plätering densitet i den extracellulära flödes analysatorn. Som väntat, högre cellantal har en högre uppmätt OCR, liksom mer dramatiska reaktioner på oligomycin, 2,4-DNP, och antimycin A / rotenon (Figur 4A). Standardisera OCR mätningar till varje provs proteinkoncentration avslöjar att i allmänhet ett större antal celler leda till mer noggranna OCR mätningar. Plätering på 5 och 2,5 x 10 ⁵ celler / brunn resulterade i liknande normaliserade OCR mätningar i T-celler och splenocyter, och 5 och 1,25 x 10 ⁵ celler / brunn gav liknande normaliserade OCR mätningar i B-celler (Figur 4B). De små skillnader i den normaliserade B-cells OCR mätningar kan vara en indirekt indikation på att B-celler presterar bättre på 2,5 x 10 ⁵ celler / brunn jämfört med andra celldensiteter. Av alla åtgärder, 0,625 x 10 ⁵ celler / brunn gav suboptimala resultat, vilket visar att detta plätering densitet är otillräcklig. Baslinje andning, proton läcka, maximal mitokondriell andning, icke-mitokondriell andning och ATP-produktion linjärt korrelerad med plating densiteter för alla celltyper (fig 4C). Dessutom, de flesta av baslinjen andning används mot syntetisering ATP, vilket indikeras av den låga proton läcka i de tre celltyper. Även om det primära fokus för den mitokondriella försöket är att mäta förändringar i OCR är ECAR fortfarande användbar för att spela in för att säkerställa att analysen genomfördes framgångsrikt. I likhet med OCR, de två högsta plätering täthet resulterade i högre ECAR och mer dramatiska reaktioner på oligomycinkänslig, 2,4-DNP, och antimycin A / rotenon (Figur 4D). De dramatiska förändringarna i ECAR vid tillsats av 2,4-DNP, och antimycin A / rotenon kan bero på förändringar i andningen i tillägg till förändringar i glycolysis, eftersom _CO2 genereras i TCA-cykeln omvandlas till _HCO3 ^- och H ^+. Denna fråga har nyligen upp, och det finns en enkel metod för att korrigera den totala extracellulära försurning signal med hjälp av syreförbrukningsdata, för att erhålla den verkliga glykolytiska takt ^12,29.

Glykolysen stressen analysen var mest framgångsrika på den högsta plätering densitet (figur 5A, B). I alla celltyper, de 5 x 10 ⁵ celler / brunn proven hade de största förändringarna i ECAR efter tillsatsen av glukos, oligomycin, och 2-DG (figur 5B). Dessutom, normalisera till proteinkoncentration visade att för alla celltyper, de 5 x 10 ⁵ celler / brunn prover gav optimala resultat, medan lägre koncentrationer-speciellt 0,625 x 10 ⁵ celler / väl inte visa en robust glykolytiska reservkapacitet. Icke-glycolytic försurning, glykolys, och skenbar glykolytiska kapacitet linjärt korrelerad med plätering densiteter för alla celltyper (figur 5C). För glykolys försöket visar OCR grafen att glukos stimulerar svagt mitokondriell andning, som sedan inhiberas av oligomycin behandling; tillsats av 2-DG inte påverka OCR (figur 5D). OCR grafen kan användas som en ytterligare indikation på att glykolysen försöket genomfördes framgångsrikt. Dessutom kan OCR grafen kan användas för att korrigera ECAR grafen, om så erfordras, såsom förklarats ovan i fallet med den mitokondriella stresstest ^12,29.

Figur 1:. Disposition av extracellulära flödesanalyser (A) Illustration av glykolys (vänster) och oxidativ fosforylering (höger) som visar verkan avmetaboliska läkemedel som används i de extracellulära flödesanalyser. (B) Schematisk bild av den extracellulära försurning hastigheten (ECAR) graf; schematisk bild av syreförbrukningshastigheten (OCR) kurva (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

. Figur 2: Stegvis gating av T-celler, B-celler, och splenocyter för att bestämma viabilitet och renhet Flödescytometri diagram som visar livskraften hos T-celler, splenocyter, och B-celler (A); och renhet av T- och B-celler (B). Resultaten är representativa för åtminstone tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av thär figur.

Figur 3:. Cell sammanflödet korrelerar med lysat protein koncentrationer av varje celltyp vid olika plätering densitet (A) Ljusmikrofotografier av celler i analysplattbrunnar vid plätering densiteter sträcker sig från 5 x 10 ⁵ celler / brunn till 0,625 x 10 ⁵ celler / väl. Skalstrecken anger 50 um. (B) lysat proteinkoncentrationer vid olika plating densiteter, mätt genom BCA-analys. Resultaten är representativa för åtminstone tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Mitokondriell spänningsanalys. Råmaterial (A) och standardiserad (B) OCR för varje celltyp och plätering densitet är visade. (C) cellantal beroende förändringar i nivåerna av baslinjen, maximal mitokondrie och icke-mitokondriella andning samt syreförbrukningen är kopplade till proton läcka eller ATP-produktion, visas för varje celltyper. (D) Rå ECAR värden som erhållits från de mitokondriella stresstesterna visas. Varje datapunkt representerar medelvärdet av 7-8 brunnar med standardavvikelse. Märkta pilar betecknar injektioner av oligomycinkänslig (O), 2,4-DNP (D), och rotenon / antimycin A (R / A). Resultaten är representativa för åtminstone tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

_upload / 54.918 / 54918fig5.jpg "/>
Figur 5:. Glykolytiska spänningsanalys Råmaterial (A) och standardiserad (B) ECAR för varje celltyp och plätering densitet är visade. (C) cellantal beroende förändringar i ECAR för icke-glykolytiska försurning, glukos-inducerad glykolys och total glykolytiska kapacitet visas. (D) Rå OCR värden som erhållits från de glykolytiska stresstesterna visas. Varje datapunkt representerar medelvärdet av 7-8 brunnar med standardavvikelse. Märkta pilar betecknar injektioner av glukos (G), oligomycin (O), och 2-deoxiglukos (2-DG). Resultaten är representativa för åtminstone tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det protokoll vi utvecklat tillåtet för effektiv isolering av ren och livsduglig lymfocytundergrupper, som därefter användes i extracellulär flux analys vid olika koncentrationer för att utvärdera skillnader i glykolys och mitokondrisk respiration prestanda. Detta protokoll är speciellt utformad för lymfocyter och tar upp de särskilda överväganden i samband med dessa celltyper, såsom låg basal metabolisk aktivitet, bräcklighet, låg frekvens, och deras oförmåga att följa analysplattor. Därför, jämfört med tidigare publicerade protokoll ^11,12, erbjuder vår metod en bekvämare och bättre optimerad guide för forskare som arbetar inom området för immunologi. Det finns flera viktiga steg i detta protokoll, inklusive att få rena och livsdugliga cellpopulationer, plätering cellerna vid optimal sammanflödet och standardisera extracellulära flödesmätningar analys till proteinkoncentrationen i varje brunn.

den initial antal celler pläterade kunde både visualiseras genom Ijusmikroskopi och även kvantifieras med hjälp av mätningar proteinkoncentration. Den linjära korrelationen mellan cellantal och proteinkoncentration bekräftades att proteinkoncentrationen i själva verket kan användas som ett sätt att standardisera effekterna av förändringar i cellantal mellan olika brunnar.

Genom att standardisera ECAR och OCR-resultatet till proteinkoncentrationer, visade vi att trots lägre cell sammanflödet, så få som 2,5 x 10 ⁵ celler / brunn skulle kunna användas i de flesta analyser utan att kompromissa med kvaliteten på uppgifterna. Emellertid den undre gränsen för celler som kan användas varierade mellan celltyper och analyser. Till exempel, medan så få som 1,25 x 10 ⁵ celler kunde användas för B-cells OCR mätningar, till och med 2,5 x 10 ⁵ celler / brunn var inte tillräckligt för att bedöma den glykolytiska prestanda av samma celltyp. Därför, så länge som cellantalet inte är en begränsande faktor, plätering på över90% konfluens, vilket ungefär motsvarar 5 x 10 ⁵ lymfocyter / brunn, är att föredra. Ytterligare optimering kan krävas när celler av olika storlekar-såsom tidigare aktiverad och delvis differentierade lymfocyter-används. Dessutom, när man använder tidigare odlade primära lymfocyter, kan det finnas en variation i cellviabilitet mellan olika behandlingsbetingelser, vilket skulle minska tillförlitligheten av proteinkoncentrationen som ett mått på cellantalet, eftersom döda eller döende celler kan också bidra till de uppmätta proteinnivåer . I sådana fall kan det vara bra att sortera levande celler genom flödescytometri innan utföra de extracellulära flödesanalyser.

I våra analyser med hjälp av nyligen isolerade och mycket livskraftiga lymfocytpopulationer, vi fått tillförlitliga funktionsdata för både OCR och ECAR mätningar. Medan alla celltyper betedde sig på liknande sätt i den mitokondriella stresstestet, var slående skillnader mellan celltyperobserveras i glykolysen stresstestet. Till exempel, var den glykolytiska prestanda naiva T-celler låga jämfört med splenocyter eller B-celler, och det inte förändras med tillsats av oligomycinkänslig. Denna observation är i linje med tidigare publicerade studier ^7,30, vilket bekräftar giltigheten av våra protokoll.

Sammanfattningsvis erbjuder vår metod ett effektivt och bekvämt sätt att testa den metaboliska aktiviteten av lymfocyter med användning av en extracellulär flux analysator, och det kan vara användbart i ett brett spektrum av immunologiska studier för att undersöka de metaboliska förändringar i immunceller vid aktivering, celldifferentiering eller på grund till sjukdoms fenotyper såsom infektion, autoimmunitet och hematologiska maligniteter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (pH 7.2)	Gibco-ThermoFisher	20012-050	To make MACS buffer
Bovine Serum Albumin BSA	Sigma-Aldrich	A3803	To make MACS buffer
0.5 M EDTA, pH 8	Quality Biological	10128-446	To make MACS buffer
autoMACS rinsing solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator.
RPMI-1640	Gibco-ThermoFisher	11875-093	Contains phenol red and L-glutamine
Fetal Bovine Serum	Gibco-ThermoFisher	10437-028	For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 °C until needed.
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)	Gibco-ThermoFisher	15140-122	Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media.
L-Glutamine 200 mM (L-Glut)	Gibco-ThermoFisher	25030-081	Component of RF10 and stress test media
Sodium pyruvate 100 mM	Gibco-ThermoFisher	11360-070	Component of RF10 and stress test media
HEPES 1 M	Gibco-ThermoFisher	15630-080	Component of RF10
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Gibco-ThermoFisher	11140-050	Component of RF10
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco-ThermoFisher	21985-023	Component of RF10
Falcon 70 μm cell strainer	Falcon-Fischer Scientific	87712	Used in cell isolation
Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip	Covidien	8881513934	Used in cell isolation
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes	Falcon-Fischer Scientific	14-959-53A	Used in cell isolation
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes	Falcon-Fischer Scientific	14-432-22	Used in cell isolation
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E	Used in cell isolation
CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed	Partec CellTrics	04-004-2326	Used in cell isolation
B Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-862	Used in cell isolation
Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-104-453	Used in cell isolation
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401	Used in cell isolation
MidiMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302	Magnet for separation
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	Holder for magnets
autoMACS Rinsing Solution		130-091-222	Rinsing solution for autoMACS Pro Separator
autoMACS Pro Separator Instrument	Miltenyi Biotec	N/A
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375-5G
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg).
Oligomycin	Sigma-Aldrich	75351
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)	Sigma-Aldrich	D198501
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Halt Protease Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	78429	Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis.
RIPA Buffer	Boston BioProducts	BP-115
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225	Follow manufacturer's instructions
Seahorse XFe96 FluxPak	Seahorse Bioscience	101085-004	Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Seahorse XF Base Medium	Seahorse Bioscience	102353-100	Used to prepare stress test media
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience
Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm	EMD Millipore-Fisher Scientific	SCGPU10RE	Used to sterile filter media.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	487031	Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak.