Abstract
Lymfocytter reagere på en række stimuli ved at aktivere intracellulære signalveje, hvilket igen fører til en hurtig cellulær proliferation, migration og differentiering, og cytokinproduktion. Alle disse begivenheder er tæt forbundet med den energi status af cellen, og derfor studere de energiproducerende pathways kan give fingerpeg om den overordnede funktionalitet af disse celler. Det ekstracellulære flux analysatoren er et almindeligt anvendt indretning til evaluering af effektiviteten af glykolyse og mitokondriel respiration i mange celletyper. Dette system er blevet anvendt til at undersøge immunceller i et par offentliggjorte rapporter, endnu en omfattende protokol optimeret specielt for lymfocytter mangler. Lymfocytter er skrøbelige celler, der overlever dårligt i ex vivo betingelser. Ofte lymfocytundergrupper er sjældne, og arbejde med lave celle tal er uundgåelig. Således er en eksperimentel strategi, der omhandler disse vanskeligheder påkrævet. Her giver vi en protokolder tillader hurtig isolering af levedygtige lymfocytter fra lymfevæv, og til analyse af deres metaboliske tilstande i det ekstracellulære flux analysator. Desuden giver vi resultaterne af eksperimenter, hvor de metaboliske aktiviteter af adskillige lymfocyt undertyper ved forskellige celledensiteter blev sammenlignet. Disse observationer antyder, at vores protokol kan anvendes til at opnå ensartede, well-standardiserede resultater selv ved lave cellekoncentrationer, og dermed kan det have brede applikationer i fremtidige undersøgelser, der fokuserer på karakteriseringen af metaboliske begivenheder i immunceller.
Introduction
Immunresponset mod antigener er en tæt reguleret balance mellem immunaktivering og immunsuppression. Immunaktivering drev hurtig celleproliferation og migration, samt cytokinproduktion, antistofsekretion og forøget fagocytose som reaktion på stimulerende, hvorimod immunsuppression blot inhiberer disse begivenheder, og derfor er det vigtigt at forebygge unødvendige immunresponser 1-6. Nylige undersøgelser har vist, at der foreligger en direkte forbindelse mellem aktiveringsstatus af immunceller og aktiviteten af forskellige metaboliske pathways 7. Immunceller kan skifte mellem hvile og aktiverede tilstande ved at skifte energiproducerende veje til og fra. Endvidere er det blevet observeret, at forskellige immune celletyper kan anvende forskellige metaboliske strategier til brændstof deres øgede energibehov under aktivering. For eksempel, mens aktivering af T-lymfocytter dirigerer celler til en næsten helt glycolytiske tilstand 8 9,10. Disse undersøgelser peger på vigtigheden af at undersøge effekterne af immun celle aktivering på cellulære stofskifte.
Real time, samtidige målinger af forbrug ilt sats (OCR) og ekstracellulær forsuring sats (ECAR), som indikatorer for oxidativ phosphorylering og glykolyse, er en fælles strategi til at løse de stater i energiproducerende veje 11-13. For at opnå dette, et ekstracellulært flux analysator, såsom Seahorse XF 96, anvendes rutinemæssigt. Et sådant instrument kan hurtigt sammenligne ændringer i OCR og ECAR tværs celletyper eller ved forskellige stimulation betingelser. Hidtil forskellige celletyper, herunder immunceller, er blevet studeret ved hjælp af disse enheder. Men en optimeret protokol specielt designet til immunceller er ikke tilgængelig.
Immunceller, især lymfocytter, forskellige fra othendes celletyper i flere kritiske måder. Lymfocytter er skrøbelige celler, der ikke overlever i lange varigheder i ex vivo-betingelser 14-16. Dette er et endnu større problem, når de dyrkes i suboptimal vækstmedium der mangler essentielle næringsstoffer, såsom dem, der anvendes i ekstracellulær flux analyse. I modsætning til makrofager og mange cellelinjer, behøver lymfocytter ikke klæbe til plastoverflader; derfor er det afgørende at vedhæfte dem til analysen pladen uden at generere stress. Endelig kan nogle lymfocytsubpopulationer være yderst sjældne og høste dem på de krævede, optimale mængder kan være udfordrende 17-19.
Her giver vi en optimeret protokol, der er specielt udviklet til lymfocytter. Brug splenocytter, B-lymfocytter og naive CD4 + T-lymfocytter isoleret fra mus milt og lymfeknuder 20, vi viser de særlige kendetegn ved deres hviletilstand glykolyse og oxidativ fosforylering på different celledensiteter. Data blev normaliseret til forklare forskellene i de indledende celleantal for hver brønd ved at måle udgangen assay cellelysat proteinkoncentrationer, som var direkte proportionalt med det celleantal. Vores protokol ikke kun giver retningslinjer for hurtig isolering af levedygtige lymfocytter til ekstracellulære flux assays, men det giver også mulighed for at arbejde på suboptimale cellekoncentrationer uden at forringe kvaliteten af data.
Protocol
Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med LIG-4 dyr protokol, der blev godkendt af NIAID Animal Care og brug Udvalg.
1. Fremstilling af reagenser
- Forbered magnetisk separation (MS) buffer: PBS (pH 7,2) suppleret med 0,5% BSA og 2 mM EDTA eller automatisk adskillelse opløsning suppleret med 0,5% BSA. Sterilfilter (0,22 um) og opbevares ved 2-8 ° C.
- Forbered RF10 medium: RPMI 1640-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 50 U / ml penicillin, 50 uM streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 50 pM 2 mercaptoethanol, 10 mM HEPES. Brug sterile reagenser. Sterilfilter og opbevares ved 2-8 ° C.
- Forbered mitokondriel stresstest medium: XF basis medium suppleret med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og 25 mM glucose.
- Forbered glykolyse stresstesten medium: XF base-medium supplemented med 2 mM L-glutamin.
- PH indstilles både det mitokondrielle og glycolyse stresstest medier til 7,4, sterilt filter og opbevares ved 2-8 ° C. Varm medier til 37 ° C og re-justere pH inden brug (udføre pH-målinger ved 37 ° C).
BEMÆRK: Brug af XF medium, som mangler bikarbonat, er kritisk. Da atmosfæren i det ekstracellulære flux analysator indeholder kun omgivende CO2, enhver bicarbonat i mediet, efter binding til protoner, der frigøres som et biprodukt af glycolyse, vil dissociere til dannelse CO2 og vand. CO 2 vil afgasse Under eksperimentet forårsager driver i pH, der ville sløre glycolytiske forsuring signal. - Forbered oligomycin: Forbered 10 mM stamopløsning i DMSO; opbevares ved -20 ° C.
- Forbered 2,4-DNP: Forbered en M stamopløsning i DMSO; opbevares ved -20 ° C.
- Forbered antimycin: Forbered 10 mM stamopløsning i DMSO; opbevares ved -20 ° C.
- Forbered rotenon: Forbered 10 mM stock løsning i DMSO; opbevares ved -20 ° C.
- Forbered glukose: Opløs glukose i glycolysen stresstest medium til dannelse af en 250 mM opløsning; forberede frisk før hvert forsøg og ikke fryse.
- Forbered 2-GD: Opløs solid 2-DG i glykolyse stresstest medium til dannelse af en 500 mM opløsning; forberede frisk før hvert forsøg og ikke fryse.
2. Høst Spleen og lymfeknuder fra mus
- Aflive musen ved CO 2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
- Spray mus med 70% ethanol.
- Til efterfølgende T-celle isolation, høste milten, overfladiske livmoderhalskræft, overfladisk / dyb aksillær, kæbelymfeknuderne, lyskebrok, lymfeknuder og mesenteriallymfeknuderne.
- Til efterfølgende B-celle-isolation, høst kun milten.
BEMÆRK: Brug en biosikkerhed kabinet og holde de høstede organer i PBS eller RF10 medier på is indtil forarbejdning. Brug sterile laboratorieudstyr og steril teknik til al behandling og isolation trin. Hold alle buffere og medier på is for at øge isolation effektiviteten og reducere celledød.
3. Tissue Behandling
- Placer en 70 um celle si over en 50 ml konisk rør og overføre organer på sien. For T celleisolering, kombinere alle organer og for B celleisolering overførsel kun milten.
- Brug af stemplet fra en steril 3 ml sprøjte, mash vævet gennem sien. Under mashing, sørge for, at filteret og organerne er fugtige på alle tidspunkter og våde dem efter behov ved at tilføje MS buffer. Dette vil både holde cellelevedygtighed høj og forhindre tilstopning af filteret.
- Efter mæskning, anvende 5-10 ml MS buffer til filteret for at øge celle opsving. Centrifugeres suspensionen ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C. (Udfør alle yderligere centrifugeringer under disse betingelser, medmindre andet er angivet).
- Væsken dekanteres, og pellet resuspenderes i 5 ml ACK røde blodlegemer lysisbuffer. INCUbate i 5 minutter på is for at lysere røde blodlegemer (røde blodlegemer skal fjernes, fordi de griber ind i magnetisk separation). Tilføj 10-20 ml MS buffer og centrifuge.
- Placer en 30 um celle filter over en 15 ml konisk rør og prime det med 1 ml MS buffer (denne filtrering fjerner snavs fra erythrocyt lysis). Væsken dekanteres fra centrifugerede rør, pellet resuspenderes i 5 ml MS buffer og før den gennem filteret. Vask den indledende rør med 4 ml MS buffer til at øge celle opsving, og bruge denne til at skylle filteret.
- Anvendelse af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller, bestemmes det samlede antal celler. Denne celle nummer vil blive anvendt til at bestemme mængden af magnetisk separation reagenser kræves i afsnit 4. Hvis splenocytter der skal anvendes i den efterfølgende ekstracellulære flux assay ophæves den passende antal celler på dette tidspunkt.
- Centrifuger suspensionen og gå videre til magnetisk separation. Resuspender splenocytter ikke anvendesfor B celleisolering i 5 ml RF10 og holde på is, indtil den ekstracellulære flux assay.
4. Magnetisk Adskillelse af B-celler og naive CD4 + T-celler
- Bestem de nødvendige mængder af biotin-antistof-cocktail, anti-biotin mikrokugler, og MS buffer. Brug følgende mængder for 10 8 celler som en guide og skalere op eller ned efter behov.
BEMÆRK: Inkuber prøver i et køleskab i stedet på is, siden inkubation på is kan reducere antistofbinding effektivitet og kan være påkrævet længere inkubationstider.
| Reagenser til naive CD4 + T-celle separation | Volumen 10 8 celler |
| (skalere passende) | |
| Biotin-antistof-cocktail | 100 pi |
| MS buffer for første inkubation | 400 pi |
| Anti-biotin mikrokugler | 200 pi |
| CD44 mikroperler | 100 pi |
| MS puffer til anden inkubation | 200 pi |
| Inkubér biotin-antistof-cocktail og celler ved 4 ° C i 5 min. Tilføj anti-biotin mikroperler, CD44 mikroperler, MS puffer og inkuberes ved 4 ° C i 15 min. | |
Tabel 1: T-celle isolation mængder og instruktioner.
| Reagenser til B-celle-adskillelse | Volumen 10 8 celler |
| (skalere passende) | |
| Biotin-antistof-cocktail 100 pi | |
| MS buffer for første inkubation | 400 pi |
| Anti-biotin mikrokugler | 200 pi |
| MS puffer til anden inkubation | 300 pi |
| Inkubér biotin-antistof-cocktail og celler ved 4 ° C i 15 min. Derpå tilsættes en passende mængde af biotin-antistof cocktail og MS-puffer, og inkuber blandingen ved 4 ° C i 15 min. Derpå tilsættes en passende mængde af anti-biotin mikroperler og MS-buffer og inkuber blandingen ved 4 ° C i 15 min. Efter den anden inkubation fylde røret med MS-puffer og centrifugeres. | |
Tabel 2: B-celle isolation mængder og instruktioner.
- Pellet resuspenderes i MS-puffer: 500 pi til manuel adskillelse, 3-4 ml til automatisk adskillelse.
- Fortsæt med enten manuelt eller automatisk separationersom følger:
- Manual Separation:
- Indsæt et LS kolonne i adskillelsen magnet, placere en steril 15 ml konisk rør nedenfor for at indsamle gennemstrømningen, og prime søjlen ved vask med 3 ml MS buffer. Kassér gennemstrømningen.
- Overfør cellesuspensionen til det primede LS-søjle og lade det passere gennem; vaske røret anvendes under inkubation med 3 ml MS-buffer og passerer denne gennem søjlen samt. Eluatet vil indeholde de oprensede celler. For B celleisolering, passerer de oprensede celler gennem søjlen en anden gang til et nyt 15 ml rør, og gentag vasketrinnet. Dette vil øge renhed og udbytte.
- Automatiseret Separation:
- Tænd for automatisk separator og kontrollere niveauet af løbebuffer, skylning opløsning og 70% ethanol. Sørg for, at affaldet er tom, før du starter adskillelsen.
- Vælg det relevante kølet rack afhængigt af røret størrelse than urenset prøve (fx 15 ml). For at holde cellerne levedygtige hele separationsproces bruge stativer, der tidligere er blevet kølet ved 2-8 ° C i 3-4 timer, eller indtil kølemidlet bliver fast.
- Monter kølet rack på prøven fase af den automatiske separator.
- Anbring prøverøret i slot A1, et rør til den negative fraktion i slot B1, og et rør til den positive fraktion i C1. Hvis indsamle mere end en prøve, lægge yderligere rør i de næste kolonner (A2, B2, C2, osv).
- Vælg fanen separation på den berøringsfølsomme skærm, og angiver arrangementet af rør på racket. Fra separation menuen vælges programmet "udtømmer" og gennemføre programmet cyklus med den passende type vask (se note nedenfor).
BEMÆRK: "udtømmer" program udfører udtynding bruger maskinen mest følsomme tilstand, som prioriterer renhed. Derudover er der tre forskellige vaske muligheder: quick skyl, skyl, og sove. Hvis prøverne er fra den samme kilde og skal kombineres, skal du vælge hurtig skyl. Hvis prøverne skal holdes adskilt, vælg skyl. Vælg søvn mulighed, hvis ikke flere isolationer vil blive udført den dag, og hvis maskinen vil blive lukket ned efter isolering - Start isolation ved at trykke på "Run", og bekræfte buffer niveauer, når du bliver bedt om. Når programmet er slut, vil den negative fraktion indeholder oprensede celler.
- Fyld konisk rør op til 15 ml med MS-buffer og centrifugeres.
- Dekanteres MS buffer og resuspender cellerne i 5 ml RF10 medier. Holde cellerne på is indtil det ekstracellulære flux assay.
BEMÆRK: Ideelt set bør den ekstracellulære flux assay foretages umiddelbart efter isolering. Men i indledende forsøg sås ingen signifikante forskelle i assay resultater i celler, der anvendes inden for 3 timer af isolation kontra frisk-isolerede dem.
- Manual Separation:
BEMÆRK: protokollen beskrevet her er for 96-brønds format af instrumentet. Mængderne vil skulle justeres, hvis der anvendes et andet format.
- Hydratisering af Sensor Cartridge
- Løft sensoren patronen, fylde hver brønd af nytten plade med 200 pi kalibrant opløsning og sænk sensorpatron på hjælpeprogram plade, nedsænkning sensorerne i kalibrant opløsning.
BEMÆRK: Kontroller, at kalibrant løsning er højt nok til at holde sensorerne neddykket. Patronen huser fluoroforer forbundet til O2 og H + til hver brønd; disse skal hydratiseres i orden for dem at fungere korrekt. - Placer patronen i en 37 ° C inkubator ikke suppleret med CO2 eller oxygen / nitrogen. Udfør alle yderligere inkubationer under disse betingelser, medmindre andet er angivet. Inkuber patronen overnight at hydratisere.
- Løft sensoren patronen, fylde hver brønd af nytten plade med 200 pi kalibrant opløsning og sænk sensorpatron på hjælpeprogram plade, nedsænkning sensorerne i kalibrant opløsning.
- preparation af klæbemiddel-belagte plader
- Forbered 2,5 ml af en 22,4 ug / ml klæbende opløsning i 0,1 M natriumbicarbonat, pH 8,0 (bicarbonat tilvejebringer den optimale pH for klæbemiddel adsorption).
- Påfør 25 pi af opløsningen til hver brønd i assaypladen, og inkuber på bænken ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Aspirer klæbemiddel og vask hver brønd to gange med 200 pi sterilt vand. Vent indtil brønde er tørre, før podning af cellerne.
- Podning Celler i klæbemiddelbelagt Plader
- Centrifuger cellerne ved stuetemperatur ved 200 xg i 5 min. Resuspender celler i 5 ml af den passende assaymedium (se ovenfor for formulering af mitokondriel stress og glucose stress medier). Centrifuge celler igen og resuspender på den ønskede koncentration i assay medium (resuspension volumen vil variere baseret på koncentration, hver brønd indeholder 180 pi cellesuspension).
BEMÆRK: Så længe de passende assay medier og sammensattes anvendes, den ekstracellulære flux analysator kan samtidig køre mitokondrie og glykolyse stresstest på den samme plade. - Plate 180 pi cellesuspension i hver brønd. Brug brønde A1, A12, H1, og H12 til korrektion baggrund temperatur: tilføje 180 pi assay medium i disse brønde (ingen celler).
- Pladerne inkuberes i 25 minutter ved 37 ° C.
- Centrifugeres pladen ved 200 x g i 5 minutter uden bremse for at sikre, at alle celler er fuldstændigt fastgjort. Bekræft visuelt, at cellerne stabilt er klæbet til kulturen overflade, som danner et monolag, ved at se under mikroskop. Overfør pladerne tilbage til inkubatoren i yderligere 30 minutter.
- Centrifuger cellerne ved stuetemperatur ved 200 xg i 5 min. Resuspender celler i 5 ml af den passende assaymedium (se ovenfor for formulering af mitokondriel stress og glucose stress medier). Centrifuge celler igen og resuspender på den ønskede koncentration i assay medium (resuspension volumen vil variere baseret på koncentration, hver brønd indeholder 180 pi cellesuspension).
- Udarbejdelse af 10x Koncentrationer af forbindelser, og Loading af Injektor Ports
- For den mitokondriske stresstest, forberede 2,5 ml hver af 10 uM oligomycin, 1 mM DNP, og en blanding af 10 uM rotenon og 10 uM antimycin A, alle i mitokondrie stress assay medium.
BEMÆRK: Koncentrationen af 2,4-DNP er baseret på tidligere offentliggjorte undersøgelser; 21 dette er en generel retningslinje men koncentrationen af afkobler for hver anvendte celletype bør bestemmes af forskeren. - For glycolyse stresstest forberede 2,5 ml hver af 250 mM glucose, 10 uM oligomycin, og 500 mM 2-deoxyglucose (2-DG) i glycolyse stress assaymedium.
- Varm 10x løsninger på 37 ° C, og justere pH til 7,4.
- Læg forbindelser i de relevante injektor havne i patronen med en multikanalpipette og lastning guider, som følger:
Tabel 3: forbindelse volumener.Havn Mitokondriel Stress Assay Glycolysen Stress Assay EN 20 pi oligomycin 20 pi glucose B 22 pi 2,4-DNP 22 pi oligomycin C 25 pi antimycin A / rotenon 25 pi 2-DG
BEMÆRK: Hver serie af porte (f.eks alle porte A) skal indeholde de samme volumen. Det er afgørende, at alle brønde i samme serie lastes, også dem der ikke anvendt i eksperimentet, ellers vil forbindelserne ikke injiceres (havne i ubrugte brønde kan indlæses med det samme volumen assaymedium). - Inkubér patronen, mens opsætning af programmet.
- For den mitokondriske stresstest, forberede 2,5 ml hver af 10 uM oligomycin, 1 mM DNP, og en blanding af 10 uM rotenon og 10 uM antimycin A, alle i mitokondrie stress assay medium.
- Opsætning Ekstracellulær Flux Assay protokoller
- Opsæt følgende program (tabel 4).
Tabel 4: Program layout.Trin Loop Kalibrering - ligevægtsindstilling - Baseline aflæsninger 3 gange: Bland 3 min, vente 0 min, foranstaltning 3 min Afslut sløjfe - Sprøjt Port A - Målinger 3 gange: Bland 3 min, vente 0 min, foranstaltning 3 min Afslut sløjfe - Sprøjt Port B - Målinger 3 gange: Bland 3 min, vente 0 min, foranstaltning 3 min Afslut sløjfe - Indsprøjtes Port C - Målinger 3 gange: Bland 3 min, vente 0 min, measure 3 min Afslut sløjfe - End Program -
BEMÆRK: I visse betingelser, f.eks ved brug af aktiverede celler, forsuringen kan fortsætte i længere tid end i naive celler. Af denne grund kan det være nødvendigt at forlænge de "Vent" tider i ovennævnte program eller gentage hver målecyklus flere gange. - Starte programmering. Efter kalibrering trin erstatte kalibrant plade for analysen plade (når du bliver bedt).
BEMÆRK: Brug af softwaren, er det muligt at angive grupper af brønde, der har lignende betingelser. Derudover er det afgørende at angive, hvilke brønde er kontrolbrøndene (i denne protokol, de er de fire hjørner af pladen), og at angive, hvilke brønde er tom. For en mere detaljeret, trin-for-trin, protokol til opsætning af maskinen og dets software, skal producentens websted konsulteres.
- Opsæt følgende program (tabel 4).
- Måling proteinindhold
- Fjern de resterende assaymediet fra hver brønd uden at forstyrre cellerne.
BEMÆRK: Hvis det ikke er praktisk at gå videre med proteinkoncentrationen assay, er det muligt at fryse hele pladen ved -20 ° C indtil analyse. Hvis frosset, tø, før du fortsætter. - Forbered en 1x løsning af proteasehæmmere (100x materiel) i RIPA lyse medium (tilstrækkeligt til 50 pl / brønd).
- Der tilsættes 50 pi RIPA lysis medium suppleret med proteaseinhibitorer til hver brønd. Agitere plade på et rysteapparat i 5 min, og derefter inkuberes pladen på is i 30 min til fuldt lysere celler.
- Spin pladen ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at bringe lipider og andre molekyler til bunden af pladen, så at de ikke forstyrrer den bicinchoninsyre (BCA) assay.
- Måle proteinkoncentrationen ved BCA-assay ifølge fabrikanten &# 39; s anbefalinger.
- Fjern de resterende assaymediet fra hver brønd uden at forstyrre cellerne.
Representative Results
Eukaryote celler bruger et integreret netværk af glycolysen, at den tricarboxylsyre (TCA) cyklus, og oxidativ fosforylering opfylde de fleste af deres energibehov og give mellemprodukter nødvendige for cellevækst og proliferation. Disse veje starte med den intracellulære indfangning af fri glucose i form af glucose-6-phosphat, som efterfølgende bliver forarbejdet til pyruvat. Pyruvat enten reduceret til lactat eller transporteres ind i mitokondrierne, hvor det danner acetyl coenzym A (CoA). Acetyl CoA derefter kommer ind i TCA-cyklus. Høj-energi mellemprodukter med TCA cyklus drive bevægelsen af elektroner i elektrontransportkæden (ETC), som igen ekskluderer H + fra den mitokondriske matrix til at generere en H + gradient over den indre mitokondrielle membran. Oxygen virker som den endelige elektronacceptor, og H + vende tilbage til den mitokondrielle matrix gennem F O / F <sub> 1-komplekset, hvor deres potentielle energi anvendes til at generere ATP (figur 1A).
Arbejdsgruppen princip i den ekstracellulære flux assay afhænger forstyrre glykolyse og oxidativ fosforylering på specifikke punkter, og vurdere de resulterende effekter. Til dette formål anvendte vi glucose at opformere glycolyse i udsultede celler, og 2-deoxyglucose (2-DG), som omdannes til 2-deoxyglucose-6-phosphat, en kompetitiv inhibitor af phosphoglucoisomerase 23, af hexokinase, for at blokere glykolyse. Rotenon (en kompleks I-specifik hæmmer af ETC), antimycin (en kompleks III-specifik hæmmer af ETC), oligomycin (hæmmer af ATP syntase 24), og den afkobling agent 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 var anvendes til at gribe specifikke begivenheder relateret til elektrontransport, proton gradient og ATP-syntese (figur 1A). I stedet for 2,4-DNP, carbonyl cyanide-4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP) kan også anvendes, men kan være påkrævet yderligere optimering. I begge tilfælde bør uncouplers altid titreres til en specifik celletype før brug for at bestemme den optimale koncentration nødvendig.
Den glycolyse stresstest (figur 1B) starter med en baseline måling af den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) i de tidligere udsultede celler. Da disse celler er på deres basale minimum, og de kan derfor i praksis betragtes som ikke-glykolytisk er ECAR målt på dette tidspunkt benævnt ikke-glycolytiske forsuring. Denne forsuring sandsynligvis svarer til respiratorisk CO2 genereret i TCA cyklus omdannes til HCO 3 - og H +. Dette efterfølges af indsprøjtning af glukose til at aktivere glycolysen, der præsenterer som en stigning i det ekstracellulære forsuring på grund af dannelsen af lactat.Denne stigning svarer til den normale sats af glykolyse. Cellerne bliver derefter udfordret med injektion af oligomycin, som blokerer dannelsen af ATP gennem oxidativ phosphorylering. Celler reagerer på denne dramatiske nedgang i ATP-produktion ved aktivering glycolyse til sit maksimale niveau, og som resulterer i en sekundær stigning i ECAR niveau (glycolytisk reserve). Testen afsluttes ved total hæmning af glycolysen bruge glukose analog 2-DG, som returnerer ECAR at der ikke glycolytisk niveau. Interessant er det blevet foreslået, at i modsætning til producentens anbefalinger, maksimal glykolyse er ikke nødvendigvis opnås ved injektion af oligomycin 26. I celler med høj glycolytisk kapacitet, hvis der ikke er en betydelig stigning i ATP efterspørgsel kan glykolyse være fuldt ud i stand til at klare tabet af mitokondrie ATP uden det behøver at være opreguleret. Den glycolytiske sats med oligomycin kunne overgås ved at tilføje respiratoriske inhibitorer, Såsom rotenon og myxothiazol, der giver et par fordele i forhold oligomycin: 1) De øger ATP efterspørgslen, da de forårsager tilbageførsel af ATP syntase, med ATP hydrolyse, at pumpe protoner i et forsøg på at inddrive den mitokondrielle membranpotentiale 26; 2) De forhindrer respiratoriske forsuring af mediet, som kan forvirre de ECAR resultater (se nedenfor). Andre måder at øge ATP efterspørgsel omfatter tilsætning af stoffer, der stimulerer hydrolysen af ATP af plasma membran ATPaser 26. Alt dette bør overvejes nøje af forskere, når de planlægger en glykolysen stresstest.
Den mitokondrie stresstest (figur 1C) starter med en baseline måling af ilt forbrug sats (OCR) i ikke-udsultede celler. Dette efterfølges af indsprøjtning af oligomycin, som hæmmer tilbagevenden af protoner gennem F O / F 1-kompleks og dermed hurtigt hyperpolarizes mitokondriemembranen. Hyperpolarisering forhindrer yderligere proton pumpe gennem respiratoriske komplekser, og de respiratoriske falder rente. Den resterende respiration kaldes proton lækage, som repræsenterer strømmen af protoner gennem lipider eller andre kanaler. Denne hyperpolariserede tilstand er hurtigt vendes ved tilsætningen af afkoblingsmiddel 2,4-DNP, der virker som en proton ionophor. Som svar, celler forsøge at inddrive membranpotentialet i et forgæves forsøg ved at øge elektrontransportkæden sats på sit maksimum, og dette igen øger OCR. Endelig med tilføjelse af to ETC-hæmmere (antimycin og Rotenon), mitokondrie respiration helt stopper og OCR falder til det laveste niveau. På dette niveau iltforbrug ikke skyldes mitokondriel aktivitet (ikke-mitochondrial). Forskellen i OCR genereres af disse inhibitorer, kaldes den maksimale mitokondrielle respiration, som er summen af baseline åndedræt og reservekapacitet.
B-celler og naive CD4 + T-celler blev isoleret som skitseret i afsnit 4 i protokollen, og splenocytter blev simpelthen fået ved at lysere de røde blodlegemer, som beskrevet i afsnit 3.3.
Følsomheden af celle typespecifikke metaboliske analyser afhænger af levedygtighed og renheden af udgangs cellepopulation. Derfor, for at kontrollere levedygtigheden af de isolerede muse-T-celler, splenocytter, og B-celler og renheden af T- og B-celler, små portioner af celler blev farvet til flow cytometrisk analyse (figur 2). I forward scatter-område vs. sidespredning-området (FSC-A versus SSC-A) plot, lymfocytter blev gated, og inden for denne port, befolkningen langs diagonalen i forward scatter-taghøjdet (FSC-H) vs. FSC-Et plot blev bestemt som undertrøjer. Inden for singlet population blev levedygtighed måles ved slusning af celler, der farves negative for levende / døde markør (figur 2A); T-celle levedygtighed var 97,9%, splenocyt levedygtighed var 92%, og B-celle-levedygtighed var 94%. B-celle-renhed, målt ved B220 + CD19 + -populationen 26, var 99%, mens CD4 + T-celle-renhed, målt ved CD44 - CD4 + -populationen 27, var 98,3% (Figur 2B).
Proteinkoncentrationen af cellelysatet kan bruges som en direkte indikator for belagte celleantal.
Isolerede lymfocytter og splenocytter blev udpladet i et klæbemiddel-coatet 96-brønds assayplade på 5 x 10 5 celler / brønd, 2,5 x 10 5 celler / brønd, 1,25 x 10 5 celler / brønd, og 0,625 x 10
Mitokondrie og glycolytiske stress assays er afhængige af forgyldt celleantal.
OCR blev målt for hver celletype og udpladningsdensitet i det ekstracellulære flux analysator. Som forventet højere tal celle har en højere målt OCR, samt mere dramatiske reaktioner på oligomycin, 2,4-DNP, og antimycin A / rotenon (figur 4A). Standardisere OCR målinger til hver prøves proteinkoncentration viser, at i almindelighed, større antal celler føre til mere nøjagtige OCR målinger. Plating ved 5 og 2,5 x 10 5 celler / brønd resulterede i lignende normaliserede OCR målinger i T-celler og splenocyter, og 5 og 1,25 x 10 5 celler / brønd resulterede lignende normaliserede OCR målinger i B-celler (figur 4B). De små forskelle i den normaliserede B-celle OCR-målinger kan være en indirekte indikation af, at B-celler klarer sig bedre ved 2,5 x 10 5 celler / brønd i forhold til andre celledensiteter. Af alle foranstaltninger, 0,625 x 10 5 celler / brønd gav suboptimale resultater, der viser, at dette plating tæthed er utilstrækkelig. Baseline respiration, proton lækage, maksimal mitokondriel respiration, ikke-mitokondriel respiration, og ATP-produktion lineært korreleret med plating tætheder for alle celletyper (figur 4C). Derudover er de fleste af baseline respiration anvendes i retning syntetisere ATP, som angivet ved den lave proton lækage i de tre celletyper. Mens det primære fokus for mitokondrie stress eksperimentet er at måle ændringer i OCR, at ECAR er stadig nyttigt at registrere for at sikre, at analysen med succes blev gennemført. Svarende til OCR, de to højeste plating tætheder resulterede i højere ECAR og mere dramatiske reaktioner på oligomycin, 2,4-DNP, og antimycin / rotenon (figur 4D). De dramatiske ændringer i ECAR ved tilsætning af 2,4-DNP, og antimycin A / rotenon kan skyldes ændringer i respiration Ud over ændringer i glycolysis, da CO2 frembragt i TCA cyklus omdannes til HCO 3 - og H +. Dette spørgsmål er for nylig blevet behandlet, og der eksisterer en simpel metode til at korrigere den samlede ekstracellulære forsuring signal ved hjælp forbrugsdata ilt, for at opnå den reelle glykolytisk sats 12,29.
Den glycolyse stress assay var mest vellykket på højeste udpladningsdensitet (figur 5A, B). I alle celletyper, 5 x 10 5 celler / brønd prøver havde de største ændringer i ECAR efter tilsætning af glucose, oligomycin, og 2-DG (figur 5B). Derudover normalisere til koncentration protein viste, at for alle celletyper, de 5 x 10 5 celler / brønd prøver gav optimale resultater, mens lavere koncentrationer-især 0,625 x 10 5 celler / godt ikke vise en robust glykolytisk reservekapacitet. Ikke-glycolytic forsuring, glycolyse, og tilsyneladende glycolytiske kapacitet lineært korreleret med plating tætheder for alle celletyper (figur 5C). For glycolyse stress eksperiment, OCR graf viser, at glucose lidt stimulerer mitokondrielle respiration, som derefter inhiberes med oligomycin behandling; tilsætning af 2-DG påvirkede ikke OCR (figur 5D). OCR graf kan bruges som et yderligere tegn på, at glycolyse stress eksperiment blev udført med succes. Desuden kan OCR grafen anvendes til at korrigere den ECAR graf, hvis det kræves, som forklaret ovenfor i forbindelse med det mitokondrielle stresstest 12,29.
Figur 1:. Oversigt over ekstracellulære flux assays (A) Illustration af glycolyse (venstre) og oxidativ phosphorylering (højre) viser virkningen afmetaboliske lægemidler anvendt i de ekstracellulære flux assays. (B) Skematisk af den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) graf; skematisk oxygenforbrugshastigheden (OCR) graf (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2: Trinvis gating af T-celler, B-celler og splenocyter at bestemme levedygtighed og renhed Flowcytometri plots viser levedygtigheden af T-celler, splenocytter, og B-celler (A); og renhed af T- og B-celler (B). Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større udgave af ther figur.
Figur 3:. Cell sammenløbet korrelerer med lysat proteinkoncentrationer på hver celletype ved forskellige plating densiteter (A) Lette mikrografer af celler i assaypladebrønde ved plating densiteter fra 5 x 10 5 celler / brønd til 0,625 x 10 5 celler / godt. Skalapanelerne betegne 50 um. (B) lysat proteinkoncentrationer på forskellige plating tætheder, målt ved BCA-assay. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mitokondrie stress assay. Raw (A) og standardiseret (B) OCR for hver celletype og udpladningsdensitet er vist. (C) celleantal-afhængige ændringer i niveauerne af basislinie, maksimal mitokondrie og ikke-mitokondriel respiration samt ilt forbrug forbundet med proton lækage eller ATP-produktion, er vist for hver celletyper. (D) Raw ECAR værdier fra de mitokondrie stresstest vises. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien af 7-8 brønde med standardafvigelse. Mærkede pile betegner injektioner af oligomycin (O), 2,4-DNP (D), og rotenon / antimycin (R / A). Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
_upload / 54.918 / 54918fig5.jpg "/>
Figur 5:. Glycolytiske stress assay Raw (A) og standardiseret (B) ECAR for hver celletype og udpladningsdensitet er vist. (C) celleantal-afhængige ændringer i ECAR for ikke-glykolytisk forsuring, glucose-induceret glykolyse og total glykolytisk kapacitet vises. (D) Raw OCR-værdier opnået fra de glycolytiske stresstest vises. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien af 7-8 brønde med standardafvigelse. Mærkede pile angiver injektioner af glucose (G), oligomycin (O), og 2-deoxyglucose (2-DG). Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Protokollen Vi udviklede tilladt for effektiv isolering af ren og levedygtig lymfocytundergrupper, som efterfølgende blev anvendt i ekstracellulær flux analyse ved forskellige koncentrationer for at vurdere forskellene i glycolyse og mitokondrielle respiration ydeevne. Denne protokol er designet specielt til lymfocytter og tilgodeser særlige hensyn forbundet med disse celletyper, såsom lav basal metabolisk aktivitet, skrøbelighed, lav frekvens, og deres manglende evne til at klæbe til assayplader. Derfor sammenlignet med tidligere offentliggjorte protokoller 11,12, vores metode giver et mere praktisk og bedre optimeret vejledning til forskere, der arbejder inden for immunologi. Der er flere kritiske trin i denne protokol, herunder at få rene og levedygtige cellepopulationer, plettering af cellerne ved optimal sammenløb, og standardisere de ekstracellulære flux assay målinger proteinkoncentrationen i hver brønd.
Den initial antal celler udpladet kunne begge visualiseres ved lysmikroskopi og også kvantificeres under anvendelse af protein koncentrationsmålinger. Den lineære korrelation mellem celleantal og proteinkoncentration bekræftede, at proteinkoncentrationen faktisk kan anvendes som en måde at standardisere virkningerne af ændringer i celleantal mellem forskellige brønde.
Ved at standardisere de ECAR og OCR-resultater til proteinet koncentrationer viste vi, at der trods lavere celle konfluens, så få som 2,5 x 10 5 celler / brønd kunne anvendes i de fleste assays uden at forringe kvaliteten af dataene. Men den nedre grænse af celler, der kan anvendes svingede mellem celletyper og assays. For eksempel, mens så få som 1,25 x 10 5 celler kan anvendes til B-celle OCR målinger, selv 2,5 x 10 5 celler / brønd var ikke nok til at vurdere den glycolytiske resultater af samme celletype. Derfor så længe celleantal ikke er en begrænsende faktor, plettering til over90% konfluens, hvilket omtrent svarer til 5 x 10 5 lymfocytter / brønd, foretrækkes. Yderligere optimering kan være påkrævet, når celler i forskellige størrelser-såsom tidligere aktiveret og delvist differentierede lymfocytter-anvendes. Derudover, når anvendelse af tidligere dyrkede primære lymfocytter, kan der være en variation i cellelevedygtighed mellem forskellige behandlingsbetingelser, hvilket ville reducere pålideligheden af proteinkoncentrationen som mål for celleantallet siden døde eller døende celler kan også bidrage til de målte proteinniveauer . I sådanne tilfælde kunne det være nyttigt at sortere levende celler ved flowcytometri før der udføres de ekstracellulære flux assays.
I vores assays under anvendelse frisk isolerede og stærkt levedygtige lymfocytpopulationer, opnåede vi pålidelige funktionelle data for både OCR og ECAR målinger. Mens alle celletyper opførte sig på samme måde i den mitokondriske stresstest, markante forskelle mellem celletyper varobserveret i glycolyse stresstest. For eksempel den glycolytiske ydeevne naive T-celler var lav sammenlignet med splenocyter eller B-celler, og det ændrede sig ikke med tilføjelse af oligomycin. Denne observation er i overensstemmelse med tidligere publicerede undersøgelser 7,30, bekræftelse af validiteten af vores protokol.
Afslutningsvis vores metode giver en effektiv og bekvem måde at teste den metaboliske aktivitet af lymfocytter under anvendelse af et ekstracellulært flux analysator, og det kan være nyttigt i en lang række immunologiske undersøgelser udforske de metaboliske ændringer i immunceller ved aktivering, celledifferentiering eller på grund til sygdomsfænotyper såsom infektion, autoimmunitet og hæmatologiske maligniteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
| Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
| RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
| L-Glutamine 200 mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
| HEPES 1 M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
| Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
| Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
| CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
| B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
| Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
| MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
| autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
| autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis. |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
| Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
| Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak. |
References
- Motz, G. T., Coukos, G. Deciphering and reversing tumor immune suppression. Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).
- Akkaya, M., Barclay, A. N. How do pathogens drive the evolution of paired receptors? Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).
- Dinarello, C. A. Proinflammatory cytokines. Chest. 118 (2), 503-508 (2000).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454 (2013).
- Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. Metabolic pathways in T cell fate and function. Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).
- Doughty, C. A., et al. Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth. Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).
- Caro-Maldonado, A., et al. Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells. J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
- Klein, A. B., et al. Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function. J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).
- Hsueh, R. C., et al. Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes. AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).
- Zambrano, K., et al. Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes. Biotechnol Prog. , (2016).
- Costa, G. L., et al. Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease. J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis. J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9 (2001).
- Akkaya, B., et al. A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry. J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).
- Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).
- Wick, A. N., et al. Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose. J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase system. Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).
- Terada, H. Uncouplers of oxidative phosphorylation. Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).
- Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PLOS ONE. 11 (3), e0152016 (2016).
- Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. 3rd Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping. J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).
- Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment. Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).
