Abstract
Lymfocytter svare på en rekke stimuli ved å aktivere intracellulære signalreaksjonsveier, noe som i sin tur fører til rask cellulær proliferasjon, migrering og differensiering og cytokinproduksjon. Alle disse hendelsene er tett knyttet til den energistatus i cellen, og derfor studere trasé energi-produserende kan gi hint om den samlede funksjonalitet av disse cellene. Den ekstracellulære flux analysator er en vanlig enhet for å vurdere resultatene av glykolyse og mitokondriell respirasjon i mange celletyper. Dette systemet har blitt brukt til å studere immunceller i noen publiserte rapporter, men en omfattende protokoll optimalisert særlig for lymfocytter mangler. Lymfocytter er skjøre celler som overlever dårlig i ex vivo forhold. Ofte lymfocytt undergrupper er sjeldne, og arbeider med lave celle tall er uunngåelig. Dermed er en eksperimentell strategi som løser disse problemene nødvendig. Her gir vi en protokollsom gir mulighet for hurtig isolering av levedyktige lymfocytter fra lymfevev, og for analyse av deres metabolske tilstander i det ekstracellulære fluks analysator. Videre gir vi resultatene av eksperimenter hvori de metabolske aktiviteter for flere lymfocytt-undertyper på forskjellige celletettheter ble sammenlignet. Disse observasjoner tyder på at våre protokoll kan benyttes for å oppnå konsistente, godt standardisert resultater selv ved lave cellekonsentrasjoner, og dermed kan det har brede anvendelser i fremtidige studier som fokuserer på karakteriseringen av metabolske hendelser i immunceller.
Introduction
Den immunrespons mot antigener er en stramt regulert balanse mellom aktivering av immunsystemet og immunsuppresjon. Aktivering av immunsystemet driver hurtig celleproliferasjon og migrasjon, samt cytokinproduksjon, antistoff utskillelse og øket fagocytose i respons til sentralstimulerende, mens immunsuppresjon bare hemmer disse hendelsene og er derfor viktig for å hindre unødvendig immunresponser 1-6. Nyere studier har vist at en direkte sammenheng mellom aktiveringsstatusen til immunceller og aktiviteten av forskjellige metabolske veier 7. Immunceller kan skifte mellom hvile og aktiverte tilstander ved å bytte energibanene produsere på og av. Videre har det blitt observert at forskjellige immuncelletyper kan bruke forskjellige metabolske strategier for å drivstoff sine økt energibehov under aktiveringen. For eksempel, mens aktivering av T-lymfocytter retning og celler til en nesten fullstendig glykolytisk tilstand 8 9,10. Disse studiene peker på viktigheten av å undersøke effekten av immuncelleaktivering på cellenes stoffskifte.
Sanntid, samtidige målinger av oksygenforbruk rate (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR), som indikatorer på oksidativ fosforylering og glykolyse, er en felles strategi for å møte de statene trasé energiproduserende 11-13. For å oppnå dette, et ekstracellulært fluks analysator, for eksempel Seahorse XF 96, blir rutinemessig brukt. Et slikt instrument kan raskt sammenligne endringer i OCR og ECAR over celletyper eller på ulike stimulerings forhold. Så langt forskjellige celletyper, inkludert immunceller, er blitt undersøkt ved hjelp av disse enhetene. Imidlertid er en optimalisert protokoll spesielt utviklet for immunceller ikke er tilgjengelig.
Immunceller, særlig lymfocytter, avvike fra othennes celletyper i flere kritiske måter. Lymfocytter er skjøre celler som ikke overlever for lang tid i ex vivo forhold 14-16. Dette er et enda større problem når de dyrkes i suboptimal vekstmediet mangler essensielle næringsstoffer, slik som de som brukes i ekstracellulær fluks analyse. I motsetning til makrofager og mange cellelinjer, trenger lymfocytter ikke holder seg til plastoverflater; Derfor er det viktig å feste dem til analyseplaten uten å generere spenning. Endelig kan noen lymfocytsubpopulasjoner være ekstremt sjeldne og høsting dem på de nødvendige, optimale mengder kan være utfordrende 17-19.
Her gir vi en optimalisert protokoll som er spesielt utviklet for lymfocytter. Bruke splenocytes, B-lymfocytter og naive CD4 + T-lymfocytter isolert fra mus milt og lymfeknuter 20, viser vi hva som kjennetegner deres hviletilstand glykolyse og oksidativ fosforylering ved different celletettheter. Dataene ble normalisert for å ta hensyn til forskjeller i de innledende celletallene for hver brønn ved å måle ende analysecellen lysat proteinkonsentrasjoner, som var direkte proporsjonal med antall celler. Vår protokollen ikke bare gir retningslinjer for den raske isolering av levedyktige lymfocytter for ekstracellulære flux analyser, men det gir også mulighet for å jobbe på suboptimale cellekonsentrasjoner uten at datakvalitet.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med LIG-fire dyr protokollen, som ble godkjent av NIAID Animal Care og bruk komité.
1. Utarbeidelse av reagenser
- Fremstille magnetisk separasjon (MS) buffer: PBS (pH 7,2) supplert med 0,5% BSA og 2 mM EDTA eller automatisk separasjon oppløsning supplert med 0,5% BSA. Steril filter (0,22 mm) og oppbevar ved 2-8 ° C.
- Forbered RF10 medium: RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 50 U / ml penicillin, 50 pM streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 50 uM 2- p-merkaptoetanol, 10 mM HEPES. Bruk sterile reagenser. Steril filter og oppbevares ved 2-8 ° C.
- Fremstille mitokondrielle stresstest medium: XF basen medium supplementert med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og 25 mM glukose.
- Forbered glykolyse stress test medium: XF basismellom supplemented med 2 mM L-glutamin.
- Juster pH både mitokondrie og glykolyse stresstest media til 7,4, sterilt filter og oppbevares ved 2-8 ° C. Varme media til 37 ° C og på nytt justere pH før bruk (foreta pH-målinger ved 37 ° C).
MERK: Bruk av XF medium, som mangler bikarbonat, er kritisk. Etter at atmosfæren i det ekstracellulære fluksen analysatoren inneholder bare omgivelses CO 2, noe bikarbonat i mediet, ved binding til protoner utgitt som et biprodukt av glykolyse, vil dissosiere under dannelse av CO2 og vann. CO 2 vil avgassing under forsøket, forårsaker fonner i pH som ville obskure glycolytic forsuring signal. - Forbered oligomycin: Forbered 10 mM stamløsning i DMSO; lagre ved -20 ° C.
- Forbered 2,4-DNP: Forbered en M stamløsning i DMSO; lagre ved -20 ° C.
- Forbered antimycin: Forbered 10 mm stamløsning i DMSO; lagre ved -20 ° C.
- Forbered rotenon: Forbered 10 mM stock løsning i DMSO; lagre ved -20 ° C.
- Fremstille glukose: Oppløs glukose i glykolysen stresstest medium for å danne en 250 mM oppløsning; forberede frisk før hvert forsøk, og ikke fryse.
- Forbered to-DG: Løs solid 2-DG i glykolyse stresstest medium for å danne en 500 mM løsning; forberede frisk før hvert forsøk, og ikke fryse.
2. Høsting Spleen og lymfeknuter fra mus
- Avlive musen ved CO 2 kvelning fulgt ved halshugging.
- Spray mus med 70% etanol.
- For påfølgende T-celle isolasjon, høste milten, overfladisk cervical, overfladisk / dype aksillære, kjeve, inguinal, og mesenteric lymfeknuter.
- For påfølgende B-celle isolasjon, høste bare milten.
MERK: Bruk en biosikkerhet kabinett og holde høstet organer i PBS eller RF10 media på is inntil behandling. Bruk sterile laboratorie og steril teknikk for all behandling og isolasjon trinn. Hold alle buffere og media på is for å øke isolasjon effektiviteten og redusere celledød.
3. Tissue Processing
- Plasser en 70 mikrometer celle sil over en 50 ml konisk rør og overføre organer på silen. For T-celle isolasjon, kombinere alle organer og for B-celle isolasjon overføring bare milten.
- Ved hjelp av stempelet fra en steril 3 ml sprøyte, mos vevet gjennom silen. Under mose, sørg for at filteret og organene er fuktig hele tiden og våt dem etter behov ved å legge til MS buffer. Dette vil både holde celleviabilitet høy og hindre tilstopping av filteret.
- Etter mose, gjelder 5-10 ml MS buffer til filteret for å øke celle utvinning. Sentrifuger suspensjonen ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. (Gjennomføre alle videre sentrifugeringer under disse forholdene, med mindre spesifisert).
- Dekanter væsken og resuspender pelleten i 5 ml ACK røde blodcellelysebuffer. Incubate i 5 min på is for å lysere røde blodceller (røde blodlegemer må fjernes, fordi de forstyrrer den magnetiske separasjon). Legg 10-20 ml MS buffer og sentrifuger.
- Plasser en 30 mikrometer celle filter over en 15 ml konisk rør og prime det med en ml MS buffer (dette filtrering vil fjerne rusk fra erytrocytt lyse). Dekanter væsken fra den sentrifugerte rør, resuspender pelleten i 5 ml buffer MS og passere det gjennom filteret. Vask den første røret med 4 ml MS-buffer for å øke celle utvinning, og bruke dette til å skylle filteret.
- Ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisk celleteller, bestemmer det totale antall celler. Denne celletall vil bli brukt for å bestemme mengden av magnetiske separasjons reagenser som er nødvendig i punkt 4. Hvis splenocytter skal brukes i den etterfølgende ekstracellulære fluksen assay, sette det passende antall celler på dette tidspunktet.
- Sentrifuger suspensjonen og videre til magnetisk separasjon. Resuspender splenocytes ikke bruktfor B-celle isolasjon i 5 ml RF10 og holder på is inntil det ekstracellulære fluksen analysen.
4. Magnetisk Separering av B-celler og naive CD4 + T celler
- Bestem de nødvendige mengder biotin-antistoff cocktail, anti-biotin mikroperler, og MS buffer. Bruk følgende volumer for 10 8 celler som en guide og skalere opp eller ned etter behov.
MERK: Inkuber prøvene i et kjøleskap i stedet for på is siden inkubering på is kan redusere antistoffbindingseffektivitet og lengre inkubasjonstider kan være nødvendig.
| Reagenser for naive CD4 + T-celleseparasjon | Volume 10 8 celler |
| (skalere riktig) | |
| Biotin-antistoff cocktail | 100 pl |
| MS buffer for første inkubasjon | 400 mL |
| Anti-biotin mikroperler | 200 ul |
| CD44 mikroperler | 100 pl |
| MS buffer for andre inkubasjon | 200 ul |
| Inkuber biotin-antistoff-cocktail og celler ved 4 ° C i 5 minutter. Legg anti-biotin-mikroperler, CD44 mikroperler, MS buffer og inkuberes ved 4 ° C i 15 min. | |
Tabell 1: T-celleisolerings volumer og instruksjoner.
| Reagenser for B-celle separasjon | Volume 10 8 celler |
| (skalere riktig) | |
| Biotin-antistoff cocktail 100 pl | |
| MS buffer for første inkubasjon | 400 mL |
| Anti-biotin mikroperler | 200 ul |
| MS buffer for andre inkubasjon | 300 mL |
| Inkuber biotin-antistoff-cocktail og celler ved 4 ° C i 15 min. Tilsett passende mengde av biotin-antistoff-cocktail og MS-buffer, og inkuber .blandingen ved 4 ° C i 15 min. Tilsett passende mengde av anti-biotin mikroperler og MS-buffer og inkuberes blandingen ved 4 ° C i 15 min. Etter den andre inkuberingen fylle røret med MS-buffer og sentrifugering. | |
Tabell 2: B-celleisolerings volumer og instruksjoner.
- Resuspender pelleten i MS-buffer: 500 ul for manuell separasjon, 3-4 ml for automatisk separasjon.
- Fortsett med enten manuell eller automatisk separasjonerfølgende:
- Manuell Separasjon:
- Sette inn en LS kolonne inn i separasjons magneten, plasserer et sterilt 15 ml konisk rør nedenfor for å samle strømningen gjennom, og prime kolonnen ved vasking med 3 ml MS-buffer. Kast strømme gjennom.
- Overfør cellesuspensjon til primet LS kolonne og la det passere gjennom; Vask røret brukes under inkubasjon med 3 ml MS buffer og passerer dette gjennom kolonnen i tillegg. Eluatet vil inneholde de rensede celler. For B-celle isolasjon, passerer de rensede celler gjennom kolonnen annen gang inn i en ny 15 ml rør, og gjenta vasketrinnet. Dette vil øke renheten og utbytte.
- Automatisert Separasjon:
- Slå på den automatiske separatoren og kontrollere nivåene av rennende buffer, skylleoppløsning og 70% etanol. Sørg for at avfallet er tom før du starter separasjon.
- Velge den passende kjølt stativet avhengig av rørstørrelsen than urenset prøve (f.eks, 15 ml). For å holde cellene levedyktige i løpet av separasjonsprosessen ved å bruke stativer som tidligere er blitt kjølt ved 2-8 ° C i 3-4 timer, eller inntil kjølevæsken blir solid.
- Monter kjølt stativet på prøven scenen av den automatiske separator.
- Plassere prøverøret i spor A1, et rør for den negative fraksjonen i spor B1, og et rør for positiv fraksjonen i C1. Ved å samle mer enn én prøve, legge ytterligere rør i løpet av de neste kolonnene (A2, B2, C2, etc.).
- Velg fanen separasjon på berøringsskjermen, og viser arrangementet av rør på stativet. Fra separasjon menyen, velg "tapper" program og fullføre programmet syklus med riktig type vask (se merknad nedenfor).
MERK: "tapper" program utfører tømming bruker maskinen mest sensitive modusen, som prioriterer renhet. I tillegg er det tre forskjellige vaske alternativer: quick skyll, skyll og søvn. Dersom prøvene er fra samme kilde og skal kombineres, velg rask skylling. Dersom prøvene skal holdes atskilt, velg skylling. Velg søvn alternativet hvis ingen ytterligere isoleringer vil bli gjennomført den dagen, og hvis maskinen vil bli stengt ned etter isolering - Start isolasjon ved å trykke "Kjør" og bekreft buffernivåene når du blir bedt. Etter at programmet er avsluttet, vil den negative fraksjonen inneholder rensede celler.
- Fylle den koniske rør opp til 15 ml med MS buffer og sentrifugering.
- Dekanter MS-buffer og resuspender cellene i 5 ml RF10 media. Holde cellene på is inntil det ekstracellulære fluksen analysen.
MERK: Ideelt sett bør den ekstracellulære flux analysen utføres umiddelbart etter isolasjon. Men i gangsetting ble ikke observert noen signifikante forskjeller i analyseresultater i celler som brukes innen 3 timer av isolasjon versus ferskt isolerte seg.
- Manuell Separasjon:
MERK: Protokollen beskrevet her er for det 96-brønners-formatet av instrumentet. Volumene vil måtte justeres dersom annet format blir brukt.
- Hydration av Sensor Cartridge
- Løft opp sensorkassetten, fylle hver brønn av verktøyet platen med 200 ul kalibreringsløsning og senke sensorkassetten på verktøyplaten, nedsenke sensorene i kalibreringsløsningen.
MERK: Kontroller at kalibreringsløsning nivået er høyt nok til å holde sensorene neddykket. Kassetten havner fluoroforer knyttet til O 2 og H + for hver brønn; disse må være hydrert i orden for dem å fungere ordentlig. - Sett patronen i en 37 ° C inkubator ikke supplert med CO 2 eller oksygen / nitrogen. Utføre alle ytterligere inkubering under disse forholdene, med mindre spesifisert. Inkuber kassetten over natten til hydrat.
- Løft opp sensorkassetten, fylle hver brønn av verktøyet platen med 200 ul kalibreringsløsning og senke sensorkassetten på verktøyplaten, nedsenke sensorene i kalibreringsløsningen.
- FORBEREDELSERasjon av lim-belagte plater
- Forbered 2,5 ml av en 22,4 ug / ml klebe oppløsning i 0,1 M natriumbikarbonat, pH 8,0 (bikarbonat gir den optimale pH-verdi for adsorpsjon klebemiddel).
- Anvende 25 ul av oppløsningen til hver brønn av analyseplaten, og inkuber på benken ved romtemperatur i 20 min.
- Aspirer klebemiddel og vaskes hver brønn to ganger ved hjelp av 200 ul sterilt vann. Vent til brønner er tørre før såing cellene.
- Seeding Celler i Selvklebende-belagte plater
- Sentrifuger cellene ved romtemperatur ved 200 xg i 5 min. Resuspender celler i 5 ml av den aktuelle analysemedium (se ovenfor for formulering av mitokondriell stress og glukose spenning media). Sentrifuger cellene igjen og resuspender på ønsket konsentrasjon i analysemedium (resuspensjon volum vil variere basert på konsentrasjon, hver brønn vil inneholde 180 mL av cellesuspensjon).
MERK: Så lenge de aktuelle analyse medier og sammensattes blir brukt, den ekstracellulære flux analysator kan samtidig kjøre mitokondrie og glykolyse stresstester på samme plate. - Platen 180 ul cellesuspensjon i hver brønn. Bruk brønner A1, A12, H1 og H12 for bakgrunnen temperaturkorreksjon: legge 180 mL av analysemedium i disse brønnene (ingen celler).
- Inkuber platene i 25 minutter ved 37 ° C.
- Sentrifuger plate ved 200 xg i 5 min med ingen brems for å sikre at alle cellene er helt festet. Visuelt bekrefte at cellene er stabilt festet til kulturoverflaten, danner et monolag, ved å se under mikroskop. Overfør platene tilbake til inkubatoren i ytterligere 30 min.
- Sentrifuger cellene ved romtemperatur ved 200 xg i 5 min. Resuspender celler i 5 ml av den aktuelle analysemedium (se ovenfor for formulering av mitokondriell stress og glukose spenning media). Sentrifuger cellene igjen og resuspender på ønsket konsentrasjon i analysemedium (resuspensjon volum vil variere basert på konsentrasjon, hver brønn vil inneholde 180 mL av cellesuspensjon).
- Utarbeidelse av 10x Konsentrasjoner av forbindelser, og lasting av Injector Ports
- For den mitokondrielle stresstesten, forberede 2,5 ml hver av 10 uM oligomycin, 1 mM DNP, og en blanding av 10 uM rotenon, og 10 uM antimycin, alt i mitokondriell spenning assay medium.
MERK: Konsentrasjonen av 2,4-DNP er basert på tidligere publiserte undersøkelser; 21 Dette er en generell retningslinje, men konsentrasjonen av uncoupler for hver celletype som brukes bør bestemmes av forskeren. - For glykolyse stresstesten, forberede 2,5 ml hver av 250 mM glukose, 10 uM oligomycin, og 500 mM 2-deoksyglukose (2-DG) i glykolysen spenning analysemedium.
- Varme 10x løsninger til 37 ° C, og justere pH til 7,4.
- Last forbindelser i de riktige injektoren portene på kassetten ved hjelp av en multikanalpipette og laste guider, som følger:
Tabell 3: Forbindelse volumer.Havn Mitokondrie Stress analyse Glykolyse Stress analyse EN 20 mL oligomycin 20 ul glukose B 22 mL 2,4-DNP 22 mL oligomycin C 25 ul antimycin A / rotenon 25 mL 2-DG
MERK: Hver rekke porter (f.eks alle porter A) må inneholde samme volum. Det er viktig at alle brønnene i en gitt rekke er lastet, selv de som ikke er benyttet i forsøket, ellers vil forbindelsene ikke skal injiseres (porter i ubrukte brønner kan fylles med det samme volum av analysemedium). - Inkuber patronen mens du setter opp programmet.
- For den mitokondrielle stresstesten, forberede 2,5 ml hver av 10 uM oligomycin, 1 mM DNP, og en blanding av 10 uM rotenon, og 10 uM antimycin, alt i mitokondriell spenning assay medium.
- Sette opp ekstracellulær Flux analysen protokoller
- Sett opp følgende program (tabell 4).
Tabell 4: Program layout.Skritt Loop kalibrering - likevekt - baseline opplesninger 3 ganger: Bland 3 min, vente 0 min, måle 3 min slutt sløyfe - Sprøyt Port A - Målinger 3 ganger: Bland 3 min, vente 0 min, måle 3 min slutt sløyfe - Sprøyt Port B - Målinger 3 ganger: Bland 3 min, vente 0 min, måle 3 min slutt sløyfe - Sprøyt Port C - Målinger 3 ganger: Bland 3 min, vente 0 min, Målte 3 min slutt sløyfe - slutt Program -
MERK: Under visse forhold, for eksempel ved bruk av aktiverte celler, forsuring kan fortsette lenger enn i naive celler. Av denne grunn kan det være nødvendig å forlenge "vente" tider i det ovennevnte program eller gjenta hver målesyklus flere ganger. - Begynner programmet. Etter kalibrering trinnet erstatter den kalibreringsplate for analysen plate (når du blir bedt).
MERK: Ved hjelp av programvaren, er det mulig å angi grupper av brønner som har lignende forhold. I tillegg er det avgjørende å indikere hvilke brønner er kontrollbrønnene (i denne protokollen, er de fire hjørner av platen), og for å indikere hvilke brønner er tomme. For en mer detaljert, steg-for-steg, protokoll for å sette opp maskinen og dets programvare, bør produsentens hjemmeside konsulteres.
- Sett opp følgende program (tabell 4).
- Måling proteininnhold
- Fjerne gjenværende analysemediet fra hver brønn uten å forstyrre cellene.
MERK: Hvis det ikke er praktisk å fortsette med proteinkonsentrasjonen analysen, er det mulig å fryse hele platen ved -20 ° C inntil analyse. Hvis frosset, tine før du fortsetter. - Forbered en 1x løsning av proteasehemmere (100x lager) i RIPA lyse medium (tilstrekkelig for 50 ul / brønn).
- Tilsett 50 mL RIPA lysering medium supplementert med proteasehemmere til hver brønn. Agitere plate på en rystemaskin i 5 min, og deretter inkubere platen på is i 30 minutter for å full lyse celler.
- Spin platen ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur for å bringe lipider og andre molekyler til bunnen av platen, slik at de ikke kommer i konflikt med bicinchoninic syre (BCA) assay.
- Måle proteinkonsentrasjon ved BCA-analyse i henhold til produsenten &# 39; s anbefalinger.
- Fjerne gjenværende analysemediet fra hver brønn uten å forstyrre cellene.
Representative Results
Eukaryote celler bruke et integrert nettverk av glykolysen, til trikarboksylsyre (TCA) syklus, og oksidativ fosforylering oppfyller de fleste av sine energibehov, og for å tilveiebringe mellomprodukter som er nødvendige for cellevekst og proliferasjon. Disse banene begynner med den intracellulære fangst av fri glukose i form av glukose-6-fosfat, som deretter blir bearbeidet til pyruvat. Pyruvat er enten redusert til laktat eller transporteres inn i mitokondriene, hvor den danner acetyl-koenzym A (CoA). Acetyl CoA deretter trer inn i den TCA-syklus. Høy energi mellomprodukter med den TCA-syklusen drive bevegelse av elektroner i elektrontransportkjeden (ETC), som i sin tur utstøter H + fra den mitokondrielle matriks for å generere en H + gradient over den indre mitokondrie-membran. Oksygen virker som den endelige elektronakseptor, og H + returnere tilbake til den mitokondrielle matriks gjennom F O / F <sub> en kompleks, hvor deres potensiell energi blir brukt til å generere ATP (figur 1A).
Den virkemåte av ekstracellulære flux analysen avhenger forstyrrer glykolyse og oksidativ fosforylering på bestemte punkter, og vurdere de resulterende effektene. For dette formål, har vi brukt glukose til å forplante glykolyse i sultet celler, og 2-deoksyglukose (2-DG), som omdannes til 2-deoksyglukose-6-fosfat, en kompetitiv inhibitor av phosphoglucoisomerase 23, ved heksokinase, for å blokkere glykolyse. Rotenon (en kompleks I-spesifikk hemmer av den ETC), antimycin A (et kompleks III-spesifikk hemmer av den ETC), oligomycin (inhibitor av ATP syntase 24), og frakoplingen midlet 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 var brukes til å gripe inn spesifikke hendelser knyttet til elektrontransport, proton gradient og ATP syntese (figur 1A). I stedet for 2,4-DNP, karbonyl CYAnide-4- (trifluormetoksy) phenylhydrazone (FCCP) kan også brukes, men ytterligere optimalisering kan være nødvendig. I begge tilfeller bør uncouplers alltid titreres for en spesifikk celletype før bruk for å bestemme den optimale konsentrasjonen som er nødvendig.
Den glykolyse stresstest (figur 1B) starter med en baseline måling av ekstracellulære forsuring rate (ECAR) i de tidligere sultet celler. Siden disse cellene er på sitt basal minimum, og kan derfor i praksis anses som ikke-glykolytisk blir ECAR måles ved dette punkt betegnes som den ikke-glykolytiske surgjøring. Dette forsuring sannsynligvis tilsvarer luft CO 2 som genereres i TCA syklus blir konvertert til HCO 3 - og H +. Dette etterfølges av injeksjon av glukose for å aktivere glykolyse, som viser som en økning i det ekstracellulære forsuring på grunn av dannelsen av laktat.Denne økningen representerer normal hastighet på glykolyse. Cellene blir deretter utfordret med injeksjon av oligomycin, som blokkerer generering av ATP ved oksidativ fosforylering. Celler svare på dette dramatisk reduksjon i ATP-produksjon ved å aktivisere glykolysen til sitt maksimale nivå, og som resulterer i en sekundær økning av ECAR nivå (glykolytisk reserve). Testen blir avsluttet ved total inhibering av glykolyse ved hjelp av glukose analoge 2-DG, som returnerer ECAR til sin ikke-glykolytisk nivå. Interessant nok er det blitt foreslått at, i motsetning til produsentens anbefalinger, maksimal glykolyse ikke nødvendigvis er oppnådd ved injeksjon av oligomycin 26. I celler med en høy glykolytisk kapasitet, hvis det ikke er en signifikant økning i ATP etterspørsel, kan glykolyse være helt i stand til å takle tapet av mitokondriell ATP uten at det trenger å være oppregulert. Den glycolytic sats med oligomycin kunne bli overgått ved å legge luftveis hemmere, Slik som rotenon og myxothiazol, som gir noen fordeler sammenlignet med oligomycin: 1) De øker ATP krav, som de forårsaker reversering av ATP syntase, med ATP-hydrolyse, for å pumpe protoner i et forsøk på å gjenopprette den mitokondriemembranpotensialet 26; 2) De forhindrer luft forsuring av mediet, noe som kan forvirre resultater de ECAR (se nedenfor). Andre måter å øke ATP etterspørsel omfatter tilsetning av forbindelser som stimulerer hydrolysen av ATP ved plasmamembranen ATPaser 26. Alt dette bør vurderes nøye av forskere når du planlegger en glykolyse stresstest.
Den mitokondrielle stresstest (figur 1C) starter med en grunnlinje måling av oksygenforbrukshastighet (OCR) i ikke-sultet celler. Dette etterfølges av injeksjon av oligomycin, som hindrer tilbakeføring av protoner inn i F O / F en kompleks og således hurtig hyperpolarizes mitokondrie membran. Hyperpolarization hindrer videre proton pumpe gjennom luftveis komplekser, og åndedretts avtar. De resterende respirasjon kalles proton lekkasje, som representerer strømmen av protoner gjennom lipider eller andre kanaler. Denne hyperpolariserte tilstand hurtig reversert ved tilsetning av frakoplingen midlet 2,4-DNP, som virker som en proton ionofor. Som svar celler forsøke å gjenopprette den membranpotensialet i et forgjeves forsøk ved å øke elektrontransporthastigheten til sitt maksimum, og dette i sin tur øker OCR. Til slutt, med tillegg av to ETC-hemmere (antimycin A og rotenon), mitokondriell respirasjon stopper helt og OCR synker til sitt laveste nivå. På dette nivået, er oksygenforbruket ikke på grunn av mitokondriell aktivitet (non-mitokondrie). Forskjellen i OCR som genereres av disse inhibitorer er kalt den maksimale mitokondriell respirasjon, som er summen av grunnlinjen åndedrett og den reservekapasitet.
B-celler og naive CD4 + T-celler ble isolert som beskrevet i del 4 av protokollen, og splenocytter bare ble oppnådd ved å lysere de røde blodcellene som beskrevet i avsnitt 3.3.
Følsomheten av celletypespesifikke metabolske analyser avhenger av levedyktighet og renhet av utgangs-cellepopulasjon. Derfor, for å kontrollere levedyktigheten til de isolerte mus-T-celler, miltceller, og B-celler, og renheten av T- og B-celler, små porsjoner av celler ble farget for flowcytometrisk analyse (Figur 2). I frem scatter-området vs. side scatter-området (FSC-A versus SSC-A) plot, lymfocytter ble inngjerdet, og innenfor denne porten, befolkningen langs diagonalen i fremre scatter-haut (FSC-H) vs. FSC-A tomten ble bestemt som sing. Innenfor sing befolkningen, ble levedyktighet målt ved gating cellene som farget negativt for live / dead markør (figur 2A); T-celle-levedyktighet var 97,9%, splenocytt levedyktighet var 92%, og B-celle-levedyktighet var 94%. B-celle renhet, målt ved B220 + CD19 + -populasjonen 26, var 99%, mens CD4 + T-celle-renheten, målt ved CD44 - CD4 + populasjonen 27, var 98,3% (figur 2B).
Proteinkonsentrasjonen av cellelysatet kan brukes som en direkte indikator på belagt celleantall.
Isolerte lymfocytter og splenocytter ble platet ut i et klebemiddel-belagte 96-brønners analyseplate på 5 x 10 5 celler / brønn, 2,5 x 10 5 celler / brønn, 1,25 x 10 5 celler / brønn, og 0,625 x 10
Mitokondrie og glykolytiske stress analyser er avhengig belagt celle nummer.
OCR ble målt for hver celletype og pletteringstetthet i det ekstracellulære fluks analysator. Som forventet, høyere celletall har en høyere målt OCR, så vel som mer dramatisk respons til oligomycin, 2,4-DNP, og antimycin A / rotenon (figur 4A). Standardisering OCR målinger for hver prøve er proteinkonsentrasjon viser at generelt større antall celler vil føre til mer nøyaktige målinger OCR. Plating på 5 og 2,5 x 10 5 celler / brønn resulterte i lignende normaliserte OCR målinger i T-celler og splenocytes, og 5 og 1,25 x 10 5 celler / brønn resulterte lignende norm OCR målinger i B-celler (figur 4B). De små forskjeller i den normaliserte B-celle-OCR-målinger kan være en indirekte indikasjon på at B-celler som gir bedre resultater ved 2,5 x 10 5 celler / brønn i forhold til andre celletettheter. Ved alle tiltak, ga 0,625 x 10 5 celler / brønn suboptimale resultater, som viser at dette plating tettheten er utilstrekkelig. Baseline respirasjon, proton lekkasje, maksimal mitokondrie respirasjon, ikke-mitokondrie respirasjon, og ATP produksjon lineært korrelert med plating tettheter for alle celletyper (Figur 4C). Dessuten, det meste av grunnlinjen åndedrett brukes til å syntetisere ATP, som indikert ved den lave proton lekkasje i de tre celletyper. Mens hovedfokus mitokondrie stresset eksperimentet er å måle endringer i OCR, er ECAR likevel nyttig å ta opp for å sikre at analysen ble vellykket gjennomført. I likhet med OCR, de to høyere plating tettheter resulterte i høyere ECAR og mer dramatiske tiltak for å oligomycin, 2,4-DNP, og antimycin A / rotenon (Figur 4D). Den dramatiske endringer i ECAR ved tilsetning av 2,4-DNP, og antimycin A / rotenon kan skyldes endringer i respirasjon, i tillegg til endringer i glycolysis, ettersom CO 2 som genereres i den TCA-syklusen blir omdannet til HCO 3 - og H +. Dette problemet har nylig blitt adressert, og det finnes en enkel metode for å korrigere den totale ekstracellulære forsuring signal ved hjelp av oksygenforbruk data, for å få den virkelige glycolytic rente 12,29.
Den glykolyse stresset analysen var mest vellykket på det høyeste plating tettheten (figur 5A, B). I alle celletyper, de 5 x 10 5 celler / brønn prøver hadde de største endringene i ECAR etter tilsetning av glukose, oligomycin, og 2-DG (figur 5B). I tillegg normalisering til proteinkonsentrasjonen vist at for alle celletyper, de 5 x 10 5 celler / brønn prøvene ga optimale resultater, mens lavere konsentrasjoner-spesielt 0,625 x 10 5 celler / godt ikke vise en robust glycolytic reservekapasitet. Non-glycolytic forsuring, glykolyse, og tilsynelatende glycolytic kapasitet lineært korrelert med plating tettheter for alle celletyper (figur 5C). For glykolyse spenning eksperimentet viser OCR graf som glukose litt stimulerer mitokondriell respirasjon, som deretter inhiberes ved oligomycin behandling; tilsetning av 2-DG påvirket ikke OCR (figur 5D). OCR-grafen kan benyttes som en ytterligere indikator på at glykolysen spenning forsøket ble vellykket utført. Dessuten kan OCR grafen brukes til å korrigere den ECAR grafen, hvis nødvendig, som forklart ovenfor i tilfellet med den mitokondrielle stresstest 12,29.
Figur 1:. Outline av ekstracellulære flux analyser (A) Illustrasjon av glykolyse (til venstre) og oksidativ fosforylering (til høyre) som viser virkningen avmetabolske stoffer som brukes i de ekstracellulære flux analyser. (B) Skjematisk av ekstracellulære forsuring rate (ECAR) graf; skjematisk av oksygenforbruk rate (OCR) graf (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Trinnvis gating av T-celler, B-celler og miltceller for å bestemme levedyktigheten og renhet Strømningscytometri plott som viser levedyktigheten av T-celler, miltceller, og B-celler (A); og renhet av T- og B-celler (B). Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av ther figur.
Fig. 3: Celle konfluens korrelerer med lysat proteinkonsentrasjoner av hver celletype ved forskjellige plette tettheter (A) Lys mikrografer av cellene i analyseplatebrønner ved plette densiteter i området fra 5 x 10 5 celler / brønn til 0,625 x 10 5 celler / godt. Skala barer betegne 50 mikrometer. (B) lysat proteinkonsentrasjoner på forskjellige plette tettheter, som målt ved BCA-analyse. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Mitochondrial spenning assay. Rå (A) og standardisert (B) OCR for hver celletype og pletteringstetthet er vist. (C) celle nummer avhengige endringer i nivåene av grunnlinjen, maksimal mitokondrie og ikke-mitokondriell respirasjon, så vel som oksygenforbruk knyttet til proton lekkasje eller ATP produksjon, er vist for hver celletyper. (D) Raw ECAR verdier hentet fra mitokondrie stresstestene er vist. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av 7-8 brønner med standardavvik. Merkede piler betegne injeksjoner av oligomycin (O), 2,4-DNP (D), og rotenon / antimycin (R / A). Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
_upload / 54918 / 54918fig5.jpg "/>
Fig. 5: glykolytiske spenning assay Raw (A) og standardisert (B) ECAR for hver celletype og pletteringstetthet er vist. (C) celle nummer avhengige endringer i ECAR for ikke-glycolytic forsuring, glukose-indusert glykolyse og total glycolytic kapasitet vises. (D) Raw OCR verdier hentet fra glycolytic stresstestene er vist. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av 7-8 brønner med standardavvik. Merkede piler betegne injeksjoner av glukose (G), oligomycin (O), og 2-deoksyglukose (2-DG). Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen vi utviklet tillatt for effektiv isolering av ren og levedyktig lymfocytt-undergrupper, som deretter ble brukt i ekstracellulære fluks analyse ved forskjellige konsentrasjoner for å evaluere forskjellene i glykolysen og mitokondriell respirasjon ytelse. Denne protokollen er utformet spesielt for lymfocytter og tar for seg spesielle hensyn knyttet til disse celletyper, slik som lav basal metabolsk aktivitet, skjørhet, lav frekvens, og deres manglende evne til å følge analyseplater. Derfor, sammenlignet med tidligere publiserte protokoller 11,12, vår metoden gir en mer praktisk og bedre optimalisert guide for forskere som arbeider innen immunologi. Det er flere viktige skritt i denne protokollen, inkludert å få rene og levedyktige cellepopulasjoner, plating cellene ved optimal samløpet, og standardisere ekstracellulære flux analyse målinger til proteinkonsentrasjonen i hver brønn.
det jegnitial antall celler belagt kan begge bli visualisert ved lysmikroskopi og også kvantifiseres ved å bruke proteinkonsentrasjonsmålinger. Den lineære sammenhengen mellom mobilnummer og proteinkonsentrasjonen bekreftet at proteinkonsentrasjonen kan faktisk brukes som en måte å standardisere virkningene av endringer i celle tall mellom ulike brønner.
Ved å standardisere ECAR og OCR resultater til proteinkonsentrasjoner, viste vi at, til tross for lavere celle konfluens, så få som 2,5 x 10 5 celler / brønn kunne anvendes i de fleste analyser uten at kvaliteten av dataene. Imidlertid er den nedre grense av celler som kan anvendes varieres mellom celletyper og analyser. For eksempel, mens så lite som 1,25 x 10 5 celler kan brukes for B-celle-OCR-målinger, og med 2,5 x 10 5 celler / brønn var ikke nok til å vurdere den glykolytiske resultatene av den samme celletype. Derfor, så lenge som celle nummer er ikke en begrensende faktor, belagt ved spissen90% samløpet, tilsvarer omtrent 5 x 10 5 lymfocytter / brønn, er å foretrekke. Videre optimalisering kan bli nødvendig når celler av forskjellige størrelser, for eksempel på forhånd er aktivert og delvis differensierte lymfocytter-er brukt. I tillegg, ved bruk av tidligere dyrkede primære lymfocytter, kan det være en variasjon i cellenes levedyktighet mellom forskjellige behandlingsbetingelser, noe som ville redusere påliteligheten av proteinkonsentrasjonen som et mål på celletallet siden døde eller døende celler kan også bidra til de målte proteinnivåene . I slike tilfeller kan det være nyttig å sortere levende celler ved flowcytometri før du utfører de ekstracellulære flux analyser.
I våre analyser ved hjelp av ferskt isolerte og svært levedyktige lymfocyttpopulasjoner, fikk vi pålitelige funksjonelle data for både OCR og ECAR målinger. Mens alle celletyper oppførte seg på samme måte i den mitokondrielle stresstesten, slående forskjeller mellom celletyper varobservert i glykolysen stresstest. For eksempel, glycolytic utførelsen av naive T-celler var lav i forhold til splenocytes eller B-celler, og det ble ikke endret med tillegg av oligomycin. Denne observasjonen er i tråd med tidligere publiserte studier 7,30, noe som bekrefter gyldigheten av vår protokoll.
Som konklusjon, vår fremgangsmåte gir en effektiv og enkel måte å teste den metabolske aktiviteten av lymfocytter ved hjelp av et ekstracellulært fluks analysator, og det kan være nyttig i et bredt utvalg av immunologiske studier utforske de metabolske forandringer i immunceller når disse aktiveres, celledifferensiering eller på grunn til sykdoms fenotyper som infeksjon, autoimmunitet og hematologisk kreftsykdom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
| Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
| RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
| L-Glutamine 200 mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
| HEPES 1 M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
| Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
| Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
| CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
| B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
| Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
| MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
| autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
| autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis. |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
| Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
| Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak. |
References
- Motz, G. T., Coukos, G. Deciphering and reversing tumor immune suppression. Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).
- Akkaya, M., Barclay, A. N. How do pathogens drive the evolution of paired receptors? Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).
- Dinarello, C. A. Proinflammatory cytokines. Chest. 118 (2), 503-508 (2000).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454 (2013).
- Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. Metabolic pathways in T cell fate and function. Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).
- Doughty, C. A., et al. Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth. Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).
- Caro-Maldonado, A., et al. Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells. J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
- Klein, A. B., et al. Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function. J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).
- Hsueh, R. C., et al. Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes. AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).
- Zambrano, K., et al. Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes. Biotechnol Prog. , (2016).
- Costa, G. L., et al. Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease. J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis. J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9 (2001).
- Akkaya, B., et al. A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry. J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).
- Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).
- Wick, A. N., et al. Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose. J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase system. Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).
- Terada, H. Uncouplers of oxidative phosphorylation. Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).
- Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PLOS ONE. 11 (3), e0152016 (2016).
- Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. 3rd Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping. J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).
- Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment. Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).
