Abstract
Лимфоциты реагируют на различные раздражители, активируя внутриклеточные пути передачи сигналов, которые, в свою очередь, приводит к быстрому клеточной пролиферации, миграции и дифференцировки и продукции цитокинов. Все эти события тесно связаны с состоянием энергии клетки, и, следовательно, изучая производящие энергию пути могут дать подсказки о общей функциональности этих клеток. Внеклеточного анализатор потока является широко используемым устройством для оценки эффективности гликолиза и митохондриального дыхания во многих типах клеток. Эта система была использована для изучения иммунных клеток в течение нескольких опубликованных отчетах, тем не менее комплексный протокол оптимизировано особенно для лимфоцитов отсутствует. Лимфоциты являются хрупкими клетки , которые выживают плохо в условиях бывших естественных условиях. Oftentimes субпопуляций лимфоцитов являются редкими, и работать с низким числом клеток неизбежно. Таким образом, экспериментальная стратегия, которая решает эти трудности требуется. Здесь мы приводим протоколчто дает возможность быстрого выделения жизнеспособных лимфоцитов из лимфоидных тканей, а также для анализа их метаболических состояний в внеклеточной анализатора потока. Кроме того, мы предоставляем результаты экспериментов, в которых сравнили метаболические активности нескольких подтипов лимфоцитов при различных плотностях клеток. Эти наблюдения указывают на то, что наш протокол может быть использован для достижения согласованных, хорошо стандартизованные результаты даже при низких концентрациях клеток, и, таким образом, она может иметь самое широкое применение в будущих исследованиях, посвященных характеристике метаболических событий в иммунных клетках.
Introduction
Иммунный ответ против антигенов является жестко регулируется баланс между активацией иммунной системы и ослабление иммунной системы. Активация иммунной системы приводит в быстрой пролиферации и миграции клеток, а также продукцию цитокинов, секреции антитела и повышенную фагоцитоз в ответ на стимуляторы, в то время как подавление иммунитета просто подавляет эти события и , следовательно , имеет важное значение в предотвращении ненужных иммунных реакций 1-6. Недавние исследования показали , что прямая связь существует между состоянием активации иммунных клеток , а также активность различных метаболических путей 7. Иммунные клетки могут переключаться между покоящихся и активированных состояний за счет перехода производства энергии путей включения и выключения. Кроме того, было обнаружено, что различные типы иммунных клеток, могут использовать различные метаболические стратегии, чтобы питать их повышенные потребности в энергии во время активации. Например, в то время как активация Т - лимфоцитов направляет клетки в почти полностью гликолитического состоянии 8 9,10. Эти исследования указывают на важность изучения влияния активации иммунных клеток на клеточный метаболизм.
В режиме реального времени, одновременное измерение скорости потребления кислорода (OCR) и внеклеточный скорости подкисления (РВЦА), в качестве показателей окислительного фосфорилирования и гликолиза, является общей стратегией для решения состояния производства энергетических путей 11-13. Для того, чтобы достичь этого, внеклеточный анализатор потока, такие, как конек XF 96, обычно используется. Такой инструмент может быстро сравнить изменения в OCR и РВЦА для разных типов клеток или при различных условиях стимуляции. До сих пор различные типы клеток, в том числе иммунные клетки, были изучены с использованием этих устройств. Тем не менее, оптимизированный протокол, специально предназначенные для иммунных клеток, не доступно.
Иммунные клетки, в частности, лимфоциты, отличаются друг от OTее типы клеток в несколько критических путей. Лимфоциты являются хрупкими клетки , которые не выживают в течение длительного времени в условиях 14-16 бывших естественных условиях. Это еще больше проблемой, когда они культивируют в неоптимальным питательная среда не хватает необходимых питательных веществ, таких, как те, которые используются во внеклеточном анализе потока. В отличие от макрофагов и многих клеточных линий, лимфоциты не прилипают к пластиковой поверхности; Поэтому крайне важно, чтобы присоединить их к анализу пластины без генерирования напряжения. Наконец, некоторые субпопуляции лимфоцитов могут быть крайне редко и сбор их в необходимых количествах, оптимальных может быть сложной задачей 17-19.
Здесь мы предоставляем оптимизированный протокол, который специально разработан для лимфоцитов. Используя спленоцитов, лимфоциты и наивные CD4 + Т - лимфоциты , выделенные из селезенки мыши и лимфатических узлов 20, мы показываем характеристики их состояния покоя гликолиза и окислительного фосфорилирования в диффереплотности Т-клеток. Данные были нормализованы, чтобы учесть различия в начальных числа клеток для каждой лунки с помощью измерения концентрации белка клеточных лизатов конца анализе, которые прямо пропорциональны числа клеток. Наш протокол обеспечивает не только руководящие принципы для быстрого выделения жизнеспособных лимфоцитов внеклеточных анализов потока, но он также позволяет работать при субоптимальных концентрациях клеток без ущерба для качества данных.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом животного LIG-4, который был одобрен по уходу и использованию комитета NIAID животного происхождения.
1. Приготовление реагентов
- Подготовка магнитной сепарации (MS) буфера: PBS (рН 7,2) с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 2 мМ ЭДТА или автоматическим раствором разделительного с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Стерильный фильтр (0,22 мкм) и хранить при температуре 2-8 ° C.
- Готовят RF10 среду: среду RPMI 1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкМ стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкМ 2 -mercaptoethanol, 10 мМ HEPES. Используйте стерильные реагенты. Стерильный фильтр и хранить при температуре 2-8 ° C.
- Подготовить митохондриальную стресс-теста среды: XF базовую среду, дополненную 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина и 25 мМ глюкозы.
- Подготовка гликолиза стресс-теста среды: XF базовые средние линии ДополниTed 2 мМ L-глутамина.
- Доводят рН как митохондрии и гликолиза стресс испытательной среды до 7,4, стерильный фильтр и хранят при температуре 2-8 ° C. Теплые средства массовой информации до 37 ° С и повторно отрегулировать рН перед использованием (проводить измерения рН при 37 ° С).
Примечание: Использование XF среды, которая испытывает недостаток бикарбоната, имеет решающее значение. Так как атмосфера в внеклеточной анализатора потока содержит только окружающий СО 2, любой бикарбонат в среде, после связывания с протонами , выпущенных в качестве побочного продукта гликолиза, диссоциирует с образованием СО 2 и воду. CO 2 будет дегазацию в ходе эксперимента, в результате чего дрейфует в рН , что бы затенить гликолитическую сигнал подкисления. - Подготовка олигомицином: Подготовка 10 мМ исходного раствора в ДМСО; хранить при -20 ° С.
- Подготовьте 2,4-DNP: Подготовьте 1 М исходного раствора в ДМСО; хранить при -20 ° С.
- Подготовка антимицина А: Подготовка 10 мМ исходного раствора в ДМСО; хранить при -20 ° С.
- Подготовка ротенон: Подготовьте 10 мм · сTock раствор в ДМСО; хранить при -20 ° С.
- Готовят глюкозу: Растворить глюкозы в тест-гликолиз стресс среде с образованием 250 мМ раствора; подготовить свежие перед каждым экспериментом и не замерзают.
- Подготовьте 2-DG: Растворить твердое вещество 2-DG в тесте гликолиза стресс среде с образованием 500 мМ раствора; подготовить свежие перед каждым экспериментом и не замерзают.
2. Сбор селезенки и лимфатических узлов у мышей
- Эвтаназии мышь СО 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков.
- Спрей мышь с 70% этанола.
- Для последующего выделения Т-клеток, урожай селезенки, поверхностный шейки матки, поверхностный / глубокий подмышечных, нижней челюсти, паховых и мезентериальных лимфатических узлов.
- Для последующего выделения В-клеток, урожай только селезенка.
Примечание: Используйте шкаф биобезопасность и не держать извлекали органы в PBS или RF10 средах на льду до обработки. Использование стерильных лабораторного оборудования и стерильной техники для обработки всех и IsolAtion шаги. Храните все буферы и средства массовой информации на льду для повышения эффективности изоляции и уменьшить гибель клеток.
3. обработка ткани
- Поместите 70 мкм клеточный фильтр с более коническую трубку емкостью 50 мл и переносят органы на сетчатый фильтр. Для выделения Т-клеток, объединить все органы и B передачи изоляции клеток только в селезенке.
- С помощью плунжера из стерильной 3 мл шприца, пюре из ткани через сито. Во время затирания, убедитесь, что фильтр и органы влажные во все времена и смочить их в соответствии с требованиями добавления MS буфера. Это будет держать как жизнеспособность клеток с высоким и предотвратить засорение фильтра.
- После затирания, нанесите 5-10 мл буфера MS к фильтру, чтобы увеличить восстановление клеток. Центрифуга суспензии при 400 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. (Выполнить все дальнейшие центрифугировани в этих условиях, если не указано).
- Слейте жидкость и ресуспендируют осадок в 5 мл ACK красных кровяных буфера для лизиса клеток. INCUBATE в течение 5 мин на льду, чтобы лизировать красные кровяные клетки (эритроциты должны быть удалены, так как они мешают магнитной сепарации). Добавьте 10-20 мл MS буфера и центрифуги.
- Поместите фильтр кювету толщиной 30 мкм в течение 15 мл коническую пробирку и простое его с 1 мл MS-буфера (эта фильтрация будет удалить мусор из эритроцита лизиса). Декантируют жидкость из центрифугированных трубки, ресуспендируют осадок в 5 мл MS-буфера и передать его через фильтр. Промыть исходной трубки с 4 мл буфера MS, чтобы увеличить восстановление клеток, и использовать это, чтобы промыть фильтр.
- С помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток, определяют общее количество клеток. Этот номер ячейки будет использоваться для определения количества магнитных реагентов требуемое расстояние в Разделе 4. Если спленоциты, которые будут использоваться в последующем внеклеточном потока анализа, выделить необходимое количество ячеек в это время.
- Центрифуга суспензии и приступить к магнитной сепарации. Ресуспендируют спленоциты не используетсядля выделения клеток В в 5 мл RF10 и держать на льду до внеклеточной потока анализа.
4. Магнитное разделение В - клеток и наивные CD4 + Т - клеток
- Определить необходимые объемы коктейля биотин-антитело, анти-биотин микрогранул и MS буфер. Используйте следующие объемы для 10 8 клеток в качестве ориентира и масштабировать вверх или вниз по мере необходимости.
Примечание: Инкубируйте образцы в холодильнике, а не на льду, так как инкубирование на льду может привести к снижению эффективности связывания антител и более длительное время инкубации может потребоваться.
| Реагенты для наивного разделения CD4 + Т - клеток | Объем 10 8 клеток |
| (масштабирование соответствующим образом ) | |
| Биотин-антитело коктейль | 100 мкл |
| MS буфер для первой инкубации | 400 мкл |
| Анти-биотин микросферы | 200 мкл |
| CD44 микросферы | 100 мкл |
| MS буфер для второй инкубации | 200 мкл |
| Выдержите биотин-антитело коктейль и клеток при температуре 4 ° С в течение 5 мин. Добавить анти-биотин микрогранулы, микрогранулы CD44, МС буфера и инкубируют при 4 ° С в течение 15 мин. | |
Таблица 1: объемы изоляции Т - клеток и инструкции.
| Реагенты для разделения В - клеток | Объем 10 8 клеток |
| (масштабирование соответствующим образом ) | |
| Биотин-антитело коктейль 100 мкл | |
| MS буфер для первой инкубации | 400 мкл |
| Анти-биотин микросферы | 200 мкл |
| MS буфер для второй инкубации | 300 мкл |
| Выдержите биотин-антитело коктейль и клеток при температуре 4 ° С в течение 15 мин. Добавьте соответствующий объем биотин-антитело коктейль и MS буфера, и инкубируют смесь при температуре 4 ° С в течение 15 мин. Добавьте соответствующий объем анти-биотин микрошариков и МС-буфера и инкубировать смеси при температуре 4 ° С в течение 15 мин. После второй инкубации, заполнить трубку с MS буфера и центрифуге. | |
Таблица 2: объемы изоляции В - клеток и инструкции.
- Ресуспендируют осадок в буфере MS: 500 мкл для ручного разделения, 3-4 мл для автоматического разделения.
- Продолжайте либо с ручным или автоматизированным разделенийследующим образом:
- Руководство Разделение:
- Вставьте колонку LS в магнит для разделения, поместите стерильные 15 мл коническую трубку ниже, чтобы собрать поток через и премьер-колонки путем промывки 3 мл буфера MS. Откажитесь от потока через.
- Передача клеточной суспензии на загрунтованную колонку LS и дать ему возможность пройти; мыть используемую трубку во время инкубации с 3 мл MS буфера и передают это через колонку, а также. Элюат содержит очищенные клетки. Для выделения В-клеток, проходят очищенные клетки через колонку второй раз в новый 15 мл пробирку, и повторить стадии промывки. Это приведет к увеличению чистоты и выхода.
- Автоматизированная Разделение:
- Включите автоматический разделитель и проверить уровни рабочего буфера, полоскание раствора и 70% этанола. Убедитесь в том, что отходы пуст перед началом разделения.
- Выберите соответствующий охлажденный стойку в зависимости от размера трубки Тон неочищенная образца (например, 15 мл). Для того, чтобы сохранить клетки жизнеспособные в течение всего процесса сепарации, используют стеллажи, которые были предварительно охлажденной при температуре 2-8 ° С в течение 3-4 ч, или до тех пор, пока охлаждающая жидкость становится твердым.
- Установите охлажденную стойку на стадии образца автоматического сепаратора.
- Поместите пробирку образца в слот A1, трубу для отрицательной фракции в слот-B1, и трубку для положительной фракции в С1. Если сбор более одного образца, разместить дополнительные трубки в следующих колонках (А2, В2, С2 и т.д.).
- Выберите вкладку разделения на сенсорном экране, и указывают на расположение труб на стойке. В меню разделения, выберите программу "истощает" и завершить цикл программы с соответствующим типом стирки (см примечание ниже).
ПРИМЕЧАНИЕ: Программа "истощает" осуществляет истощение, используя наиболее чувствительный режим машины, которая приоритизирует чистоту. Кроме того, существуют три различных варианта мытья: QuicК полоскание, полоскание, и сон. Если образцы из одного источника и должны быть объединены, выберите быстрое полоскание. Если образцы должны храниться отдельно, выберите полоскание. Выберите опцию сна, если никаких дополнительных обособления не будет проводиться в тот же день, и если машина будет выключался после изоляции - Начать выделение, нажав кнопку "Выполнить" и подтвердить уровень буфера при появлении соответствующего запроса. После того как программа закончилась, негативная фракция будет содержать очищенные клетки.
- Заполните коническую трубку до 15 мл с MS буфера и центрифуге.
- Слейте МС буфера и ресуспендирования клеток в 5 мл RF10 средах. Держите клетки на льду до внеклеточной потока анализа.
Примечание: В идеале, внеклеточный анализ потока следует проводить сразу же после выделения. Тем не менее, в предварительных экспериментах не было обнаружено существенных различий в результатах анализа в клетках, используемых в течение 3 ч изоляции по сравнению с свеже-изолированные энергосистемы.
- Руководство Разделение:
Примечание: Протокол указано здесь для формата 96-луночного прибора. Объемы должны быть скорректированы, если используется другой формат.
- Гидратация датчика картриджа
- Поднимите картридж датчика, заполнить каждую лунку полезной пластины с 200 мкл раствора калибрующего и опустите картридж датчика на сервисный пластину, погружая датчики в растворе калибрующего.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что уровень калибрующего раствора достаточно высока, чтобы держать датчики под водой. Картридж укрывает флуорофоры , связанные с O 2 и H + для каждой лунки; они должны быть гидратированных для того, чтобы они работали должным образом. - Поместите картридж в 37 ° С инкубатор не дополненной СО 2 или кислорода / азота. Выполнить все дальнейшие инкубацию в этих условиях, если не указано. Выдержите картридж в течение ночи, чтобы увлажнять.
- Поднимите картридж датчика, заполнить каждую лунку полезной пластины с 200 мкл раствора калибрующего и опустите картридж датчика на сервисный пластину, погружая датчики в растворе калибрующего.
- ДГОданию пластин с адгезивным покрытием
- Приготовьте 2,5 мл 22,4 мкг / мл клеевого раствора в 0,1 М раствором бикарбоната натрия, рН 8,0 (бикарбонат обеспечивает оптимальный рН клеевой адсорбции).
- Применяют 25 мкл раствора в каждую лунку планшета для анализа, и инкубируют на скамье при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Отберите клей и промойте каждую лунку дважды с использованием 200 мкл стерильной воды. Подождите, пока лунки не высохнут перед посевом клеток.
- Посев клеток в адгезивным покрытием пластин
- Центрифуга клетки при комнатной температуре при 200g в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 5 мл соответствующей среды для анализа (смотри выше для формулирования митохондриальной стресса и глюкозы стресс-носителей). Центрифуга клетки снова и ресуспендируют в нужной концентрации в среде для анализа (объем ресуспендирования будет варьироваться в зависимости от концентрации, в каждую лунку будет содержать 180 мкл клеточной суспензии).
Примечание: До тех пор, как соответствующие средства массовой информации и анализа соединенияs используются, внеклеточный анализатор потока может одновременно запустить митохондриальных и гликолиза стресс-тесты на том же планшете. - Пластина 180 мкл суспензии клеток в каждую лунку. Используйте скважины A1, A12, H1 и H12 для фоновой коррекции температуры: добавить 180 мкл среды для анализа в этих скважинах (без клеток).
- Инкубируйте пластины в течение 25 мин при 37 ° С.
- Центрифуга пластину при 200g в течение 5 мин, без тормоза, чтобы гарантировать, что все клетки полностью присоединены. Визуально подтверждают, что клетки, стабильно приклеиваться к поверхности культуры, образуя монослой, рассматривая под микроскопом. Перенос пластины обратно в инкубатор еще в течение 30 мин.
- Центрифуга клетки при комнатной температуре при 200g в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 5 мл соответствующей среды для анализа (смотри выше для формулирования митохондриальной стресса и глюкозы стресс-носителей). Центрифуга клетки снова и ресуспендируют в нужной концентрации в среде для анализа (объем ресуспендирования будет варьироваться в зависимости от концентрации, в каждую лунку будет содержать 180 мкл клеточной суспензии).
- Получение 10х концентрации соединений, и загрузка инжекторных портов
- Для проведения теста на митохондриальный стресс, подготовить 2,5 мл каждого из 10 мкМ олигомицином, 1 мМ ДНП, и смеси 10 мкМ ротенону и 10 мкМ антимицина А, все в митохондриальной стресс анализа mediuм.
Примечание: Концентрация 2,4-DNP основано на ранее опубликованных исследований, 21 это общий принцип , но концентрация разобщитель для каждого типа клеток , используемых должен определяться исследователем. - Для стресс-теста гликолиза, подготовить 2,5 мл каждого из 250 мМ глюкозы, 10 мкМ олигомицином и 500 мМ 2-дезоксиглюкозы (2-DG) в гликолиза стресс среде для анализа.
- Теплые 10х растворы до 37 ° С, и доведения рН до 7,4.
- Загрузите соединения в соответствующие инжекторных порты картриджа с использованием многоканального микропипетки и направляющие загрузки, следующим образом:
Таблица 3: Составные тома.порт Митохондриальная стресс Анализ Гликолиз стресс Анализ 20 мкл олигомицином 20 мкл глюкозы В 22 мкл 2,4-DNP 22 мкл олигомицином С 25 мкл антимицину A / ротенон 25 мкл 2-DG
Примечание: В каждой серии портов (например, все порты A) должны содержать один и тот же объем. Очень важно, что все скважины в данной серии загружаются, даже те, которые не используются в эксперименте, в противном случае соединения не будет вводиться (порты в неиспользуемых скважин могут быть загружены с таким же объемом среды для анализа). - Выдержите картридж при установке программы.
- Для проведения теста на митохондриальный стресс, подготовить 2,5 мл каждого из 10 мкМ олигомицином, 1 мМ ДНП, и смеси 10 мкМ ротенону и 10 мкМ антимицина А, все в митохондриальной стресс анализа mediuм.
- Настройка внеклеточного Flux Пробирной Протоколы
- Настройте следующую программу (таблица 4).
Таблица 4: макет программы.шаг петля калибровка - уравновешивание - Исходные показания 3 раза: Смешайте 3 мин, подождите 0 мин, 3 мин мера Конец цикла - Вводят Порт A - измерения 3 раза: Смешайте 3 мин, подождите 0 мин, 3 мин мера Конец цикла - Вводят Порт B - измерения 3 раза: Смешайте 3 мин, подождите 0 мин, 3 мин мера Конец цикла - Вводят Порт C - измерения 3 раза: Смешайте 3 мин, подождите 0 мин, изме 3 мин Конец цикла - Конец программы -
Примечание: При определенных условиях, например, при использовании активированных клеток, подкисление может продолжаться дольше , чем в наивных клеток. По этой причине может возникнуть необходимость расширить "ждать" раз в вышеуказанной программе или повторить каждый цикл измерения несколько раз. - Начните программу. После этапа калибровки, замените калибрующего пластину на планшет для анализа (при запросе).
Примечание: С помощью программного обеспечения, можно указать группы скважин, которые имеют аналогичные условия. Кроме того, крайне важно, чтобы указать, какие скважины являются контрольные лунки (в данном протоколе, они четыре угла пластины) и указать, какие колодцы пусты. Для более детального, шаг за шагом, протокол для настройки аппарата и егоs программного обеспечения, веб-сайт производителя следует проводить консультации.
- Настройте следующую программу (таблица 4).
- Измерение содержания белка
- Удалите остатки среды для анализа из каждой лунки, не нарушая клетки.
Примечание: Если это не так удобно, чтобы продолжить анализе концентрации белка, то можно заморозить всю пластину при -20 ° С до анализа. Если заморожен, разморозить, прежде чем продолжить. - Приготовьте 1x раствор ингибиторов протеазы (100x паи) в RIPA лизиса среде (достаточный для 50 мкл / лунку).
- Добавьте 50 мкл РИПА лизиса среду, дополненную с ингибиторами протеазы в каждую лунку. Перемешивайте пластину на шейкере в течение 5 мин, а затем инкубировать пластину на льду в течение 30 мин до полного Лизируйте клеток.
- Спин планшет при 200g в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы довести содержание липидов и других молекул в нижней части пластины таким образом, чтобы они не мешали при анализе бицинхониновой кислоты (ВСА).
- Измерение концентрации белка с помощью ВСА анализа в соответствии с производителем &# 39, S рекомендации.
- Удалите остатки среды для анализа из каждой лунки, не нарушая клетки.
Representative Results
Эукариотические клетки используют интегрированную сеть гликолиза, трикарбоновых кислот (TCA) цикл, и окислительного фосфорилирования, чтобы удовлетворить большинство своих энергетических потребностей и обеспечения промежуточных продуктов, необходимых для роста и пролиферации клеток. Эти пути начинаются с внутриклеточным отлова свободной глюкозы в виде глюкозо-6-фосфат, который впоследствии, обрабатывается в пируват. Пируват либо пониженной лактата или транспортируются в митохондрии, где она образует ацетил-кофермент А (КоА). Ацетил-СоА затем входит в цикл трикарбоновых кислот. Высокоэнергетические промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот в движение движение электронов в цепи переноса электронов (ETC), которая , в свою очередь , выгоняет H + из митохондриального матрикса для генерации H + градиент во внутренней митохондриальной мембране. Кислород действует в качестве конечного акцептора электронов, а H + вернуться обратно в митохондриях через F O / F <суб> 1 комплекс, где их потенциальная энергия используется для генерации АТФ (Фигура 1А).
Рабочий принцип внеклеточной потока анализа зависит от вмешательства в гликолиза и окислительного фосфорилирования в определенных точках, а также оценка получаемых эффектов. Для этой цели мы использовали глюкозу для распространения гликолиз в голодающих клеток, а также 2-дезоксиглюкозы (2-DG), который затем превращают в 2-дезоксиглюкоза-6-фосфата, конкурентного ингибитора phosphoglucoisomerase 23, гексокиназой, для того , чтобы блокировать гликолиза. Ротенон (комплекс ингибитор I , специфической и т.д.), антимицина А (комплекс III-специфическим ингибитором и т.д.), олигомицином (ингибитор АТФ - синтазы 24), и разобщение агент 2,4-dinotrophenol (ДНФ) 25 были использоваться для вмешательства конкретных событий , связанных с электронного транспорта, протонный градиент и синтез АТФ (Рис . 1А) Вместо 2,4-ДНФ, карбонильная КДМNide-4- (трифторметокси) фенилгидразон (FCCP) также могут быть использованы, но может потребоваться дальнейшей оптимизации. В любом случае, разобщители всегда следует титровать для определенного типа клеток перед использованием, чтобы определить оптимальную концентрацию, необходимую.
Тест гликолиз стресс (Фигура 1В) начинается с базовым измерением внеклеточной скорости подкислением (РВЦА) , в предварительно голодавших клеток. Так как эти клетки при их базальной минимуму, и, следовательно, может быть практически рассматриваться как не гликолитических, РВЦА измеренная в этой точке, называется не-гликолитического подкисления. Это подкисление вероятно соответствует дыхательная CO 2 генерируется в цикле ТСА превращаются в HCO 3 - и Н +. За этим следует инъекции глюкозы, чтобы активировать гликолиза, который представляет, как увеличение внеклеточного подкисления в связи с образованием лактата.Это увеличение представляет нормальную скорость гликолиза. Клетки затем заражали инъекции олигомицином, который блокирует генерирование АТФ путем окислительного фосфорилирования. Клетки реагируют на это резкое снижение производства АТФ путем активации гликолиза до максимального уровня, и что приводит к увеличению среднего уровня РВЦА (гликолитическая резерв). Испытание прекращается путем полного ингибирования гликолиза с использованием аналога глюкозы 2-DG, который возвращает РВЦА к его не-гликолитического уровне. Интересно отметить , что было предложено , что вопреки рекомендациям производителя, максимальная гликолиз не обязательно достигается путем инъекции олигомицином 26. В клетках с высокой гликолитического емкостью, если не значительное увеличение спроса АТФ, гликолиз может быть вполне в состоянии справиться с потерей митохондриального АТФ без него необходимости быть повышающей регуляции. Гликолитическая курс с олигомицином может быть превзойден добавлением ингибиторов респираторные, Такие как ротенону и myxothiazol, которые обеспечивают несколько преимуществ по сравнению с олигомицином: 1) Они увеличивают спрос АТФ, так как они вызывают реверсирование АТФ - синтазы, с гидролиза АТФ, перекачивать протоны в попытке восстановить митохондриальный мембранный потенциал 26; 2) Они предотвращают дыхательную закисление среды, что может сбить с толку результаты РВЦА (смотрите ниже). Другие способы увеличения АТФ спроса включают добавление соединений , которые стимулируют гидролиз АТФ в плазматической мембране АТФазы 26. Все это следует тщательно продумать исследователями при планировании тест гликолиза стресс.
Тест митохондриальный стресс (рис 1C) начинается с базового измерения скорости потребления кислорода (OCR) в не голодали клеток. За этим следует инъекцией олигомицином, что препятствует возвращению протонов через F O / F 1 комплекса и , таким образом , быстро hyperpolarizэс митохондриальную мембрану. Гиперполяризация предотвращает дальнейшее протон накачки через дыхательные комплексы, а также снижение частоты дыхания. Оставшийся дыхание называется утечка протонов, которая представляет собой поток протонов через липидов или других каналов. Это гиперполяризационная состояние быстро восстанавливается путем добавления разделительным агентом 2,4-ДНФ, который выступает в качестве протонного ионофором. В ответ клетки пытаются восстановить мембранный потенциал в тщетной попытке за счет увеличения скорости транспорта электронов, до максимума, а это, в свою очередь, увеличивает OCR. И, наконец, с добавлением двух ингибиторов и т.д. (антимицина А и Ротенон), митохондриального дыхания полностью останавливается и распознавания уменьшается до самого низкого уровня. На этом уровне, потребление кислорода не связано с митохондриальной активности (не митохондриальная). Разница в OCR, порождаемых этими ингибиторами называется максимальное дыхание митохондрий, которое является суммой базового дыхания и свободной емкости.
В - клетки и наивных CD4 + Т - клетки выделяли , как описано в разделе 4 протокола, и спленоциты просто получали путем лизиса красных кровяных клеток , как описано в разделе 3.3.
Чувствительность метаболических анализов типоспецифичными клеток зависит от жизнеспособности и чистоты исходного популяции клеток. Поэтому, с целью проверки жизнеспособности выделенных Т - клеток мыши, спленоцитов, и В - клеток, а также от чистоты Т- и В - клеток, небольшие аликвоты клеток окрашивали для анализа методом проточной цитометрии (рисунок 2). В рассеяния вперед-области против бокового рассеяния-зоны (FSC-A против SSC-А) участок, лимфоциты закрытого типа, и в пределах этих ворот, население по диагонали в рассеяния вперед-высоты длят (FSC-H) по сравнению с FSC-A участка были определены как синглеты. В популяции синглетного, жизнеспособность измеряли с помощью стробирования клетки , которые окрашивали негативными для живой / мертвой маркера (рис 2А); Жизнеспособность Т-клеток была 97,9%, жизнеспособность спленоцитов составила 92%, а выживаемость В-клеток составила 94%. Чистота клеток B, как измерено с помощью B220 + CD19 + популяции 26, составила 99%, в то время как чистота CD4 + Т - клеток, как измерено с помощью CD44 - CD4 + популяции 27, составила 98,3% (Фигура 2В).
Концентрацию белка клеточного лизата , может быть использован в качестве прямого индикатора плакированной числа клеток.
Изолированные лимфоциты и спленоциты высевали в клеевым покрытием 96-луночный планшет для анализа на 5 х 10 5 клеток / лунку, 2,5 × 10 5 клеток / лунку, 1,25 × 10 5 клеток / лунку, и 0,625 х 10
Митохондриальная и гликолиза СоМаS анализы зависят от гальванического числа клеток.
ОРС измеряли для каждого типа клеток и плотности металлизации во внеклеточной анализаторе потока. Как и ожидалось, более высокие количества клеток имеют более высокий показатель OCR, а также более резкие ответы на олигомицином, 2,4-DNP и Антимицина A / ротенон (фиг.4А). Стандартизация измерений OCR концентрации белка каждого образца показывает, что в общем случае, большее количество клеток приводят к более точные измерения оптического распознавания символов. Покрытие на 5 и 2,5 х 10 5 клеток / лунку в результате аналогичных нормированных измерений оптического распознавания символов в Т - клеток и спленоцитов, а также 5 и 1,25 × 10 5 клеток / лунку привели аналогичные нормированные измерения оптического распознавания символов в В - клетках (рис 4б). Небольшие различия в нормализованной ячейке B измерения оптического распознавания символов может быть косвенным признаком того, что В - клетки работают лучше при 2,5 × 10 5 клеток / лунку по сравнению с другими плотности клеток, По всем параметрам, 0,625 × 10 5 клеток / лунку дал неоптимальные результаты, демонстрируя , что эта плотность покрытия является недостаточным. Базовое дыхание, утечка протона, максимальное митохондриального дыхания, не митохондриального дыхания и АТФ производства линейно коррелирует с плотностью металлизации для всех типов клеток (рис 4в). Кроме того, большая часть базового дыхания используется в направлении синтеза АТФ, как показывает небольшого количества жидкого хладагента протонов в трех типах клеток. В то время как основное внимание митохондриальной эксперимента стресс для измерения изменений в OCR, РВЦА еще полезна для записи, чтобы гарантировать, что анализ был успешно проведен. По аналогии с OCR, две более высокие плотности металлизации привело к увеличению РВЦА и более эффектных ответов на олигомицином, 2,4-DNP и антимицина A / ротенону (Рисунок 4D). Драматические изменения в РВЦА при добавлении 2,4-DNP и антимицина A / ротенону может быть связано с изменением дыхания в дополнение к изменениям в гlycolysis, так как CO 2 генерируется в цикле трикарбоновых кислот превращается в HCO 3 - и Н +. Этот вопрос был недавно обратился, и существует простой способ коррекции суммарного сигнала внеклеточного подкисления , используя данные о потреблении кислорода, чтобы получить реальную скорость гликолиза 12,29.
Анализ гликолиза стресс был наиболее успешным на самой высокой плотностью металлизации (рис 5А, В). Во всех типах клеток, то 5 образцов х 10 5 клеток / лунку имели наибольшие изменения в РВЦА после добавления глюкозы, олигомицином, и 2-DG (Фиг.5В). Кроме того, нормализации концентрации белка показали , что для всех типов клеток, в 5 × 10 5 клеток / лунку образцов дали оптимальные результаты, в то время как более низкие концентрации особенно 0,625 × 10 5 клеток / хорошо не проявляли надежный гликолитическую запас мощности. Non-glycolytiс подкисление, гликолиза, и очевидно гликолитическая емкость линейно коррелирует с плотностью металлизации для всех типов клеток (рис 5в). Для эксперимента гликолиз напряжений, график распознавания текста показывает, что глюкоза немного стимулирует дыхание митохондрий, которая затем угнетается олигомицином лечения; добавление 2-DG не влияет на OCR (Рис 5D). ОРЗ график может быть использован в качестве дополнительного индикатора того, что эксперимент гликолиз стресс была успешно выполнена. Кроме того , график распознавания текста может быть использована для коррекции РВЦА графика, если это необходимо, как было объяснено выше , в случае испытания митохондриальной стресс 12,29.
Рисунок 1:. План внеклеточных анализов потока (А) Иллюстрация гликолиза (слева) и окислительное фосфорилирование (справа) , показывающий действиеметаболические препараты, используемые в внеклеточных анализах флюса. (B) Схема внеклеточного скорости подкисления (РВЦА) графа; Схема скорости потребления кислорода (OCR) графика (C). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 2: Ступенчатое стробирование Т - клеток, В - клеток и спленоцитов для определения жизнеспособности и чистоты проточной цитометрии графики , показывающие , жизнеспособность Т - клеток, спленоцитов, и В - клеток (A); и чистота Т- и В - клеток (В). Результаты представляют по меньшей мере трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию гоэто цифра.
Рис . 3: Cell стечение коррелирует с концентрациями лизат белка каждого типа клеток при различных плотностях металлизации (А) Легкие микрофотографии клеток в анализе лунок планшета при плотности металлизации в диапазоне от 5 × 10 5 клеток / лунку 0,625 × 10 5 клеток / Что ж. Масштабные полосы обозначают 50 мкм. Концентрации белка (В) лизата при различных плотностях гальваническое, как измерено с помощью анализа BCA. Результаты представляют по меньшей мере трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Митохондриальной стресс анализ. Сырье (А) и стандартизированные (В) оптического распознавания символов для каждого типа клеток и плотности металлизации показаны. (С) количество-зависимой клеточно изменения в уровне базовой линии, максимальная митохондриальной и не-митохондриального дыхания, а также потреблений кислорода , связанных с утечкой или протонной АТФ, представлены для каждого из типов клеток. Значения (D) Сырье РВЦА , полученные из митохондриальных стресс - тестов приведены. Каждая точка данных представляет собой среднее 7-8 лунок со стандартным отклонением. Меченые стрелки обозначают инъекции олигомицином (O), 2,4-DNP (D) и ротенон / Антимицина A (R / A). Результаты представляют по меньшей мере трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
_upload / 54918 / 54918fig5.jpg "/>
Рисунок 5:. Гликолитических стресс анализ Сырье (А) и стандартизированные (В) РВЦА для каждого типа клеток и плотности металлизации показаны. (C) номер-зависимой клеточно изменения в РВЦА для не-гликолитического подкисления, гликолиза индуцированной глюкозой и общей мощности гликолитического показаны. Значения (D) Raw OCR , полученные из гликолитических стресс - теста показаны. Каждая точка данных представляет собой среднее 7-8 лунок со стандартным отклонением. Меченые стрелки обозначают инъекции глюкозы (G), олигомицином (O), и 2-дезоксиглюкозы (2-DG). Результаты представляют по меньшей мере трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Протокол мы разработали позволили для эффективной изоляции чистой и жизнеспособной субпопуляций лимфоцитов, которые были впоследствии использованы при внеклеточном анализе потока при различных концентрациях, чтобы оценить различия в гликолиза и митохондриального дыхания производительности. Этот протокол разработан специально для лимфоцитов и рассматриваются особые соображения, связанные с этими типами клеток, таких как низкая базальной метаболической активности, хрупкость, низкой частоты, и их неспособность придерживаться планшеты для анализа. Таким образом, по сравнению с ранее опубликованными протоколами 11,12, наш метод предлагает более удобный и более оптимизированный руководство для исследователей , работающих в области иммунологии. Есть несколько важных шагов в этом протоколе, в том числе получение чистых и жизнеспособных клеточных популяций, металлизированный клетки при оптимальном слияния, и стандартизацию внеклеточные потока измерений для анализа до концентрации белка в каждую лунку.
яnitial количество посеянных клеток может одновременно быть визуализированы с помощью световой микроскопии, а также быть количественно определена с помощью измерения концентрации белка. Линейная корреляция между числом клеток и концентрации протеина подтвердили, что концентрация белка в самом деле может быть использован как способ стандартизировать эффекты изменений в количестве клеток между различными скважинами.
Стандартизируя РВЦА и OCR результаты концентрации белка, мы показали , что, несмотря на более низкую впадения клеток, поскольку лишь немногие , как 2,5 × 10 5 клеток / лунку можно использовать в большинстве анализов без ущерба для качества данных. Тем не менее, нижний предел клеток, которые могут быть использованы варьировалась между типами клеток и анализов. Например, в то время как всего лишь как 1,25 × 10 5 клетки могут быть использованы для измерения В - клеток OCR, даже 2,5 х 10 5 клеток / лунку было недостаточно , чтобы оценить гликолитического производительность того же клеточного типа. Таким образом, до тех пор, как число клеток не является ограничивающим фактором, покрытие на более90% Стечение, что примерно соответствует 5 × 10 5 лимфоцитов / лунку, является предпочтительным. Дальнейшая оптимизация может потребоваться, когда клетки разных размеров, таких, как предварительно активированную и лимфоциты используемых частично дифференцированные. Кроме того, при использовании предварительно культивированных первичных лимфоцитов, могут быть вариации в жизнеспособности клеток между различными условиями лечения, что приведет к снижению надежности концентрации белка в качестве меры числа клеток, так как мертвые или умирающие клетки могут также вносят вклад в измеренные уровни белка , В таких случаях может быть полезным для сортировки живых клеток с помощью проточной цитометрии перед проведением внеклеточные анализов потока.
В наших тестах с использованием свежеизолированных и высоко жизнеспособных популяций лимфоцитов, мы получили надежные функциональные данные для обоих OCR и РВЦА измерений. В то время как все типы клеток вели себя подобным образом в тесте митохондриальной стресс, разительные отличия между типами клетокнаблюдается при испытании на гликолиз стресс. Например, гликолитических производительность наивных Т-клеток была низкой по сравнению с спленоцитов или В-клеток, и он не изменялся с добавлением олигомицином. Это наблюдение согласуется с ранее опубликованных исследований 7,30, что подтверждает правильность нашего протокола.
В заключение, наш метод предлагает эффективный и удобный способ тестирования метаболической активности лимфоцитов с использованием внеклеточного анализатора потока, и он может быть полезным в широком диапазоне иммунологических исследований изучают метаболические изменения в иммунных клетках при активации, дифференциации клеток или из-за к фенотипов заболеваний, таких как инфекции, аутоиммунные заболевания и гематологических злокачественных новообразований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
| Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
| 0.5 M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
| RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
| L-Glutamine 200 mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
| HEPES 1 M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
| Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
| Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
| CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
| B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
| Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
| MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
| autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
| autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis. |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
| Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
| Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak. |
References
- Motz, G. T., Coukos, G. Deciphering and reversing tumor immune suppression. Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).
- Akkaya, M., Barclay, A. N. How do pathogens drive the evolution of paired receptors? Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).
- Dinarello, C. A. Proinflammatory cytokines. Chest. 118 (2), 503-508 (2000).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454 (2013).
- Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. Metabolic pathways in T cell fate and function. Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).
- Doughty, C. A., et al. Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth. Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).
- Caro-Maldonado, A., et al. Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells. J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
- Klein, A. B., et al. Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function. J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).
- Hsueh, R. C., et al. Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes. AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).
- Zambrano, K., et al. Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes. Biotechnol Prog. , (2016).
- Costa, G. L., et al. Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease. J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis. J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9 (2001).
- Akkaya, B., et al. A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry. J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).
- Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).
- Wick, A. N., et al. Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose. J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase system. Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).
- Terada, H. Uncouplers of oxidative phosphorylation. Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).
- Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PLOS ONE. 11 (3), e0152016 (2016).
- Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. 3rd Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping. J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).
- Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment. Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).
