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Immunology and Infection

Un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos

Published: November 21, 2016 doi: 10.3791/54918
Automatic Translation
*1, *2, 3, 2, 2
1Laboratory of Mitochondrial Biology and Metabolism, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Abstract

Los linfocitos responden a una variedad de estímulos mediante la activación de vías de señalización intracelular, que a su vez conduce a una rápida proliferación celular, la migración y la diferenciación, y la producción de citoquinas. Todos estos acontecimientos están estrechamente vinculados a la condición de energía de la célula, y por lo tanto el estudio de los caminos productores de energía puede dar pistas acerca de la funcionalidad global de estas células. El analizador de flujo extracelular es un dispositivo usado comúnmente para evaluar el desempeño de la glicolisis y la respiración mitocondrial en muchos tipos de células. Este sistema ha sido utilizado para estudiar las células inmunes en algunos informes publicados, sin embargo, un amplio protocolo optimizado especialmente para los linfocitos se carece. Los linfocitos son células frágiles que sobreviven mal en condiciones ex vivo. Muchas veces los subgrupos de linfocitos son raros, y el trabajo con bajo número de células es inevitable. Por lo tanto, se requiere una estrategia experimental que se ocupa de estas dificultades. A continuación, ofrecemos un protocoloque permite un rápido aislamiento de linfocitos viables de los tejidos linfoides, y para el análisis de sus estados metabólicos en el analizador de flujo extracelular. Además, proporcionamos resultados de los experimentos en los que se compararon las actividades metabólicas de varios subtipos de linfocitos a diferentes densidades de células. Estas observaciones sugieren que el protocolo puede ser utilizado para lograr resultados consistentes y bien estandarizados incluso a concentraciones de células bajos, y por lo tanto puede tener amplias aplicaciones en futuros estudios que se centran en la caracterización de los eventos metabólicos en las células inmunes.

Introduction

La respuesta inmune frente a antígenos es un equilibrio estrechamente regulado entre la activación inmune y la supresión inmune. La activación inmunitaria impulsa la rápida proliferación celular y la migración, así como la producción de citoquinas, la secreción de anticuerpos y un aumento de la fagocitosis en respuesta al estimulante, mientras que la supresión inmune simplemente inhibe estos eventos y por lo tanto es importante en la prevención de la respuesta inmune innecesarios 1-6. Estudios recientes han demostrado que existe una relación directa entre el estado de activación de las células inmunes y la actividad de diversas rutas metabólicas 7. Las células inmunes pueden cambiar entre reposo y activadas por los estados de conmutación de las vías de producción de energía dentro y fuera. Además, se ha observado que diferentes tipos de células inmunes pueden utilizar diferentes estrategias metabólicas para alimentar sus mayores necesidades de energía durante la activación. Por ejemplo, mientras que la activación de los linfocitos T dirige a las células en un estado casi completamente glicolítica 8 9,10. Estos estudios señalan la importancia de investigar los efectos de la activación de células inmunes en el metabolismo celular.

En tiempo real, las mediciones simultáneas de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR), como indicadores de la fosforilación oxidativa y la glucólisis, es una estrategia común para hacer frente a los estados de las vías de producción de energía 11-13. Con el fin de lograr esto, un analizador de flujo extracelular, tales como el Seahorse XF 96, se utiliza de forma rutinaria. Tal instrumento puede comparar rápidamente los cambios de OCR y el CERA través de tipos de células o en diferentes condiciones de estimulación. Hasta ahora, varios tipos de células, incluyendo las células inmunes, se han estudiado el uso de estos dispositivos. Sin embargo, un protocolo optimizado diseñado específicamente para las células inmunes no está disponible.

Las células inmunes, particularmente linfocitos, difieren de otsus tipos de células en varias formas críticos. Los linfocitos son células frágiles que no sobreviven durante largos períodos en condiciones ex vivo 14-16. Este es un problema aún mayor cuando se cultivan en medio de crecimiento que carece de subóptima nutrientes esenciales, tales como los utilizados en el análisis de flujo extracelular. A diferencia de los macrófagos y muchas líneas de células, los linfocitos no se adhieren a las superficies de plástico; Por lo tanto, es fundamental para la fijación a la placa de análisis sin generar estrés. Por último, algunas subpoblaciones de linfocitos pueden ser extremadamente raro y cosecharlas en las cantidades óptimas requeridas, pueden ser un reto 17-19.

A continuación, ofrecemos un protocolo optimizado que se ha desarrollado específicamente para los linfocitos. El uso de esplenocitos, linfocitos B y los linfocitos T CD4 + vírgenes aisladas de bazo de ratón y los ganglios linfáticos 20, se muestran las características de su glicolisis y la fosforilación oxidativa estado de reposo en difedensidades t celulares. Los datos se normalizaron para tener en cuenta las diferencias en el número de células iniciales para cada pocillo mediante la medición de las concentraciones de proteína de lisados ​​de células de ensayo final, que eran directamente proporcionales a los números de células. Nuestro protocolo no sólo proporciona directrices para el rápido aislamiento de linfocitos viables para ensayos de flujo extracelulares, pero también permite trabajar a concentraciones de células subóptimas sin comprometer la calidad de los datos.

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo de animales LIG-4, el cual fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales NIAID.

1. Preparación de los reactivos

  1. Preparar tampón de separación magnética (MS): PBS (pH 7,2) suplementado con 0,5% de BSA y EDTA 2 mM o solución de separación automática suplementado con 0,5% de BSA. filtro estéril (0,22 m) y se almacena a 2-8 ° C.
  2. Preparar medio RF10: RPMI 1640 suplementado con suero fetal inactivado por calor 10% bovino, 50 U / ml de penicilina, 50 mM de estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina, 0,1 mM aminoácidos no esenciales, 50 mM 2 mercaptoetanol, HEPES 10 mM. Utilizar reactivos estériles. filtro estéril y se almacena a 2-8 ° C.
  3. Preparar mitocondrial medio de ensayo de estrés: medio de base XF suplementado con piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina y glucosa 25 mM.
  4. Preparar medio de prueba de esfuerzo glucólisis: supplemen medio base XFted con 2 mM L-glutamina.
  5. Ajustar el pH de los medios de ensayo tanto mitocondrial y el estrés glucólisis a 7,4, filtro estéril y se almacena a 2-8 ° C. medios calientes a 37 ° C y volver a ajustar el pH antes de su uso (la medición de pH a 37 ° C).
    NOTA: El uso de medio XF, que carece de bicarbonato, es crítica. Dado que la atmósfera en el analizador de flujo extracelular contiene sólo CO ambiente 2, cualquier bicarbonato en el medio, tras la unión a protones liberados como un subproducto de la glucólisis, se disociará para formar CO 2 y agua. CO 2 se desgasifique durante el experimento, lo que provoca desviaciones en el pH que pueden dificultar la señal de la acidificación glucolítica.
  6. Preparar oligomicina: Preparar 10 mM solución madre en DMSO; almacenar a -20 ° C.
  7. Preparar 2,4-DNP: Preparar una solución 1 M en DMSO; almacenar a -20 ° C.
  8. Preparar antimicina A: Preparar 10 mM solución madre en DMSO; almacenar a -20 ° C.
  9. Preparar la rotenona: Preparar 10 mM stac solución en DMSO; almacenar a -20 ° C.
  10. Preparar la glucosa: disolver la glucosa en el medio de prueba de esfuerzo glucólisis para formar una solución 250 mM; preparar fresco antes de cada experimento y no congelar.
  11. Preparar 2-DG: Disolver 2-DG sólida en medio de ensayo de estrés glucólisis para formar una solución 500 mM; preparar fresco antes de cada experimento y no congelar.

2. La recolección bazo y nódulos linfáticos de ratones

  1. La eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical.
  2. Pulverizar el ratón con un 70% de etanol.
  3. Para el posterior aislamiento de células T, recoger el bazo, cervical superficial, axilar superficial / profundo, mandibular, inguinal, y los ganglios linfáticos mesentéricos.
  4. Para la posterior aislamiento de células B, la cosecha sólo el bazo.
    NOTA: Utilice un gabinete de bioseguridad y mantener los órganos cosechados en PBS o en medios RF10 en hielo hasta su procesamiento. Utilice el material de laboratorio estéril y una técnica estéril para todo el procesamiento y el aisladoración pasos. Mantenga todos los tampones y medios de comunicación en el hielo para aumentar la eficiencia y el aislamiento para reducir la muerte celular.

3. Procesamiento de tejidos

  1. Colocar un colador de 70 micras celular sobre un tubo cónico de 50 ml y transferir los órganos en el colador. Para el aislamiento de las células T, combine todos los órganos y para la transferencia de aislamiento de células B sólo el bazo.
  2. Usando el émbolo de una jeringa estéril de 3 ml, triturar el tejido a través del filtro. Durante la maceración, asegúrese de que el filtro y los órganos son húmedo en todo momento y moje en caso necesario mediante la adición de tampón de MS. Esto tanto mantener la viabilidad celular alta y prevenir la obstrucción del filtro.
  3. Después de la maceración, aplicar 5-10 ml de tampón de MS al filtro para aumentar la recuperación celular. Centrifugar la suspensión a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. (Llevar a cabo todas las centrifugaciones posteriores en estas condiciones, a menos que se especifique).
  4. Se decanta el líquido y resuspender el precipitado en tampón de lisis de glóbulos rojos 5 ml ACK. Incubate durante 5 minutos en hielo para lisar las células rojas de la sangre (glóbulos rojos tienen que ser eliminado debido a que interfieren con la separación magnética). Añadir 10-20 ml de tampón y se centrifuga MS.
  5. Colocar un filtro de 30 micras de células en un tubo cónico de 15 ml y prepararlo con 1 ml de tampón MS (esta filtración eliminará los residuos de la lisis de los eritrocitos). Decantar el líquido desde el tubo de centrifugado, resuspender el precipitado en 5 ml de tampón MS y pasar a través del filtro. Lavar el tubo inicial con 4 ml de tampón de MS para aumentar la recuperación celular, y usar esto para enjuagar el filtro.
  6. El uso de un hemocitómetro o un contador de células automatizado, determinar el número total de células. Este número de células se utiliza para determinar la cantidad de reactivos de separación magnética requeridos en la Sección 4. Si esplenocitos se van a utilizar en el ensayo de flujo extracelular posterior, a un lado el número apropiado de células en este momento.
  7. Se centrifuga la suspensión y proceder a la separación magnética. esplenocitos Resuspender no utilizanpara el aislamiento de células B en 5 ml RF10 y mantener en hielo hasta que el ensayo de flujo extracelular.

4. La separación magnética de células B y células T naive CD4 +

  1. Determinar los volúmenes necesarios de cóctel de biotina-anticuerpo, microperlas anti-biotina, y el tampón de MS. Utilice los siguientes volúmenes de 10 8 células como guía y escalar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario.
    NOTA: Se incuban las muestras en un refrigerador en lugar de en el hielo desde la incubación en hielo puede reducir la eficacia de la unión de anticuerpos y pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos.
Reactivos para naïve separación de células T CD4 + Volumen por 10 8 células
(escala apropiada)
cóctel de biotina-anticuerpo 100 l
MS tampón para primera incubación 400 l
microperlas anti-biotina 200 l
microperlas CD44 100 l
MS tampón de incubación para la segunda 200 l
Incubar el coctel y las células biotina-anticuerpo a 4 ° C durante 5 min. Añadir microperlas anti-biotina, microperlas CD44, MS tampón y se incuba a 4 ° C durante 15 min.

Tabla 1: aislamiento de células T y las instrucciones.

Reactivos para la separación de células B Volumen por 10 8 células
(escala apropiada)
cóctel de biotina-anticuerpo 100 l
MS tampón para primera incubación 400 l
microperlas anti-biotina 200 l
MS tampón de incubación para la segunda 300 l
Incubar el coctel y las células biotina-anticuerpo a 4 ° C durante 15 min. Añadir el volumen apropiado de cóctel de biotina-anticuerpo y tampón de MS, y se incuba la mezcla a 4 ° C durante 15 min. Añadir el volumen apropiado de microperlas anti-biotina y MS tampón y se incuba la mezcla a 4 ° C durante 15 min. Después de la segunda incubación, llenar el tubo con tampón de MS y centrifugar.

Tabla 2: aislamiento de células B y las instrucciones.

  1. Resuspender el sedimento en tampón MS: 500 l para la separación manual, 3-4 ml para la separación automática.
  2. Continuar con cualquiera de las separaciones manuales o automatizadoscomo sigue:
    1. Separación manual:
      1. Inserte una columna LS en el imán de la separación, colocar un tubo cónico de 15 ml estériles abajo para recoger el flujo a través, y cebar la columna lavando con 3 ml de tampón SM. Desechar el flujo a través.
      2. Transferir la suspensión celular a la columna de LS imprimado y permitir el paso de ésta; lavar el tubo utilizado durante la incubación con 3 ml de tampón de MS y pasar esto a través de la columna también. El eluato contendrá las células purificadas. Para el aislamiento de células B, pasar las células purificadas a través de la columna una segunda vez en un nuevo tubo de 15 ml, y repetir la etapa de lavado. Esto aumentará la pureza y el rendimiento.
    2. La separación automatizada:
      1. Encienda el separador automático y comprobar los niveles de funcionamiento de amortiguación, y la solución de etanol al 70% de enjuague. Asegúrese de que los residuos está vacía antes de iniciar la separación.
      2. Seleccione el estante refrigerado apropiado dependiendo del tamaño del tubo de tque la muestra no purificada (por ejemplo, 15 ml). Con el fin de mantener las células viables durante todo el proceso de separación, utilizar bastidores que no se ha enfriado previamente a 2-8 ° C durante 3-4 horas, o hasta que el líquido refrigerante se convierte en sólido.
      3. Montar el estante refrigerado en la etapa de la muestra del separador automático.
      4. Colocar el tubo de muestra en la ranura A1, un tubo para la fracción negativa en la ranura B1, y un tubo para la fracción positiva en C1. Si la recogida de más de una muestra, colocar tubos adicionales en los próximos columnas (A2, B2, C2, etc.).
      5. Seleccione la pestaña de separación en la pantalla táctil, e indicar la disposición de los tubos en el rack. En el menú de separación, seleccione el programa "agota" y completar el ciclo del programa con el tipo apropiado de lavado (ver nota más abajo).
        NOTA: El programa "agota" lleva a cabo el agotamiento usando el modo más sensible de la máquina, que da prioridad a la pureza. Además, hay tres opciones diferentes de lavado: QUICk enjuague, enjuague, y dormir. Si las muestras son de la misma fuente y se van a combinar, seleccione enjuague rápido. Si las muestras deben mantenerse separados, seleccione enjuague. Seleccionar la opción de suspensión si no hay otros aislamientos se llevarán a cabo ese día y si la máquina se apagará después del aislamiento
      6. Comience el aislamiento pulsando el botón "Ejecutar", y confirmar los niveles de amortiguación cuando se le solicite. Después de que el programa ha terminado, la fracción negativa contendrá células purificadas.
    3. Llenar el tubo cónico hasta 15 ml con MS tampón y se centrifuga.
    4. Decantar la MS tampón y volver a suspender las células en 5 ml de medio RF10. Mantener células en hielo hasta que el ensayo de flujo extracelular.
      NOTA: Idealmente, el ensayo de flujo extracelular debe llevarse a cabo inmediatamente después del aislamiento. Sin embargo, en experimentos preliminares no se observaron diferencias significativas en los resultados de ensayo en las células utilizadas dentro de 3 h de aislamiento frente a aislados recién queridos.

NOTA: El protocolo descrito aquí es para el formato de 96 pocillos del instrumento. Los volúmenes tendrán que ser ajustado si se utiliza otro formato.

  1. La hidratación del cartucho del sensor
    1. Levante el cartucho del sensor, llene cada pocillo de la placa de servicio con 200 l de solución de calibrado y bajar el cartucho del sensor sobre la placa de utilidad, sumergiendo los sensores en la solución de calibrado.
      NOTA: Compruebe que el nivel de solución de calibrado es lo suficientemente alta para mantener los sensores sumergidos. El cartucho alberga fluoróforos asociados a O 2 y H + para cada pozo; estos deben ser hidratado con el fin de que funcionen correctamente.
    2. Coloque el cartucho en un 37 ° C incubadora no suplementado con CO 2 o de oxígeno / nitrógeno. Llevar a cabo todas las incubaciones adicionales en estas condiciones, a menos que se especifique. Incubar el cartucho durante la noche para hidratar.
  2. Preparación de placas recubiertas con adhesivo
    1. Preparar 2,5 ml de una solución de adhesivo de 22,4 mg / ml en bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,0 (bicarbonato proporciona el pH óptimo para la adsorción del adhesivo).
    2. Aplicar 25 l de la solución a cada pocillo de la placa de ensayo, y se incuba en el banco a temperatura ambiente durante 20 min.
    3. adhesiva Aspirar y lavar cada pocillo dos veces con 200 l de agua estéril. Espere hasta que los pozos están secos antes de sembrar las células.
  3. La siembra de células en placas revestidas con adhesivo
    1. centrifugar las células a temperatura ambiente a 200 xg durante 5 min. Resuspender las células en 5 ml de medio de ensayo adecuado (véase más arriba para la formulación de estrés mitocondrial y medios de comunicación de esfuerzo de glucosa). Centrifugar las células de nuevo y volver a suspender en la concentración deseada en medio de ensayo (volumen de resuspensión varían en función de la concentración; cada pocillo contendrá 180 l de suspensión celular).
      NOTA: Mientras los medios de ensayo adecuados y compuestos se utilizan, el analizador de flujo extracelular puede ejecutar simultáneamente las pruebas de estrés mitocondrial y la glucólisis en la misma placa.
    2. Placa de 180 l de suspensión celular en cada pocillo. Utilizar pozos A1, A12, H1 y H12 para el fondo de corrección de temperatura: añadir 180 l de medio de ensayo en estos pozos (sin células).
    3. Incubar las placas durante 25 min a 37 ° C.
    4. Centrifugar la placa a 200 xg durante 5 min sin freno para asegurar que todas las células han unido completamente. confirmar visualmente que las células se adhieren de forma estable a la superficie de cultivo, formando una monocapa, mediante la visualización en el microscopio. Transferir las placas de nuevo a la incubadora durante 30 min adicionales.
  4. Preparación de 10x concentraciones de compuestos, y carga de Puertos del inyector
    1. Para la prueba de estrés mitocondrial, preparar 2,5 ml cada una de 10 oligomicina mu M, mM DNP 1, y una mezcla de 10 mM y rotenona 10 mM antimicina A, todo en mitocondrial mediu ensayo de estrésmetro.
      NOTA: La concentración de 2,4-DNP se basa en estudios publicados anteriormente; 21 esto es una pauta general, pero la concentración de desacoplador para cada tipo de célula utilizado debe ser determinada por el investigador.
    2. Para la prueba de esfuerzo glucólisis, preparar 2,5 ml de cada una de glucosa 250 mM, 10 mM oligomicina, y 500 mM de 2-desoxiglucosa (2-DG) en medio de ensayo de estrés glucólisis.
    3. Cálidos 10x soluciones a 37 ° C, y ajustar el pH a 7,4.
    4. Cargar los compuestos en los puertos del inyector apropiadas del cartucho utilizando una micropipeta multicanal y las guías de carga, como sigue:
      Puerto Ensayo de estrés mitocondrial Ensayo de estrés glucólisis
      UN 20 l oligomicina 20 l de glucosa
      segundo 22 l de 2,4-DNP 22 l oligomicina
      do 25 l antimicina A / rotenona 25 l 2-DG
      Tabla 3: Compuesto.

      NOTA: Cada serie de puertos (por ejemplo, todos los puertos A) deben contener el mismo volumen. Es fundamental que todos los pocillos de una misma serie se cargan, incluso los que no se utiliza en el experimento, de lo contrario no serán inyectados los compuestos (puertos en los pocillos no utilizados pueden ser cargados con el mismo volumen de medio de ensayo).
    5. Incubar el cartucho de producir al instalar el programa.
  5. Configuración extracelular Ensayo de flujo de Protocolos
    1. Configurar el programa siguiente (Tabla 4).
      Paso Lazo Calibración -
      Equilibrio -
      lecturas de referencia 3 veces: Mezclar 3 min, 0 min esperar, la medida 3 min
      bucle End -
      Inyectar el puerto A -
      Mediciones 3 veces: Mezclar 3 min, 0 min esperar, la medida 3 min
      bucle End -
      Inyectar el puerto B -
      Mediciones 3 veces: Mezclar 3 min, 0 min esperar, la medida 3 min
      bucle End -
      Inyectar puerto C -
      Mediciones 3 veces: Mezclar 3 min, 0 min esperar, measure 3 min
      bucle End -
      Programa final -
      Tabla 4: Programa de diseño.
      NOTA: En ciertas condiciones, por ejemplo, cuando se utilizan células activadas, la acidificación puede continuar por más tiempo que en células de los animales. Por esta razón, puede ser necesario extender los tiempos de "espera" en el programa anterior o repetir cada ciclo de medición más veces.
    2. Iniciar el programa. Después de la etapa de calibración, vuelva a colocar la placa de compuesto de calibración de la placa de ensayo (cuando se le solicite).
      NOTA: El uso del software, es posible indicar los grupos de pozos que tienen condiciones similares. Además, es crucial para indicar cuales son los pozos de los pocillos de control (en este protocolo, que son las cuatro esquinas de la placa) y para indicar qué pozos están vacíos. Para un análisis más detallado, paso a paso, el protocolo para la creación de la máquina y ses de software, sitio web del fabricante debe ser consultado.
  6. La medición de contenido de proteínas
    1. Retire el medio de ensayo restante de cada bien sin molestar a las células.
      NOTA: Si no es conveniente para proceder con el ensayo de concentración de proteína, es posible congelar toda la placa a -20 ° C hasta su análisis. Si se congela, descongelar antes de continuar.
    2. Preparar una solución 1x de inhibidores de proteasa (100x de stock) en medio de lisis RIPA (suficiente para 50 l / pocillo).
    3. Añadir 50 l medio de lisis RIPA suplementado con inhibidores de la proteasa a cada pocillo. Agite la placa en un agitador durante 5 min, y luego se incuba la placa en hielo durante 30 min a células completamente lisan.
    4. Centrifuga la placa a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente para reducir los lípidos y otras moléculas a la parte inferior de la placa de manera que no interfieran con el ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
    5. Medir la concentración de proteína mediante el ensayo de BCA según el fabricante y# 39; s recomendaciones.

Representative Results

Las células eucariotas utilizan una red integrada de la glucólisis, ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), y la fosforilación oxidativa para satisfacer la mayoría de sus demandas energéticas y para aportar los productos intermedios necesarios para el crecimiento y la proliferación celular. Estas vías comienzan con el atrapamiento intracelular de glucosa libre en la forma de la glucosa-6-fosfato, que posteriormente se procesa en piruvato. El piruvato se sea reducida a lactato o se transporta a la mitocondria, donde forma acetil coenzima A (CoA). Acetil CoA entra entonces en el ciclo de Krebs. Intermedios de alta energía del ciclo del TCA impulsan el movimiento de electrones en la cadena de transporte de electrones (ETC), que a su vez expulsa H + de la matriz mitocondrial para generar un gradiente de H + a través de la membrana mitocondrial interna. El oxígeno actúa como aceptor final de electrones, y H + vuelta de nuevo a la matriz mitocondrial a través de la F O / F <sub> 1 complejo, en donde se utiliza su energía potencial de generar ATP (Figura 1A).

El principio de funcionamiento del ensayo de flujo extracelular depende de interferir con la glicólisis y la fosforilación oxidativa en puntos específicos, y la evaluación de los efectos resultantes. Para este propósito, se utilizó glucosa para propagar la glucólisis en las células de hambre, y 2-desoxiglucosa (2-DG), que se convierte en 2-desoxiglucosa-6-fosfato, un inhibidor competitivo de fosfoglucoisomerasa 23, por la hexoquinasa, con el fin de bloquear glucólisis. Rotenona (un inhibidor de complejo específico-I de la ETC), antimicina A (un complejo inhibidor III-específica de la ETC), oligomicina (inhibidor de la ATP sintasa 24), y el agente de desacoplamiento 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 eran utilicen para intervenir eventos específicos relacionados con el transporte de electrones, gradiente de protones y la síntesis de ATP (Figura 1A). En lugar de 2,4-DNP, cya carbonilonide-4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) también se puede utilizar, pero una mayor optimización puede ser requerida. En cualquier caso, desacopladores siempre deben ser titulados para un tipo específico de célula antes de su uso para determinar la concentración óptima necesaria.

La prueba de esfuerzo glucólisis (Figura 1B) comienza con una medición de línea de base de la velocidad de acidificación extracelular (ECAR) en las células previamente hambre. Puesto que estas células están en su mínimo basal, y pueden por tanto ser prácticamente considerados como no glicolítica, la ECAR medido en este punto se conoce como la acidificación no glicolítica. Esta acidificación probable corresponde a CO2 respiratorio generado en el ciclo de Krebs se convierte en HCO 3 - y H +. Esto es seguido por la inyección de glucosa para activar la glucólisis, que se presenta como un aumento en la acidificación extracelular debido a la formación de lactato.Este aumento representa la tasa normal de la glucólisis. Las células se estimularon con la inyección de oligomicina, que bloquea la generación de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Las células responden a esta dramática disminución en la producción de ATP mediante la activación de la glucólisis a su nivel máximo, y que se traduce en un aumento del nivel secundario en la ECAR (reserva glucolítica). La prueba se termina por la inhibición total de la glucólisis que utilizan análogos de la glucosa 2-DG, que devuelve el ECAR a su nivel no glucolítica. Curiosamente, se ha propuesto que, contrariamente a las recomendaciones del fabricante, la glucólisis máximo se alcanza no necesariamente por la inyección de oligomicina 26. En las células con una alta capacidad glucolítica, si no hay un aumento significativo en la demanda de ATP, la glucólisis puede ser perfectamente capaz de hacer frente a la pérdida de ATP mitocondrial sin necesidad de que sea hasta reguladas. La tasa glucolítica con oligomicina podría ser superada mediante la adición de inhibidores de las vías respiratorias, Tales como la rotenona y myxothiazol, que proporcionan algunos de los beneficios más de oligomicina: 1) Aumentan la demanda ATP, ya que provocan la inversión de la ATP sintasa, con la hidrólisis de ATP, para bombear protones en un intento de recuperar el potencial de membrana mitocondrial 26; 2) Evitan la acidificación respiratoria del medio, lo que puede confundir los resultados ECAR (ver abajo). Otras formas de aumentar la demanda de ATP incluyen la adición de compuestos que estimulan la hidrólisis de ATP por las ATPasas de membrana de plasma de 26. Todo esto debe ser cuidadosamente considerada por los investigadores en la planificación de una prueba de esfuerzo glucólisis.

La prueba de esfuerzo mitocondrial (Figura 1C) comienza con una medición de línea de base de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en células no hambre. Esto es seguido por la inyección de oligomicina, que inhibe el retorno de protones a través del complejo F O / F 1 y por lo tanto hyperpolariz rápidamentees la membrana mitocondrial. Hiperpolarización impide una mayor bombeo de protones a través de complejos respiratorios, y las vías respiratorias disminuye la velocidad. La respiración restante se denomina fuga de protones, que representa el flujo de protones a través de los lípidos o de otros canales. Este estado hiperpolarizado se invierte rápidamente por la adición del agente de desacoplamiento 2,4-DNP, que actúa como un ionóforo de protones. En respuesta, las células tratan de recuperar el potencial de membrana en un vano intento por aumentar la tasa de transporte de electrones en el máximo, y esto a su vez aumenta el OCR. Por último, con la adición de dos inhibidores de ETC (antimicina A y rotenona), la respiración mitocondrial se detiene por completo y OCR se reduce a su nivel más bajo. En este nivel, el consumo de oxígeno no se debe a la actividad mitocondrial (no mitocondrial). La diferencia en el OCR generados por estos inhibidores se denomina respiración mitocondrial máximo, que es la suma de la respiración de línea de base y de la capacidad de reserva.

B y aislamientos de células T dió poblaciones de linfocitos puros altamente viables.

Se aislaron las células B y las células T CD4 + vírgenes como se describe en la Sección 4 del protocolo, y los esplenocitos se obtienen simplemente por lisis de las células rojas de la sangre tal como se describe en la Sección 3.3.

La sensibilidad de los ensayos metabólicos específicos del tipo de células depende de la viabilidad y la pureza de la población de células de partida. Por lo tanto, con el fin de verificar la viabilidad de las células aisladas T de ratón, los esplenocitos y células B, y la pureza de las células T y B, pequeñas alícuotas de las células se tiñeron para el análisis de citometría de flujo (Figura 2). En el área de dispersión de dispersión hacia adelante frente a lateral-área (FSC frente a SSC-A-A) trama, los linfocitos fueron cerrada, y dentro de esta puerta, la población a lo largo de la diagonal de la dispersión hacia adelante-height (FSC-H) frente a FSC-Una parcela se determinaron como los interiores. Dentro de la población singlete, la viabilidad se midió por gating las células que se tiñeron negativa para el marcador en vivo / muerto (Figura 2A); la viabilidad de las células T fue 97,9%, la viabilidad de esplenocitos fue del 92%, y la viabilidad de las células B fue del 94%. Pureza de células B, medida por la B220 + CD19 + población 26, fue del 99%, mientras que la pureza de células CD4 + T, medida por el CD44 - población CD4 + 27, fue 98,3% (Figura 2B).

La concentración de proteína del lisado celular se puede utilizar como un indicador directo del número de células plateado.

Linfocitos aislados y los esplenocitos se sembraron en una placa de ensayo de 96 pocillos recubierta con adhesivo a 5 x 10 5 células / pocillo, 2,5 x 10 5 células / pocillo, 1,25 x 10 5 células / pocillo, y 0.625 x 10 (Figura 3A). Como era de esperar, confluencia correlacionada con las densidades iniciales de galvanoplastia. Al finalizar el ensayo de flujo extracelular, se lisaron células cultivadas en placas y sus concentraciones de proteína se cuantificaron usando el ensayo de BCA. Para todos los tipos de células, se demostró que se correlaciona linealmente con las densidades de chapado iniciales (Figura 3B), lo que confirma que las concentraciones de proteína lisado se pueden utilizar como una medida precisa para la normalización del número de células en la interpretación de los datos de flujo extracelulares concentraciones de proteína lisado. Las densidades de placas utilizadas en este experimento se han optimizado para los linfocitos no tratados previamente, no estimuladas. Si las células estimuladas o previamente cultivadas se van a utilizar, puede ser necesaria una optimización adicional.

Mitocondrial y stres glucolíticass ensayos dependen del número de células plateado.

El OCR se midió para cada tipo de célula y la densidad de la siembra en el analizador de flujo extracelular. Como se esperaba, el número de células más altas tienen un OCR más alto medido, así como las respuestas más dramáticos a oligomicina, 2,4-DNP, y antimicina A / rotenona (Figura 4A). La estandarización de las mediciones de OCR para la concentración de proteínas de cada muestra revela que, en general, un mayor número de células conducen a mediciones más precisas de OCR. Plating en 5 y 2,5 x 10 5 células / pocillo dio como resultado mediciones de OCR normalizados similares en las células T y los esplenocitos, y 5 y 1,25 x 10 5 células / pocillo dado como resultado mediciones de OCR normalizados similares en las células B (Figura 4B). Las pequeñas diferencias en la celda B normalizada mediciones de OCR pueden ser una indicación indirecta de que las células B desempeñan mejor en 2.5 x 10 5 células / pocillo en comparación con otras densidades celulares. En todos los sentidos, 0,625 x 10 5 células / pocillo dio resultados óptimos, lo que demuestra que esta densidad de cultivo es insuficiente. La respiración de línea de base, fuga de protones, la respiración mitocondrial máxima, la respiración no mitocondrial y la producción de ATP linealmente correlacionados con densidades de chapado para todos los tipos de células (Figura 4C). Además, la mayoría de la respiración de línea de base se utiliza para la síntesis de ATP, como se indica por la fuga de protones bajo en los tres tipos de células. Mientras que el objetivo principal del experimento estrés mitocondrial es medir los cambios en OCR, la ECAR sigue siendo útil para grabar para asegurar que el ensayo se llevó a cabo con éxito. Al igual que el OCR, las dos densidades más altas de chapado resultaron en mayor ECAR y respuestas más dramáticas de oligomicina, 2,4-DNP, y antimicina A / rotenona (Figura 4D). Los cambios dramáticos en ECAR después de la adición de 2,4-DNP, y antimicina A / rotenona pueden deberse a cambios en la respiración además de los cambios en glycolysis, ya que el CO 2 generado en el ciclo de Krebs se convierte en HCO 3 - y H +. Este problema ha sido abordado recientemente, y existe un método simple para corregir la señal total de acidificación extracelular en términos de consumo de oxígeno, para obtener la tasa glucolítica verdadera 12,29.

El ensayo de estrés glucólisis era más exitoso en la más alta densidad de placas (Figura 5A, B). En todos los tipos de células, las muestras de 5 x 10 5 células / pocillo tenían los mayores cambios en ECAR después de la adición de glucosa, oligomicina, y 2-DG (Figura 5B). Además, la normalización de la concentración de proteínas demostró que para todos los tipos de células, las 5 x 10 5 células / pocillo muestras dieron resultados óptimos, mientras que concentraciones más bajas -especialmente 0,625 x 10 5 células / pocillo-no mostraron una robusta capacidad de reserva glucolítica. No glycolytic acidificación, la glucólisis y la capacidad glucolítica aparente linealmente correlacionados con densidades de chapado para todos los tipos de células (Figura 5C). Para el experimento de estrés glucólisis, el gráfico muestra que la glucosa OCR estimula ligeramente la respiración mitocondrial, que después se inhibió por el tratamiento oligomicina; la adición de 2-DG no afectó a la OCR (Figura 5D). El gráfico de OCR se puede utilizar como un indicador adicional de que el experimento estrés glucólisis se realizó con éxito. Además, el gráfico de OCR se puede utilizar para corregir el gráfico ECAR, si es necesario, como se explicó anteriormente en el caso de la prueba de estrés mitocondrial 12,29.

Figura 1
Figura 1:. Esquema de ensayos de flujo extracelulares (A) Ilustración de la glucólisis (izquierda) y la fosforilación oxidativa (derecha) que muestra la acción de lamedicamentos metabólicos utilizados en los ensayos de flujo extracelular. (B) Esquema de la gráfica velocidad de acidificación extracelular (ECAR); esquemática del gráfico de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
. Figura 2: gating paso a paso de las células T, células B, y los esplenocitos para determinar la viabilidad y la pureza de citometría de flujo gráficos que muestran la viabilidad de las células T, los esplenocitos y células B (A); y la pureza de células T y B (B). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de THes figura.

figura 3
Figura 3:. Confluencia de la célula se correlaciona con las concentraciones de proteínas de lisado de cada tipo de células a diferentes densidades de chapado (A) micrografías de luz de células en pocillos de placas de ensayo a densidades de chapado que van desde 5 x 10 5 células / pocillo a 0,625 x 10 5 células / bien. Las barras de escala indican 50 micras. Las concentraciones de proteína (B) lisado a diferentes densidades de chapado, medido por el ensayo de BCA. Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Ensayo mitocondrial estrés. Raw (A) y OCR estandarizada (B) para cada tipo de célula y densidad de placas se muestran. (C) Teléfonos cambios dependientes de números-en los niveles de línea de base, y la respiración mitocondrial máxima no mitocondrial, así como los consumos de oxígeno vinculados a la fuga de protones o de la producción de ATP, se muestran para cada tipo de células. Se muestran los valores (D) Raw ECAR obtenidos de las pruebas de resistencia mitocondriales. Cada punto de datos representa la media de 7-8 pocillos con desviación estándar. flechas etiquetadas denotan inyecciones de oligomicina (O), 2,4-DNP (D), y la rotenona / antimicina A (R / A). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5:. Ensayo de estrés glicolítica Raw (A) y ECAR estandarizada (B) para cada tipo de célula y densidad de placas se muestran. (C) se muestran los cambios depende del número de células en el CERA de acidificación no glucolítica, la glucólisis inducida por glucosa y la capacidad glucolítica total. Se muestran los valores (D) Raw OCR obtenidos de las pruebas de resistencia glicolíticas. Cada punto de datos representa la media de 7-8 pocillos con desviación estándar. flechas etiquetadas denotan inyecciones de glucosa (G), oligomicina (O), y 2-desoxiglucosa (2-DG). Los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El protocolo desarrollamos permitió el aislamiento eficiente de los subgrupos de linfocitos pura y viable, que posteriormente fueron utilizados en el análisis de flujo extracelular en diferentes concentraciones para evaluar las diferencias en la glucólisis y el rendimiento de la respiración mitocondrial. Este protocolo está diseñado específicamente para los linfocitos y aborda las consideraciones especiales relacionadas con estos tipos de células, tales como la baja actividad metabólica basal, fragilidad, de baja frecuencia, y su incapacidad para adherirse a las placas de ensayo. Por lo tanto, en comparación con los protocolos publicados previamente 11,12, nuestro método ofrece una guía más conveniente y mejor optimizado para los investigadores que trabajan en el campo de la inmunología. Hay varios pasos críticos en este protocolo, incluyendo la obtención de poblaciones de células puras y viables, en placas las células en confluencia óptima, y ​​la estandarización de las mediciones del ensayo de flujo extracelular a la concentración de proteína en cada pocillo.

El initial número de células sembradas podría tanto ser visualizado por microscopía de luz y también cuantificarse utilizando mediciones de la concentración de proteínas. La correlación lineal entre el número de células y la concentración de proteína confirmó que la concentración de proteína de hecho se puede utilizar como una forma de normalizar los efectos de cambios en el número de células entre diferentes pozos.

Mediante la estandarización de las ECAR y OCR resultados a las concentraciones de proteína, se demostró que, a pesar de la confluencia celular más baja, tan sólo 2,5 x 10 5 células / pocillo se podrían utilizar en la mayoría de los ensayos sin comprometer la calidad de los datos. Sin embargo, el límite inferior de células que pueden ser empleados varían entre tipos de células y ensayos. Por ejemplo, mientras que tan sólo 1,25 x 10 5 células podrían ser utilizadas para mediciones de OCR de células B, incluso de 2,5 x 10 5 células / pocillo no fueron suficientes para evaluar el rendimiento glicolítico del mismo tipo celular. Por lo tanto, siempre y cuando el número de células no es un factor limitante, chapado en más de90% de confluencia, que corresponde aproximadamente a 5 x 10 5 linfocitos / pocillo, es preferible. La optimización adicional puede ser necesaria cuando las células de diferentes tamaños, tal como anteriormente se activan y linfocitos-utilizan parcialmente diferenciadas. Además, al utilizar linfocitos primarios previamente cultivadas, puede haber una variación en la viabilidad celular entre las diferentes condiciones de tratamiento, lo que disminuiría la fiabilidad de la concentración de proteína como una medida del número de células desde células muertas o moribundas también puede contribuir a los niveles de proteína medidos . En tales casos, podría ser útil para clasificar células vivas mediante citometría de flujo antes de llevar a cabo los ensayos de flujo extracelulares.

En nuestros ensayos usando recién aisladas y altamente viables las poblaciones de linfocitos, se obtuvieron datos funcionales fiables para ambas mediciones OCR y ECAR. Si bien todos los tipos de células se comportaron de manera similar en la prueba de estrés mitocondrial, notables diferencias entre los tipos de células fueronobservado en la prueba de esfuerzo glucólisis. Por ejemplo, el rendimiento glucolítica de las células T ingenuas era baja en comparación con los esplenocitos o células B, y no cambió con la adición de oligomicina. Esta observación coincide con los estudios publicados previamente 7,30, lo que confirma la validez de nuestro protocolo.

En conclusión, nuestro método ofrece una manera eficiente y conveniente de probar la actividad metabólica de los linfocitos utilizando un analizador de flujo extracelular, y puede ser útil en una amplia gama de estudios inmunológicos explorar los cambios metabólicos en las células inmunes tras la activación, la diferenciación celular o debido a fenotipos de la enfermedad, tales como infección, autoinmunidad y neoplasias hematológicas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS (pH 7.2) Gibco-ThermoFisher 20012-050 To make MACS buffer
Bovine Serum Albumin BSA Sigma-Aldrich A3803 To make MACS buffer
0.5 M EDTA, pH 8 Quality Biological 10128-446 To make MACS buffer
autoMACS rinsing solution Miltenyi Biotec 130-091-222 Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator.
RPMI-1640 Gibco-ThermoFisher 11875-093 Contains phenol red and L-glutamine
Fetal Bovine Serum Gibco-ThermoFisher 10437-028 For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. 
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) Gibco-ThermoFisher 15140-122 Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media.
L-Glutamine 200 mM (L-Glut) Gibco-ThermoFisher 25030-081 Component of RF10 and stress test media
Sodium pyruvate 100 mM Gibco-ThermoFisher 11360-070 Component of RF10 and stress test media
HEPES 1 M Gibco-ThermoFisher 15630-080 Component of RF10
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco-ThermoFisher 11140-050 Component of RF10
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco-ThermoFisher 21985-023 Component of RF10
Falcon 70 μm cell strainer Falcon-Fischer Scientific 87712 Used in cell isolation
Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip Covidien 8881513934 Used in cell isolation
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes  Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes  Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E Used in cell isolation
CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed Partec CellTrics 04-004-2326 Used in cell isolation
B Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-862 Used in cell isolation
Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-104-453 Used in cell isolation
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401 Used in cell isolation
MidiMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302 Magnet for separation
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 Holder for magnets
autoMACS Rinsing Solution 130-091-222 Rinsing solution for autoMACS Pro Separator
autoMACS Pro Separator Instrument Miltenyi Biotec N/A
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) Sigma-Aldrich D8375-5G
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg).
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) Sigma-Aldrich D198501
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis.
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 Follow manufacturer's instructions
Seahorse XFe96 FluxPak Seahorse Bioscience 101085-004 Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.
Seahorse XF Base Medium Seahorse Bioscience 102353-100 Used to prepare stress test media
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Seahorse Bioscience
Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm EMD Millipore-Fisher Scientific SCGPU10RE Used to sterile filter media.
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 487031 Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak.

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Un protocolo optimizado para analizar la glucólisis y respiración mitocondrial en los linfocitos
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Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J. Vis. Exp. (117), e54918, doi:10.3791/54918 (2016).

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