Abstract
Il existe actuellement de nombreux outils chimiques disponibles pour introduire des sondes chimiques, dans les protéines à étudier leur structure et leur fonction. Une méthode utile est la protéine par conjugaison génétiquement l'introduction d'un acide aminé non naturel contenant un groupe fonctionnel bioorthogonal. Ce rapport décrit un protocole détaillé pour l'anticorps conjugaison spécifique au site. Le protocole expérimental comprend les détails de la constitution génétique d'un acide aminé contenant un azoture, et la réaction de conjugaison par cycloaddition de l'azide-alcyne souche promu (SPAAC). Cette réaction de contrainte favorisée par procède par simple mélange des molécules qui réagissent à un pH physiologique et à la température et ne nécessite pas de réactifs supplémentaires tels que le cuivre (I), les ions cuivre et des ligands chélateurs. Par conséquent, cette méthode est utile pour la conjugaison des protéines en général et le développement de conjugués anticorps-médicaments (ADC).
Introduction
Etant donné que la constitution génétique de p -methoxyphenylalanine dans Escherichia coli a été signalé, plus de 1 100 acides aminés non naturels (UAAs) ont été incorporés avec succès dans diverses protéines. 1-3 Parmi ces UAAs, les acides aminés contenant des groupes fonctionnels bioorthogonal ont été largement étudiés et représentent la plus grande proportion. Les groupes fonctionnels utilisés dans les bioorthogonal UAAs comprennent une cétone, un azoture 4, 5 alcyne, 6 cyclooctyne, 7 tétrazine, 8 α, β-insaturé , un amide, un norbornène 9, 10 transcyclooctene, 11 et bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Bien que chaque groupe fonctionnel a ses avantages et ses inconvénients, les acides aminés contenant du azoture ont été le plus largement utilisé pour la protéine conjugaison. p -Azidophenylalanine (AF), l' un des acides aminés contenant azido, est facilement disponible, et son incorporation efficiency est excellent. des protéines mutantes contenant cet acide aminé peut être mis à réagir avec des alcynes par cycloaddition catalysée par le cuivre ou avec cyclooctynes par SPAAC. 12-20
Récemment, biopharmaceutiques ont attiré une grande attention dans l'industrie pharmaceutique. Le conjugué anticorps-médicament (ADC) est une classe d'anticorps thérapeutiques qui sont avantageuses en raison de leur aptitude pour la thérapie ciblée pour le traitement des cancers humains 21 et d'autres maladies. Plus de 50 ADCs sont actuellement en essais cliniques, et le nombre augmente rapidement. Dans le développement de VPA, de nombreux facteurs doivent être considérés pour maximiser l'efficacité et minimiser les effets secondaires. Parmi ces facteurs, la réaction de conjugaison efficace et spécifique de site afin de former une liaison covalente entre un anticorps et d'un médicament est critique. L'efficacité et la spécificité souhaitée dans la réaction de conjugaison peut être obtenue par la conjugaison avec un groupe fonctionnel dans un bioorthogonall'acide aminé non naturel qui est spécifiquement incorporé à un anticorps. 22-26 Ici, nous rapportons un protocole à site spécifiquement incorporer AF dans un fragment d'anticorps et le conjugué fragment d'anticorps mutant avec une sonde biochimique.
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Protocol
1. Construction du plasmide
- Construire un plasmide d'expression (pBAD-HerFab-L177TAG) qui expriment le gène d'anticorps cible (pBAD-HerFab-WT) avec son 6 -tag, et remplacer le codon pour la leucine-177 avec le codon ambre (TAG) 27, en utilisant la technique de mutagenèse dirigée classique.
Voir le tableau des matériaux. - Construire un plasmide d'expression (pEVOL-AFRS) contenant les gènes codant pour l'ARNt Tyr évolué et aminoacyl-ARNt synthétase (aaRS) paire. Utilisez le vecteur plasmidique spécialement conçu, pEVOL, pour l'incorporation efficace de UAAs. Les protocoles d'information plasmidique et clonage détaillés sont décrits dans le rapport précédent. 28
- Obtenir un ADN de plasmide de haute qualité en utilisant des kits disponibles dans le commerce pour la préparation du plasmide. Le rapport 260/280 de ~ 1,8 est optimal pour l'ADN purifié. Si nécessaire, effectuer une électrophorèse sur gel d'agarose 1% pour vérifier la pureté de l'ADN.
- électroporation
- Ajouter chaque ADN de 1 pl de pEVOL-AFRS 28 et pBAD-HerFab-L177TAG à 20 souche Escherichia coli ul DH10β. Mélanger délicatement, à l'aide d'une pipette. Les plasmides peuvent être transformées ensemble ou dans des réactions indépendantes.
- Pour 0,1 cm cuvettes, définir les paramètres d'électroporation à 25 pF et 2,5 kV.
- Insérez la cuvette dans la glissière de la chambre choquante. Poussez la glissière dans la chambre jusqu'à ce que la cuvette soit fermement en contact avec les électrodes de la chambre.
- Pulse, une fois en appuyant sur le bouton d'impulsion jusqu'à ce que les bips de la machine d'électroporation.
- Ajouter 1 ml de super bouillon optimal avec la répression catabolique (SOC) contenant 2% (p / v) de tryptone, 0,5% (p / v) d' extrait de levure, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2 et 20 mM de glucose à la cuvette et de transférer rapidement le mélange dans un tube à essai. Incuber les cellules pendant 1 h à 37 ° C sous agitation.
- Étaler transformé des cellules de E. coli sur le bouillon Lysogénie (LB) des plaques d' agar contenant des antibiotiques appropriés (35 pg / ml de chloramphénicol et 100 pg / ml d' ampicilline pour sélectionner pEVOL-AFRS et pBAD-HerFab-L177TAG, respectivement). Incuber les plaques à 37 ° C pendant 12 heures.
- Préparation de la culture
- Inoculer une seule colonie transformée en 5 LB ml de milieu contenant des antibiotiques. Incuber pendant 12 h à 37 ° C avec agitation.
3. Expression et purification de HerFab-L177AF
- Expression de HerFab-L177AF
- Transférer la culture primaire (5 ml) dans 200 ml de LB milieu contenant de l'ampicilline (100 pg / ml) et AF (1 mM), suivi d'une incubation à 37 ° C sous agitation.
REMARQUE: la solution mère AF 100 mM (10 ml) a été préparée par dissolution de 206 mg AF dans 100 mM d'acide chlorhydrique (10 ml, volume final). - Ajouter 2 mL de 1,6 M arabinose (16mM concentration finale) lorsque la culture atteint la phase logarithmique (DO 550 = 0,8, OD = densité optique). Incuber pendant 12 h à 30 ° C avec agitation.
- Récolte des cellules par centrifugation à 11.000 xg pendant 5 min. Rejeter le surnageant et congeler le culot à -20 ° C.
- Transférer la culture primaire (5 ml) dans 200 ml de LB milieu contenant de l'ampicilline (100 pg / ml) et AF (1 mM), suivi d'une incubation à 37 ° C sous agitation.
- lyse cellulaire
- Remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 20 ml de tampon de lyse contenant du Tris périplasmique 30 mM (pH 8,0), 1 mM d'EDTA, 20% de saccharose et 0,2 mg / ml de lysozyme, et on incube le mélange pendant 1 h à 37 ° C.
- Centrifuger le lysat cellulaire à 18 000 xg à 4 ° C pendant 15 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et jeter le culot.
- Chromatographie d'affinité sur Ni-NTA
- Ajouter la suspension de Ni-NTA de résine dans chaque tube de centrifugeuse (400 ul de résine pour une culture de 200 ml), et mélanger doucement à 4 ° C pendant 1 h.
- Verser la suspension dans une colonne de polypropylène et laver la résine trois fois avec 5 ml bu de lavageffer contenant 50 mM de NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 20 mM d' imidazole et 300 mM de NaCl.
- Éluer l'anticorps cible avec 300 pi de tampon d'élution contenant 50 mM de NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 250 mM imidazole et 300 mM de NaCl.
- Déterminer la concentration de la protéine mutante par Bradford Protein Assay 29 ou en mesurant l'absorbance à 280 nm. Calculer le coefficient d'extinction (75866 M -1 cm -1) pour HerFab-L177AF à 280 nm par le calculateur de coefficient d'extinction de la protéine en utilisant le coefficient d'extinction (2471 M -1 cm -1) pour AF.
REMARQUE: La séquence d'acides aminés de HerFab peut être trouvé dans le site web du NCBI (GI: 783282791 et GI: 783282792).
4. Conjugaison Purifié HerFab-alcyne L177AF avec des sondes en utilisant la souche favorisée par cycloaddition de l'azide-alcyne (SPAAC)
- Ajouter 20 pi de Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-Adibo) dans H 2 O (20081; M concentration finale) à une solution de 10 pi de HerFab-L177AF (10 pM concentration finale) dans un tampon phosphate contenant 10 mM de Na 2 HPO 4 (pH 7,0) et NaCl 100 mM.
NOTE: Comme alternatives, cyclooctyne difluoré (DIFO) et bicyclo [6.1.0] nonyne dérivés (BCN) sont également disponibles pour la même application. - Laisser la réaction de cycloaddition souche promu se dérouler pendant 6 h à 37 ° C. Si une sonde sensible à la lumière (par exemple, Cy5.5) est utilisé, couvrez le récipient de réaction avec une feuille d'aluminium.
- Purifier le HerFab marqué selon l'étape 5.
5. Purification de Étiqueté HerFab
- Ajouter 500 ul d'échantillon à une colonne filtre rotatif centrifuge.
- Centrifuger la colonne de centrifugation à 14 000 xg à 4 ° C pendant 15 min.
- Jeter l'effluent et de transfert purifiés échantillon de la colonne de centrifugation dans un tube de centrifugation de 1,5 ml.
- Comme une alternative à l'étape 5.1- 5.3, effectuez purification par dialyse contre le même tampon.
- Stocker le étiqueté HerFab purifié à 4 ° C.
6. SDS-PAGE Analyse des Étiqueté HerFab
- Ajouter 5 ul SI tampon d'échantillon de protéine contenant 106 mM de Tris-HCl, 141 mM de base Tris (pH 8,5), 2% SI, 10% de glycerol, EDTA 0,51, 0,22 mM SERVA Bleu G250, et 0,175 mM de rouge de phénol à 13 pi de HerFab marqué purifié (7,8 uM ou 0,38 mg / ml) en présence (+) ou absence (-) de 2 ul de dithiothréitol (DTT, 100 mM de concentration finale). Laisser incuber le mélange à 95 ° C pendant 10 min.
- Fixer le Bis-Tris gel SDS-PAGE Cassette 4-12% à la cellule d'électrophorèse et d'ajouter un tampon en cours d'exécution. Chargez les échantillons de protéines conjugués et le marqueur pré-tachée poids moléculaire. Effectuer une électrophorèse sur gel pendant 35 min à 200 V.
Remarque: Conservez la cellule d'électrophorèse dans l'obscurité pendant toute la période pour réduire au minimum la photo-blanchiment du fluorophore. - Après électrophorèse, transfertle gel à un scanner de gel fluorescent, et de numérisation pour l'émission de fluorescence à la longueur d'onde appropriée. Pour Cy5.5, utilisez le mode Cy5 dans le logiciel du scanner.
- Colorer le gel avec une tache de protéine commerciale.
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Representative Results
Dans cette étude, un fragment d'anticorps est spécifique de site conjugué à un fluorophore par incorporation d' un acide aminé contenant un azoture dans le fragment et on fait réagir le fragment d'anticorps mutant avec une cyclooctyne tendue (figure 1). HerFab a été sélectionné en tant que le fragment d'anticorps cible dans laquelle AF a été incorporé comme un acide aminé contenant un azide. Pour choisir le résidu dans HerFab pour le remplacement de fibrillation auriculaire, la structure de HerFab cristalline aux rayons X a été analysé. 30 Les conditions importantes pour le résidu comprennent une distance suffisante à partir du site de liaison d'anticorps pour réduire au minimum la diminution de l'affinité de liaison et d' accessibilité au solvant pour la réaction de conjugaison efficace. Leucine à la position 177 était un candidat convenable parce que le résidu est bien exposée à l'extérieur de l'anticorps et situé à proximité de l'interface de deux domaines d'immunoglobuline, qui est distant du site de liaison d'anticorps.
contenu "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Dans un premier temps , le plasmide d'expression pour HerFab avec un C-terminal Son 6 -tag a été construit, et un codon ambre a été introduit à la position 177 pour AF incorporation par site mutagénèse -directed. le HerFab mutant contenant AF a été exprimé en présence d'une FA mM par co-exprimant l'ARNt Tyr et aminoacyl-ARNt synthétase évolué. 27 Ni-NTA purification par affinité a été effectuée pour les protéines mutantes exprimées en présence et en absence de FA et l'analyse SDS-PAGE ci - après a montré que le fragment d'anticorps de pleine longueur a été obtenue seulement en présence d' une FA (figure 2). Ensuite, le fragment d'anticorps mutant contenant AF a été évaluée pour la réaction de conjugaison avec un Cy5.5 dérivé aza-lié en dibenzocyclooctyne (Cy5.5-Adibo). le fragment d'anticorps et Cy5.5-Adibo sont amenés à réagir dans un tampon phosphate pendant 6 h et le mélange réactionnel a été analysé par SDS-PAGE en présence (+) et absence (-) De DTT (figure 3a). 25 La réaction avec un fragment d'anticorps de type sauvage a également été réalisé et analysé comme contrôle. Les images de fluorescence ont clairement montré la conjugaison du fragment d'anticorps mutant avec Cy5.5-Adibo, alors qu'aucune conjugaison n'a été observée dans la réaction avec le fragment de type sauvage. Electron pulvérisation ionisation par spectrométrie de masse (ESI-MS) analyse a montré la conjugaison quantitative sans fragment détectable non conjugué (Figure 3b). Dans l'ensemble, ces résultats montrent que le HerFab mutant contenant AF peut être efficace et pratique conjuguée avec cyclooctynes tendues par SPAAC sans réactif supplémentaire.
Figure 1: Représentation schématique de l' étiquetage des anticorps spécifiques au site par SPAAC.blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Expression de HerFab mutant contenant AF à la position 177 (L177) en présence de la paire ARNt / aaRS évolué. Expression de HerFab-L177AF dans un milieu LB contenant la paire ARNt / AFRS évolué et 1 AF mM. échantillons purifiés ont été analysés par SDS-PAGE en présence (+) ou absence (-) de DTT, et le gel a été coloré avec un colorant des protéines commerciales. Figure adaptée de Ko, W. et al. 27. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Conjugaison réagirion HerFab-L177AF avec Cy5.5-Adibo. (A) l' analyse SDS-PAGE de la réaction de conjugaison de type sauvage HerFab et HerFab-L177AF avec Cy5.5-Adibo. Les mélanges réactionnels ont été analysés en présence (+) ou absence (-) de DTT, et des bandes de protéines ont été visualisées par une coloration de protéine du commerce (à gauche) et l'imagerie par fluorescence (à droite). (B) ESI-MS analyse de HerFab-L177AF ( à gauche) et HerFab-L177AF marqué avec Cy5.5-Adibo ( à droite): différence de masse attendue entre HerFab- L177AF et l'anticorps conjugué = 1190 Da, observé différence de masse = 1,190 Da . Figure adaptée de Ko, W. et al. 27. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'incorporation génétique d'acides aminés non naturels dans des protéines présente plusieurs avantages par rapport à d'autres procédés utilisés pour la modification des protéines. 1-3 Un des avantages importants est son applicabilité générale à tout type de protéine. En principe, il n'y a pas de limitation dans la sélection d'une protéine cible et un site cible de la protéine. Toutefois, le remplacement d'un résidu structurellement ou fonctionnellement importante avec une SAU peut entraîner une modification de la structure et la fonction de la protéine cible. En général, les résidus qui sont exposés aux solvants et ne pas interagir avec d'autres résidus sont choisis pour l'incorporation de UAAs. Par conséquent, l'information structurelle à partir d'une structure cristalline à haute résolution est utilisé afin de choisir des sites optimaux pour UAA incorporation. 30 En raison de l'incorporation de UAAs est techniquement facile et requiert une mutagenèse simple, plusieurs sites peuvent être facilement triés pour choisir un résidu optimal pour la fonction souhaitée d'une protéine cible. </ P>
Dans ce protocole AF est génétiquement incorporé dans un fragment d'anticorps et le fragment mutant est spécifique de site marqué avec un fluorophore, en utilisant SPAAC. Le rendement de conjugaison de cette méthode est quantitative sans aucune réaction indésirable, ce qui est une amélioration importante par rapport au rapport précédent. 25 Ceci a été réalisé par une analyse minutieuse de structure pour la sélection d'un site optimal et une augmentation du temps de réaction. Par conséquent, le choix du site pour UAA incorporation est critique pour la conjugaison rapide et quantitative. En outre, l'utilisation de systèmes UAA d'incorporation efficaces (par exemple, pEvol-AFRS) est également critique pour le rendement en protéines et l' efficacité de l' incorporation. 28
D'autres UAAs incorporés dans les protéines par la méthode d'incorporation génétique pour la conjugaison des protéines peuvent également être utilisés pour la conjugaison d'anticorps. 4-11 En termes de vitesse de réaction, la réaction de cycloaddition catalysée par le cuivre,ainsi que inverse électronique demande une réaction de Diels-Alder en utilisant tétrazines 8 et alcènes tendues ou alcynes, 7 sera mieux que le SPAAC utilisé dans cette étude. Cependant, la réaction de cycloaddition catalysée par le cuivre nécessite de cuivre (I) et des ligands d' ions, 31 et les acides aminés pour la réaction de Diels-Alder sont souvent difficiles synthétiquement, et pas assez stable pour la conjugaison quantitative. Cétonique hydroxyamine condensation 4 peut également être utilisé pour le même but. Cependant, elle nécessite des conditions modérément acides, et sa vitesse de réaction est plus lente que celle de la SPAAC. Compte tenu des facteurs tels que l'accessibilité commerciale et synthétique des acides aminés non naturels, la vitesse de réaction, bio-orthogonalité, biocompatibilité des conditions de réaction, et l'incorporation efficacité des acides aminés non naturels, la méthode d'utilisation SPAAC et génétiquement incorporé AF serait utile pour le développement modifié des protéines thérapeutiques telles que la VPA, ainsi que pour le grandle marquage des protéines.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
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