Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54922
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Abstract

כרגע יש הרבה כלים כימיים זמינים להציג בדיקות כימיות לחלבונים ללמוד המבנה והתפקוד שלהם. שיטה יעילה היא הצמידה חלבון על ידי החדרה גנטית חומצת אמינו טבעית המכילה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. דו"ח זה מתאר פרוטוקול מפורט נטיית נוגדן אתר ספציפי. הפרוטוקול כולל פרטים ניסיוניים עבור שילוב הגנטי של חומצה תזיד המכיל אמינו, ותגובת הנטייה ידי cycloaddition אלקין-יזיד קדם-זן (SPAAC). התגובה זן-קידם זה ממשיך ידי ערבוב פשוט של מולקולות מגיבים ב- pH וטמפרטורה פיזיולוגיים, ואינו דורש ריאגנטים נוספים כגון יוני נחושת (אני) ו ligands chelating-נחושת. לכן, שיטה זו תהיה שימושית עבור נטיית חלבון בכלל ופיתוח של conjugates תרופת הנוגדן (ADC).

Introduction

מאז ההתאגדות הגנטית של -methoxyphenylalanine p ב Escherichia coli נמסרה, 1 יותר מ -100 חומצות אמינו לא טבעיות (UAAs) שולבו בהצלחה לחלבונים שונים. 1-3 בין UAAs אלה, חומצות אמינו המכילות קבוצות פונקציונליות bioorthogonal נחקרו רבות ומייצגים את השיעור הגבוה ביותר. הקבוצות הפונקציונליות bioorthogonal המשמשים UAAs כוללים קטון, 4 אזיד, 5 אלקין, 6 cyclooctyne, 7 tetrazine, 8 α, β אמיד-בלתי רוויות, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 ו bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 למרות כל קבוצה פונקציונלית יש יתרונות וחסרונות, חומצות אמינו המכיל תזדנה שמשו בצורה המקיפה ביותר עבור נטיית חלבון. p -Azidophenylalanine (AF), אחת מחומצות אמינו המכיל azido, זמין, ו effic התאגדותהiency מצוין. חלבונים Mutant המכיל חומצת אמינו זו ניתן הגיבו עם alkynes ידי cycloaddition היה הזרז נחושת או עם cyclooctynes ​​ידי SPAAC. 12-20

לאחרונה, תרופות ביולוגיות היו למשוך תשומת לב רבה בתעשיית התרופות. המצומד נוגדן-תרופה (ADC) היא מחלקה של נוגדנים הטיפוליות הקיימות יתרון בשל יכולתם לטיפול ממוקד לטיפול בגידולים בבני אדם 21 מחלות אחרות. יותר מ -50 ADCs כרגע בניסויים קליניים, והמספר גדל במהירות. בפיתוח של ממירי ADC, גורמים רבים צריכים להילקח בחשבון על מנת למקסם את היעילות ולצמצם את תופעות הלוואי. בין גורמים אלה, תגובת נטייה יעילה באתר ספציפי כדי ליצור קשר קוולנטי בין נוגדן ותרופה היא קריטית. היעילות הרצויה וספציפי תגובת הנטייה יכולים להיות מושגת על ידי נטייה עם קבוצה פונקציונלית bioorthogonal בביתחומצת אמינו טבעית אשר משולבת באופן ספציפי נוגדן. הנה 22-26, אנו מדווחים פרוטוקול אתר ספציפי לשלב AF לתוך נוגדן ו להטות שבר נוגדנים מוטציה עם בדיקה ביוכימית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בניית פלסמיד

  1. לבנות פלסמיד ביטוי (pBAD-HerFab-L177TAG) שיבטא את הגן נוגדן היעד (pBAD-HerFab-WT) עם -tag 6 שלו, ולהחליף את קודון עבור לאוצין-177 עם קודון ענבר (TAG) 27, באמצעות טכניקת mutagenesis אתר מכוון קונבנציונלית.
    ראה טבלה של חומרים.
  2. לבנות עוד פלסמיד ביטוי (pEVOL-AFRS) המכיל את הגנים עבור Tyr tRNA התפתחו synthetase aminoacyl-tRNA (המפיצים המורשים) זוג. השתמש וקטור הפלסמיד והמעוצב, pEVOL, עבור התאגדות יעילה של UAAs. פרוטוקולי מידע שיבוט פלסמיד המפורטים מתוארים בדוח הקודם. 28
  3. השג פלסמיד דנ"א באיכות גבוהה באמצעות הכנת ערכות פלסמיד זמינות מסחרי. יחס 260/280 של ~ 1.8 הוא אופטימלי עבור ה- DNA המטוהר. במידת הצורך, לבצע 1% ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לבדוק את הטוהר של ה- DNA.

s = "jove_title"> 2. הכנת תרבות

  1. electroporation
    1. הוסף כל DNA 1 μL של pEVOL-AFRS 28 ו pBAD-HerFab-L177TAG 20 זן μL Escherichia coli DH10β. מערבבים בעדינות, בעזרת פיפטה. פלסמידים יכול להיות המועברים ביחד או בתגובות עצמאיות.
    2. לקבלת cuvettes 0.1 ס"מ, לקבוע את הגדרות electroporation 25 μF ו -2.5 קילו.
    3. הכנס את קובט לתוך השקופיות של החדר המזעזע. דחוף את השקופית לתוך התא עד קובט יוצר קשר עם משרד האלקטרודות הקאמרי.
    4. Pulse פעם על ידי לחיצה על כפתור הדופק עד יצפצף electroporation.
    5. הוסף 1 מ"ל סופר מרק אופטימלי עם דיכוי catabolite (SOC) בינוני המכיל 2% (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) תמצית שמרים, 10 mM NaCl, 2.5 KCl מ"מ, 10 מ"מ MgCl 2, ו -20 גלוקוז מ"מ כדי קובט במהירות ולהעביר את התערובת לתוך מבחנה. דגירת התאים עבור 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
    6. מורחים טרנספורמציה E. coli תאים על מרק Lysogeny (LB) אגר צלחות המכילות אנטיביוטיקה מתאימה (35 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol ו -100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין לבחירת pEVOL-AFRS ו pBAD-HerFab-L177TAG, בהתאמה). דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
  2. הכנה תרבות
    1. לחסן מושבה טרנספורמציה אחת 5 אנטיביוטיקה המכיל בינוני מ"ל LB. דגירה במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.

ביטוי טיהור 3. HerFab-L177AF

  1. הביטוי של HerFab-L177AF
    1. מעבירים את התרבות העיקרי (5 מ"ל) לתוך 200 אמפיצילין המכיל בינוני מ"ל LB (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו AF (1 מ"מ), ואחריו הדגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
      הערה: 100 מ"מ AF פתרון המניות (10 מ"ל) הוכנה על ידי המסת 206 מ"ג AF ב 100 מ"מ חומצה הידרוכלורית (10 מ"ל, נפח סופי).
    2. הוסף 2 מ"ל של 1.6 M arabinose (16לריכוז סופי מ"מ) כאשר התרבות מגיע ביומן פאזיים (OD 550 = 0.8, OD = צפיפות אופטית). דגירה במשך 12 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד.
    3. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant ולהקפיא גלולה ב -20 ° C.
  2. תמוגה Cell
    1. Resuspend את כדורי תא 20 חיץ מ"ל periplasmic תמוגה המכיל 30 מ"מ טריס (pH 8.0), 1 mM EDTA, 20% סוכרוז ו -0.2 מ"ג / מ"ל ​​ליזוזים, דגירה את התערובת במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. צנטריפוגה lysate התא 18,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעביר את supernatant לצינור טרי וזורק את הכדור.
  3. כרומטוגרפיה זיקה Ni-נ.ת.ע
    1. הוסף ההשעיה שרף Ni-נ.ת.ע לכל צינור צנטריפוגות (שרף 400 μL עבור תרבות מ"ל 200), ומערבבים בעדינות על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. יוצקים את ההשעיה לתוך עמוד פוליפרופילן ולשטוף את שרף שלוש פעמים עם 5 bu לשטוף מ"לffer המכיל 50 מ"מ לאא 2 PO 4 (pH 8.0), 20 מ"מ imidazole, ו -300 מ"מ NaCl.
    3. Elute הנוגדן היעד עם חיץ elution 300 μL המכיל 50 מ"מ לאא 2 4 PO (8.0 pH), 250 imidazole מ"מ, ו -300 מ"מ NaCl.
    4. קביעת ריכוז של חלבון מוטנטי ידי השיטה ברדפורד 29 או על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר. חשב את מקדם הכחדה (75,866 M -1 cm -1) עבור HerFab-L177AF ב 280 ננומטר על ידי מחשבון מקדם הכחדה חלבון באמצעות מקדם הכחדה (2471 M -1 cm -1) עבור AF.
      הערה: את רצף החומצות האמיניות של HerFab ניתן למצוא באתר צמח השדה (GI: 783,282,791 ו GI: 783,282,792).

4. הצמידה של מטוהרי HerFab-L177AF עם בדיקות אלקין שימוש קדם-זנים יזיד-אלקין cycloaddition (SPAAC)

  1. הוסף 20 μL של Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) ב H 2 O (20081; לריכוז סופי M) לפתרון של 10 μL של HerFab-L177AF (10 מיקרומטר הריכוז הסופי) במאגר פוספט המכיל 10 מ"מ Na 2 HPO 4 (pH 7.0) ו 100 mM NaCl.
    הערה: ככל חלופות, difluorinated cyclooctyne (DIFO) ו bicyclo [6.1.0] nonyne (BCN) נגזרים זמינים גם עבור אותו יישום.
  2. אפשר תגובת cycloaddition קדם-הזן להמשיך במשך 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. אם בדיקה רגישה לאור (למשל, Cy5.5) משמשת, מכסה את כלי התגובה ברדיד אלומיניום.
  3. לטהר את HerFab סומן על פי שלב 5.

5. טיהור תווית HerFab

  1. הוספת 500 μL של המדגם לעמודה ספין מסנן צנטריפוגלי.
  2. צנטריפוגה העמודה ספין על 14,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  3. מחק זרימה דרך העברת מטוהרים מדגם מהעמודה ספין כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  4. כחלופה לשלב 5.3 5.1-, לבצע purification ידי דיאליזה נגד אותו החיץ.
  5. אחסן את HerFab שכותרתו מטוהר על 4 מעלות צלזיוס.

6. SDS-PAGE ניתוח של תווית HerFab

  1. הוסף 5 חיץ מדגם חלבון μL LDS המכיל 106 מ"מ טריס · HCl, 141 בסיס טריס מ"מ (pH 8.5), 2% LDS, 10% גליצרול, 0.51 mM EDTA, 0.22 מ"מ Serva כחול G250, ו 0.175 מ"מ פנול אדום עד 13 μL של מטוהרים שכותרתו HerFab (7.8 מיקרומטר או 0.38 מ"ג / מ"ל) בנוכחות (+) או העדרה (-) של 2 μL dithiothreitol (DTT, 100 מ"מ הריכוז הסופי). דגירה את התערובת על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  2. צרף את הקלטת ג'ל 4-12% Bis-טריס SDS-PAGE לתא אלקטרופורזה ולהוסיף הפעלת המאגר. טען את דגימות חלבון מצומדות ואת סמן משקל מולקולרי מראש מוכתם. בצע ג'ל אלקטרופורזה במשך 35 דקות ב 200 V.
    הערה: שמור את תא אלקטרופורזה בחושך במשך כל תקופת למזער צילום הלבנה של fluorophore.
  3. לאחר אלקטרופורזה, להעבירהג'ל סורק ג'ל ניאון, ולסרוק עבור פליטת קרינה באורך הגל המתאים. לקבלת Cy5.5, להשתמש במצב Cy5 בתוכנת הסורק.
  4. כתם ג'ל עם כתם חלבון מסחרי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקר זה, מקטע נוגדן היה האתר ספציפי מצומדות עם fluorophore על ידי שילוב של חומצות אמיניות המכילים תזדנה לתוך שהבר ותגובת שבר נוגדני המוטציה עם cyclooctyne מתוח (איור 1). HerFab נבחרה נוגדן היעד שלתוכו AF התאגד חומצת אמינו תזיד המכיל. כדי לבחור את שאריות HerFab להחלפה עם AF, המבנה הגבישי רנטגן של HerFab נותח. 30 דרישות חשובות עבור השאריות כוללות מספיק מרחק מאתר הנוגדן המחייב כדי למזער את הירידה וזיקתה מחייבת ונגישות ממס עבור תגובת נטייה יעילה. לאוצין במיקום 177 היה מועמד הגון כי השאריות חשופות היטב מחוץ הנוגדן וממוקמות ליד הממשק של שני תחומים אימונוגלובולינים, שהוא רחוק מן האתר מחייב נוגדנים.

התוכן "FO: keep-together.within-page =" 1 "> בתחילה, פלסמיד ביטוי HerFab עם בטרמינל C-6 -tag שלו נבנה, וכן קודון ענבר הוצג במיקום 177 עבור התאגדות AF ידי האתר mutagenesis -directed. HerFab מוטציה המכיל AF התבטאה בנוכחות 1 מ"מ AF ידי שיתוף המבטא את זוג synthetase tRNA Tyr ו aminoacyl-tRNA התפתח. 27 וטיהור זיקה Ni-נ.ת.ע בוצע עבור מוטנטיים לידי ביטוי נוכחות בהעדר AF, ועל ניתוח SDS-PAGE שלאחר מכן אכן הראה כי הנוגדן באורך מלא הושג רק בנוכחות של AF (איור 2). לאחר מכן, נוגדן המוטציה המכיל AF הוערך עבור תגובת נטייה עם Cy5.5 נגזר העז-dibenzocyclooctyne -linked (Cy5.5-ADIBO). שבר הנוגדן Cy5.5-ADIBO היו הגיבו חיץ פוספט במשך 6 שעות, ואת תערובת התגובה נותחה על ידי SDS-PAGE בנוכחות (+) ו הֶעְדֵר (-) של DTT (איור 3 א). 25 התגובה עם נוגדן מהסוג בר גם בוצעה ונותחה כביקורת. התמונות הקרינה הראו בבירור נטיה של נוגדן מוטציה עם Cy5.5-ADIBO, בעוד אין נטיה נצפתה תגובה עם שבר סוג בר. יינון ספריי אלקטרונים ספקטרומטריה (ESI-MS) ניתוח הנתונים הראה נטיה כמותי ללא שבר unconjugated לזיהוי (איור 3B). ככלל, תוצאות אלו הראו כי HerFab המוטציה המכיל AF יכול להיות יעיל מצומדות בנוחות עם cyclooctynes ​​מתוח ידי SPAAC ללא כל מגיב נוסף.

איור 1
איור 1: איור סכמטי של תיוג נוגדן אתר ספציפי על ידי SPAAC.blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ביטוי של HerFab מוטציה המכיל AF במיקום 177 (L177) בנוכחות של זוג tRNA / המפיצים המורשים התפתח. הביטוי של HerFab-L177AF במדיום LB המכיל זוג tRNA / AFRS התפתחו 1 מ"מ AF. דגימות מטוהרות נותחו על ידי SDS-PAGE בנוכחות (+) או העדרה (-) של DTT, ואת ג'ל הוכתם בכתם חלבון מסחרי. האיור המותאם Ko, ואח 'הוו. 27. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: הצמדתי להגיביון של HerFab-L177AF עם Cy5.5-ADIBO. (א) ניתוח SDS-PAGE של התגובה נטיה של HerFab סוג בר HerFab-L177AF עם Cy5.5-ADIBO. תערובות התגובה נותחו בנוכחות (+) והיעדר (-) של DTT, ולהקות חלבון היו דמיינו ידי כתם חלבון מסחרי (משמאל) דימות פלואורסצנטי (מימין). (ב) ESI-MS מנתח של HerFab-L177AF (משמאל) HerFab-L177AF שכותרתו עם Cy5.5-ADIBO (מימין): הפרש המסות צפוי בין HerFab- L177AF ואת נוגדן מצומדות = 1,190 Da, ציין הפרש המסות = 1,190 Da . האיור המותאם Ko, ואח 'הוו. 27. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השילוב הגנטי של חומצות אמינו לא טבעיות לחלבונים יש מספר יתרונות על פני שיטות אחרות משמשות שינוי חלבון. 1-3 אחד היתרונות החשובים הוא התחולה הכללית שלה לכל סוג של חלבון. באופן עקרוני, אין הגבלה בבחירת חלבון מטרה ואתר היעד של החלבון. עם זאת, החלפת משקע מבני או תפקודי חשובה עם UAA עלולה לגרום לשנות את המבנה והתפקוד של חלבון המטרה. באופן כללי, שאריות חשופות ממס לא אינטראקציה עם שאריות אחרות נבחרות עבור התאגדות של UAAs. לכן, מידע מבני מתוך מבנה הגבישי ברזולוציה גבוהה משמש כדי לבחור אתרים אופטימליים עבור התאגדות UAA. 30 בגלל השילוב של UAAs קל מבחינה טכנית ודורש mutagenesis פשוטה, אתרים מרובים יכולים להיות מוקרן בקלות לבחור שאריות אופטימליות עבור פונקציה רצויה של חלבון מטרה. </ P>

בפרוטוקול זה, AF משולב גנטית לתוך נוגדן, ואת שבר מוטציה הוא אתר ספציפי שכותרתו עם fluorophore, באמצעות SPAAC. תשואת הנטייה של שיטה זו היא כמוני ללא כל תגובה לא רצויה, וזה שיפור חשוב על הדו"ח הקודם. 25 זו הושגה על ידי ניתוח מבנים זהיר לבחירת אתר אופטימלי וגידול זמן התגובה. לכן, הבחירה של האתר עבור התאגדות UAA היא קריטית עבור נטייה מהר וכמותיים. בנוסף, השימוש במערכות התאגדות UAA יעילות (למשל, pEvol-AFRS) הנו העניין מהותי תשואת חלבון ויעילות התאגדות. 28

UAAs האחר שולב חלבונים על ידי שיטת התאגדות גנטית נטיית חלבון יכול לשמש גם עבור נטיית הנוגדן. 4-11 מבחינת קצב התגובה, התגובה cycloaddition-זרז נחושת,וגם את תגובתו אלקטרונים דרישת דילס-אלדר הפוכה באמצעות tetrazines 8 ו אלקנים מתוחים או alkynes, 7 יהיו טובים יותר מאשר SPAAC השתמש במחקר זה. עם זאת, תגובת cycloaddition-זרז נחושת דורשת נחושת (I) יון הליגנדים, 31 ואת חומצות אמינו עבור התגובה דילס-אלדר הם לעתים קרובות מאתגרים סינטטי, ולא יציבים מספיק נטייה כמותית. קטון-hydroxyamine עיבוי 4 יכול לשמש גם עבור אותה מטרה. עם זאת, זה דורש בתנאים חומציים בינוני, קצב התגובה שלה הוא איטי יותר מזו של SPAAC. בהתחשב בגורמים כגון נגישות מסחריות סינטטיות של חומצות אמינו לא טבעיות, את קצב התגובה, ביו-אורתוגונליות, התאמה ביולוגית של תנאי תגובה, ויעילות התאגדות של חומצות אמינו לא טבעיות, השיטה של ​​שימוש SPAAC וגנטי Incorporated AF יהיה שימושי לפיתוח שונה חלבונים תרופתיים כגון ממירי ADC, כמו גם עבור כלליםתיוג חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulser BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF) Bachem F-3075.0001 1 g
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% SAMCHUN E0064 1 kg
Sucrose Sigma S9378 500 g
Lysozyme Siyaku 126-0671 1 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1 kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12-well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
Typhoon 9210 variable mode imager Amersham Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

Tags

ביוכימיה גיליון 118 נוגדן הצמיד חלבון תזיד אלקין לא טבעי חומצות אמינו cycloaddition
יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H.… More

Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter