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Biochemistry

कुशल और साइट विशेष तनाव प्रवर्तित अब्द-alkyne cycloaddition द्वारा एंटीबॉडी लेबलिंग

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54922
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Abstract

वर्तमान में कई रासायनिक उपकरण उनकी संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन में रासायनिक जांच के परिचय के लिए उपलब्ध हैं। एक उपयोगी तरीका आनुवंशिक रूप से एक bioorthogonal कार्यात्मक समूह युक्त एक अप्राकृतिक अमीनो एसिड को शुरू करने से प्रोटीन विकार है। इस रिपोर्ट में यह साइट विशेष एंटीबॉडी विकार के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रोटोकॉल एक azide युक्त एमिनो एसिड की आनुवंशिक समावेश, और तनाव प्रवर्तित azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) द्वारा विकार प्रतिक्रिया के लिए प्रयोगात्मक विवरण शामिल हैं। इस तनाव प्रवर्तित प्रतिक्रिया शारीरिक पीएच और तापमान पर प्रतिक्रिया अणुओं की साधारण मिश्रण से गुज़रता है, और इस तरह तांबे (आई) आयनों और तांबे chelating ligands के रूप में अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, इस विधि सामान्य प्रोटीन विकार और एंटीबॉडी दवा conjugates (एडीसी) के विकास के लिए उपयोगी होगा।

Introduction

चूंकि कोलाई में पी -methoxyphenylalanine के आनुवंशिक समावेश सूचना मिली थी, 1 100 से अधिक अप्राकृतिक अमीनो एसिड (UAAs) सफलतापूर्वक विभिन्न प्रोटीन में शामिल किया गया है। 1-3 इन UAAs के अलावा, अमीनो bioorthogonal कार्य समूहों युक्त एसिड बड़े पैमाने पर अध्ययन और सबसे बड़ा अनुपात का प्रतिनिधित्व कर दिया है। Bioorthogonal कार्यात्मक UAAs में इस्तेमाल समूहों कीटोन, 4 azide, 5 alkyne, 6 cyclooctyne, 7 tetrazine, 8 α, β-असंतृप्त एमाइड, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 और bicyclo [6.1.0] -nonyne शामिल हैं। 11 यद्यपि प्रत्येक कार्य समूह ने अपने फायदे और नुकसान है, azide युक्त एमिनो एसिड सबसे बड़े पैमाने पर प्रोटीन विकार के लिए इस्तेमाल किया गया है। पी -Azidophenylalanine (वायुसेना), azido युक्त एमिनो एसिड में से एक, आसानी से उपलब्ध है, और इसके समावेश efficiency उत्कृष्ट है। उत्परिवर्ती इस एमिनो एसिड युक्त प्रोटीन तांबा उत्प्रेरित cycloaddition द्वारा या SPAAC द्वारा cyclooctynes ​​साथ alkynes साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की जा सकती है। 12-20

हाल ही में, बायोफार्मास्यूटिकल्स दवा उद्योग में काफी ध्यान आकर्षित किया गया है। एंटीबॉडी दवा साधना (एडीसी) मानव कैंसर के उपचार के लिए 21 और लक्षित चिकित्सा के लिए उनकी क्षमता के कारण चिकित्सीय एंटीबॉडी कि फायदेमंद हैं का एक वर्ग है अन्य रोगों। 50 से अधिक एडीसी नैदानिक ​​परीक्षण में वर्तमान में कर रहे हैं, और संख्या तेजी से बढ़ रही है। एडीसी के विकास में, कई कारकों प्रभावकारिता को अधिकतम और दुष्प्रभावों को कम करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। इन कारकों के अलावा, एक कुशल और साइट विशेष विकार प्रतिक्रिया एक एंटीबॉडी के बीच एक सहसंयोजक बांड के रूप में और एक दवा के लिए महत्वपूर्ण है। वांछित दक्षता और विकार प्रतिक्रिया में विशिष्टता एक में एक bioorthogonal कार्यात्मक समूह के साथ संयोजन के द्वारा प्राप्त किया जा सकताअप्राकृतिक एमिनो एसिड है कि विशेष रूप से एक एंटीबॉडी में शामिल किया है। 22-26 यहाँ, हम करने के लिए एक प्रोटोकॉल रिपोर्ट साइट विशेष रूप से शामिल एक एंटीबॉडी टुकड़ा में वायुसेना और एक जैव रासायनिक जांच के साथ उत्परिवर्ती एंटीबॉडी टुकड़ा एकत्रित।

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Protocol

1. प्लाज्मिड निर्माण

  1. एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (pBAD-HerFab-L177TAG) है कि एक अपने 6 -tag के साथ लक्ष्य प्रतिरक्षी जीन (pBAD-HerFab-डब्ल्यूटी) का निर्माण व्यक्त करेंगे, और एम्बर कोडोन साथ Leucine-177 के लिए कोडोन की जगह (टैग), 27, का उपयोग पारंपरिक साइट निर्देशित mutagenesis तकनीक।
    सामग्री की तालिका देखें।
  2. एक और अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (pEVOL-AFRS) विकसित tRNA Tyr और अमीनोएसिल-tRNA synthetase (Aars) जोड़ी के लिए जीन से युक्त निर्माण। विशेष रूप से डिजाइन प्लाज्मिड वेक्टर, pEVOL, UAAs के कुशल शामिल करने के लिए प्रयोग करें। विस्तृत जानकारी प्लाज्मिड और क्लोनिंग प्रोटोकॉल पिछली रिपोर्ट में बताया गया है। 28
  3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड तैयारी किट का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता प्लास्मिड डीएनए प्राप्त करते हैं। ~ 1.8 का अनुपात 260/280 शुद्ध डीएनए के लिए इष्टतम है। यदि आवश्यक हो, डीएनए की शुद्धता की जांच करने के लिए प्रदर्शन 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन।

  1. electroporation
    1. PEVOL-AFRS 28 और pBAD-HerFab-L177TAG के प्रत्येक 1 μL डीएनए 20 μL कोलाई DH10β तनाव में जोड़े। धीरे मिश्रण, एक पिपेट का उपयोग। plasmids एक साथ या स्वतंत्र प्रतिक्रियाओं में तब्दील किया जा सकता है।
    2. 0.1 सेमी cuvettes के लिए, 25 μF और 2.5 केवी electroporation सेटिंग्स निर्धारित किया है।
    3. चौंकाने वाला कक्ष की स्लाइड में क्युवेट डालें। जब तक क्युवेट चैम्बर इलेक्ट्रोड के साथ फर्म से संपर्क करता कक्ष में स्लाइड पुश।
    4. electroporation मशीन बीप तक पल्स बटन दबाने से एक बार नाड़ी।
    5. 1 एमएल catabolite दमन (समाज) मध्यम 2% से युक्त (डब्ल्यू / वी) tryptone, 0.5% (w / v) खमीर निकालने, 10 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 10 मिमी 2 MgCl के साथ सुपर इष्टतम शोरबा, और 20 मिमी ग्लूकोज जोड़े जल्दी क्युवेट करने के लिए और एक टेस्ट ट्यूब करने के मिश्रण हस्तांतरण। झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    6. Lysogeny शोरबा (पौंड) (pEVOL-AFRS और pBAD-HerFab-L177TAG क्रमश: चयन के लिए 35 माइक्रोग्राम / एमएल chloramphenicol और 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन) उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त प्लेटें अगर पर फैले तब्दील ई कोलाई कोशिकाओं। 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  2. संस्कृति तैयारी
    1. 5 मिलीलीटर लेग मध्यम युक्त एंटीबायोटिक दवाओं में एक भी तब्दील कॉलोनी टीका लगाना। झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए सेते हैं।

3. अभिव्यक्ति और HerFab-L177AF की शुद्धि

  1. HerFab-L177AF की अभिव्यक्ति
    1. 200 एमएल लेग मध्यम युक्त एम्पीसिलीन में प्राथमिक संस्कृति (5 एमएल) स्थानांतरण (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और वायु सेना (1 मिमी), झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा पीछा किया।
      नोट: 100 मिमी वायुसेना शेयर समाधान (10 एमएल) हाइड्रोक्लोरिक एसिड (10 एमएल, अंतिम मात्रा) 100 मिमी में 206 मिलीग्राम वायुसेना भंग द्वारा तैयार किया गया था।
    2. 1.6 मीटर arabinose के 2 मिलीलीटर जोड़ें (16मिमी अंतिम एकाग्रता) जब संस्कृति लॉग-चरण (आयुध डिपो के 550 = 0.8, आयुध डिपो = ऑप्टिकल घनत्व) तक पहुँचता है। झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए सेते हैं।
    3. 5 मिनट के लिए 11,000 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली फ्रीज।
  2. कोशिका अपघटन
    1. 20 एमएल periplasmic सेल युक्त 30 मिमी Tris (पीएच 8.0), 1 मिमी EDTA, 20% सूक्रोज, और 0.2 मिलीग्राम / एमएल लाइसोजाइम बफर में सेल छर्रों Resuspend, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिश्रण सेते हैं।
    2. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 18,000 XG पर सेल lysate अपकेंद्रित्र। एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और गोली त्यागें।
  3. नी NTA आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी
    1. प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब (एक 200 एमएल संस्कृति के लिए 400 μL राल) को नी NTA राल निलंबन जोड़ें, और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे मिश्रण।
    2. एक polypropylene स्तंभ में निलंबन डालो और राल 5 एमएल धोने बू के साथ तीन बार धोनेffer 50 मिमी नः 2 4 पीओ (8.0 पीएच), 20 मिमी imidazole, और 300 मिमी NaCl युक्त।
    3. 300 μL क्षालन 50 मिमी नः 2 4 पीओ (पीएच 8.0), 250 मिमी imidazole, और 300 मिमी NaCl युक्त बफर के साथ लक्ष्य एंटीबॉडी Elute।
    4. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख 29 या 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा उत्परिवर्ती प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण। प्रोटीन विलुप्त होने के गुणांक वायुसेना के लिए विलुप्त होने के गुणांक (2,471 एम -1 सेमी -1) का उपयोग कैलकुलेटर से 280 एनएम पर HerFab-L177AF के लिए विलुप्त होने के गुणांक (75866 एम -1 सेमी -1) की गणना।
      नोट: HerFab के अमीनो एसिड अनुक्रम एन सी बी आई वेबसाइट में पाया जा सकता है (सैनिक: 783282791 और सैनिक: 783282792)।

4. alkyne जांच के साथ शुद्ध HerFab-L177AF के विकार तनाव प्रवर्तित अब्द-alkyne cycloaddition का उपयोग करना (SPAAC)

  1. Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) के 20 μL एच 2 ओ में जोड़ें (20081, एम के अंतिम एकाग्रता) फॉस्फेट युक्त 10 मिमी ना 2 HPO 4 (7.0 पीएच) और 100 मिमी NaCl बफर में HerFab-L177AF के 10 μL (10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता) का एक समाधान करने के लिए।
    नोट: विकल्प, difluorinated cyclooctyne (DIFO) और bicyclo के रूप में [6.1.0] nonyne (बीसीएन) डेरिवेटिव भी एक ही आवेदन के लिए उपलब्ध हैं।
  2. तनाव प्रवर्तित cycloaddition प्रतिक्रिया 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें। एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील जांच (जैसे, Cy5.5) का इस्तेमाल किया जाता है, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रतिक्रिया पोत को कवर किया।
  3. चरण 5 के अनुसार लेबल HerFab शुद्ध।

5. लेबल HerFab की शुद्धि

  1. नमूने के 500 μL एक केन्द्रापसारक फिल्टर स्पिन स्तंभ में जोड़े।
  2. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 XG पर स्पिन स्तंभ अपकेंद्रित्र।
  3. त्यागें प्रवाह के माध्यम से और हस्तांतरण एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब स्पिन स्तंभ से नमूना शुद्ध।
  4. 5.1- 5.3 कदम के लिए एक विकल्प के रूप में, purifica प्रदर्शनएक ही बफर के खिलाफ डायलिसिस द्वारा tion।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध लेबल HerFab स्टोर।

6. एसडीएस पृष्ठ लेबल HerFab का विश्लेषण

  1. 5 μL एलडीएस प्रोटीन नमूना 106 मिमी Tris · एचसीएल, 141 मिमी Tris आधार (पीएच 8.5), 2% एलडीएस, 10% ग्लिसरॉल, 0.51 मिमी EDTA, 0.22 मिमी Serva ब्लू G250, और 13 μL करने के लिए 0.175 मिमी फिनोल लाल युक्त बफर जोड़ें उपस्थिति (+) या अनुपस्थिति में लेबल HerFab (7.8 माइक्रोन या 0.38 मिलीग्राम / एमएल) शुद्ध (-) 2 μL dithiothreitol की (डीटीटी, 100 मिमी अंतिम एकाग्रता)। 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं।
  2. वैद्युतकणसंचलन सेल करने के लिए 4-12% बीआईएस Tris एसडीएस पृष्ठ जेल कैसेट संलग्न है और चल बफर जोड़ें। संयुग्मित प्रोटीन के नमूने और पूर्व दाग आणविक वजन मार्कर लोड। 200 वी पर 35 मिनट के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना
    नोट: पूरी अवधि के दौरान अंधेरे में वैद्युतकणसंचलन सेल रखें fluorophore की तस्वीर विरंजन कम से कम।
  3. वैद्युतकणसंचलन के बाद, हस्तांतरणएक फ्लोरोसेंट जेल स्कैनर के लिए जेल, और उचित तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के लिए स्कैन। Cy5.5 के लिए, स्कैनर सॉफ्टवेयर में Cy5 मोड का उपयोग करें।
  4. एक वाणिज्यिक प्रोटीन दाग के साथ जेल दाग।

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Representative Results

इस अध्ययन में, एक एंटीबॉडी टुकड़ा साइट विशेष टुकड़ा में एक azide युक्त एमिनो एसिड शामिल करने और एक तनावपूर्ण cyclooctyne साथ उत्परिवर्ती एंटीबॉडी टुकड़ा प्रतिक्रिया द्वारा एक fluorophore साथ संयुग्मित (चित्रा 1) था। HerFab लक्ष्य एंटीबॉडी टुकड़ा जो में वायुसेना एक azide युक्त एमिनो एसिड के रूप में शामिल किया गया था के रूप में चयनित किया गया था। वायुसेना के साथ बदलने के लिए HerFab में छाछ का चयन करने के लिए, HerFab का एक्स-रे क्रिस्टल संरचना का विश्लेषण किया गया था। छाछ के लिए 30 महत्वपूर्ण आवश्यकताओं एंटीबॉडी बाध्यकारी साइट से पर्याप्त दूरी कुशल विकार प्रतिक्रिया के लिए अपने बंधन आत्मीयता में कमी और विलायक पहुंच को कम करने में शामिल हैं। स्थिति 177 पर Leucine एक सभ्य उम्मीदवार क्योंकि छाछ में अच्छी तरह से एंटीबॉडी के बाहर से अवगत कराया और दो immunoglobulin डोमेन के इंटरफेस है, जो एंटीबॉडी बाध्यकारी साइट से दूर है के पास स्थित है।

सामग्री "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> प्रारंभ में, एक सी टर्मिनल अपने 6 -tag साथ HerFab के लिए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड निर्माण किया गया था, और एक एम्बर कोडोन साइट के द्वारा वायुसेना शामिल करने के लिए स्थिति 177 में पेश किया गया था -directed म्युटाजेनेसिस। उत्परिवर्ती HerFab वायुसेना युक्त सह व्यक्त विकसित tRNA Tyr और अमीनोएसिल-tRNA synthetase जोड़ी ने 1 मिमी वायुसेना की उपस्थिति में व्यक्त की गई थी। 27 नी NTA आत्मीयता शुद्धि उपस्थिति में व्यक्त उत्परिवर्ती प्रोटीन के लिए किया गया था और वायुसेना, और निम्न एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के अभाव से पता चला है कि पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी टुकड़ा वायुसेना की उपस्थिति में ही प्राप्त हुई थी (चित्रा 2)। अगले, उत्परिवर्ती एंटीबॉडी वायुसेना युक्त टुकड़ा एक Cy5.5 साथ संयुग्मन प्रतिक्रिया के लिए मूल्यांकन किया गया था (+) से जुड़े Aza-dibenzocyclooctyne व्युत्पन्न (Cy5.5-ADIBO)। एंटीबॉडी टुकड़ा और Cy5.5-ADIBO 6 घंटे के लिए एक फॉस्फेट बफर में प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे थे, और प्रतिक्रिया मिश्रण एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया था और उपस्थिति में अनुपस्थिति (-) डीटीटी (चित्रा 3 ए) के। 25 एक जंगली प्रकार एंटीबॉडी टुकड़ा के साथ प्रतिक्रिया भी किया जाता है और एक नियंत्रण के रूप में विश्लेषण किया गया था। प्रतिदीप्ति छवियों स्पष्ट रूप से, Cy5.5-ADIBO साथ उत्परिवर्ती एंटीबॉडी टुकड़ा के विकार से पता चला है, जबकि कोई विकार जंगली प्रकार टुकड़ा के साथ प्रतिक्रिया में मनाया गया। इलेक्ट्रॉन स्प्रे आयनीकरण बड़े पैमाने पर spectrometric (ईएसआई एमएस) विश्लेषण नहीं detectable unconjugated टुकड़ा (चित्रा 3 बी) के साथ मात्रात्मक विकार दिखाया। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चला है कि उत्परिवर्ती HerFab वायुसेना युक्त किसी भी अतिरिक्त अभिकर्मक के बिना सुचारू रूप से और आसानी से SPAAC से तनावपूर्ण cyclooctynes ​​के साथ संयुग्मित हो सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: SPAAC द्वारा साइट विशेष एंटीबॉडी लेबलिंग की योजनाबद्ध चित्रण।blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: उत्परिवर्ती विकसित tRNA / Aars जोड़ी की उपस्थिति में स्थिति 177 (L177) में वायुसेना युक्त HerFab की अभिव्यक्ति। लेग माध्यम में HerFab-L177AF की अभिव्यक्ति विकसित tRNA / AFRS जोड़ी और 1 मिमी वायुसेना से युक्त। (-) शुद्ध नमूने उपस्थिति (+) या अनुपस्थिति में एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण किया गया डीटीटी का, और जेल एक वाणिज्यिक प्रोटीन दाग के साथ सना हुआ था। Ko, डब्ल्यू एट अल से अनुकूलित चित्रा। 27। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: संयुग्मन प्रतिक्रियाCy5.5-ADIBO साथ HerFab-L177AF के आयन। (क) Cy5.5-ADIBO के साथ जंगली प्रकार HerFab और HerFab-L177AF के विकार प्रतिक्रिया के एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण। (-) प्रतिक्रिया मिश्रण उपस्थिति (+) और अभाव में विश्लेषण किया गया डीटीटी का, और प्रोटीन बैंड एक वाणिज्यिक प्रोटीन दाग (बाएं) और प्रतिदीप्ति इमेजिंग (दाएं) द्वारा कल्पना थे। (ख) ईएसआई एमएस HerFab-L177AF (बाएं) और HerFab-L177AF Cy5.5-ADIBO (दाएं) के साथ लेबल का विश्लेषण करती है: HerFab- L177AF और संयुग्मित एंटीबॉडी = 1,190 दा, के बीच उम्मीद की बड़े पैमाने पर अंतर मनाया बड़े पैमाने पर अंतर = 1,190 दा । Ko, डब्ल्यू एट अल से अनुकूलित चित्रा। 27। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटीन में अप्राकृतिक एमिनो एसिड की आनुवंशिक समावेश प्रोटीन संशोधन के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों पर कई फायदे हैं। महत्वपूर्ण लाभ में से 1-3 से एक प्रोटीन की किसी भी तरह के लिए अपने सामान्य प्रयोज्यता है। सिद्धांत रूप में, वहाँ एक लक्ष्य प्रोटीन और प्रोटीन का एक लक्ष्य साइट का चयन करने में कोई सीमा नहीं है। हालांकि, एक UAA के साथ एक संरचनात्मक रूप से या कार्यात्मक महत्वपूर्ण अवशेषों के प्रतिस्थापन संरचना और लक्ष्य प्रोटीन के समारोह में फेरबदल हो सकता है। आम तौर पर, अवशेषों विलायक के संपर्क में हैं और अन्य अवशेषों के साथ बातचीत नहीं करते कि UAAs के समावेश के लिए चुना जाता है। इसलिए, एक उच्च संकल्प क्रिस्टल संरचना से जानकारी संरचनात्मक आदेश UAA शामिल करने के लिए इष्टतम साइटों का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 30 क्योंकि UAAs के समावेश तकनीकी रूप से आसान है और एक सरल mutagenesis की आवश्यकता है, कई साइटों को आसानी से लक्ष्य प्रोटीन का एक वांछित समारोह के लिए एक इष्टतम अवशेषों का चयन करने के लिए जांच की जा सकती है। </ P>

इस प्रोटोकॉल में, वायुसेना आनुवंशिक रूप से एक एंटीबॉडी टुकड़ा में शामिल किया है, और उत्परिवर्ती टुकड़ा साइट विशेष रूप से एक fluorophore के साथ लेबल है, SPAAC का उपयोग कर। इस विधि के विकार उपज किसी भी अवांछित प्रतिक्रिया है, जो पिछली रिपोर्ट पर एक महत्वपूर्ण सुधार है बिना मात्रात्मक है। 25 यह एक इष्टतम साइट के चयन और प्रतिक्रिया समय में वृद्धि के लिए सावधान संरचनात्मक विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया गया था। इसलिए, UAA शामिल करने के लिए साइट की पसंद तेजी से और मात्रात्मक विकार के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, कुशल UAA समावेश सिस्टम के उपयोग (जैसे, pEvol-AFRS) भी प्रोटीन की उपज और समावेश दक्षता के लिए महत्वपूर्ण है। 28

प्रोटीन विकार के लिए आनुवंशिक समावेश विधि द्वारा प्रोटीन में शामिल अन्य UAAs भी एंटीबॉडी विकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 4-11 प्रतिक्रिया दर के मामले में, तांबा उत्प्रेरित cycloaddition प्रतिक्रिया,साथ ही tetrazines 8 और तनावपूर्ण alkenes या alkynes का उपयोग कर उलटा इलेक्ट्रॉन मांग Diels-Alder प्रतिक्रिया के रूप में, 7 इस अध्ययन में इस्तेमाल SPAAC तुलना में बेहतर होगा। हालांकि, तांबा उत्प्रेरित cycloaddition प्रतिक्रिया तांबा (मैं) आयन और ligands, 31 और Diels-Alder प्रतिक्रिया के लिए अमीनो एसिड अक्सर कृत्रिम चुनौतीपूर्ण है, और मात्रात्मक विकार के लिए पर्याप्त रूप से स्थिर नहीं हैं की आवश्यकता है। कीटोन-hydroxyamine संक्षेपण 4 भी एक ही उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह मामूली अम्लीय परिस्थितियों की आवश्यकता है, और इसकी प्रतिक्रिया की दर SPAAC की तुलना में धीमी है। इस तरह के अप्राकृतिक अमीनो एसिड के वाणिज्यिक और सिंथेटिक पहुंच, प्रतिक्रिया की दर, जैव orthogonality, प्रतिक्रिया की स्थिति के biocompatibility, और अप्राकृतिक अमीनो एसिड के समावेश दक्षता, SPAAC और आनुवंशिक रूप से उपयोग करने की विधि के रूप में शामिल किया कारकों पर विचार वायुसेना के विकास संशोधित लिए उपयोगी होगा इस तरह के एडीसी के रूप में चिकित्सीय प्रोटीन, के रूप में अच्छी तरह से सामान्य के लिए के रूप मेंप्रोटीन लेबलिंग।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulser BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF) Bachem F-3075.0001 1 g
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% SAMCHUN E0064 1 kg
Sucrose Sigma S9378 500 g
Lysozyme Siyaku 126-0671 1 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1 kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12-well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
Typhoon 9210 variable mode imager Amersham Biosciences

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References

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
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जैव रसायन अंक 118 एंटीबॉडी प्रोटीन विकार अब्द alkyne अप्राकृतिक अमीनो एसिड cycloaddition
कुशल और साइट विशेष तनाव प्रवर्तित अब्द-alkyne cycloaddition द्वारा एंटीबॉडी लेबलिंग
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Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H.… More

Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).

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