Abstract
その構造と機能を研究するためにタンパク質に化学プローブを導入するために利用可能な多くの化学ツールは現在ありません。有用な方法は、遺伝的にバイオ直交官能基を有する非天然アミノ酸を導入することによって、タンパク質結合です。このレポートには、サイト固有の抗体結合のための詳細なプロトコルを記述しています。プロトコルは、アジド含有アミノ酸の遺伝的取り込み、および歪み促進アジド - アルキン付加環(SPAAC)によって結合反応のための実験の詳細が含まれています。この株促進反応は、生理的pHおよび温度で反応する分子を単純に混合することによって進行し、例えば、銅(I)イオンと銅キレートリガンドなどの追加の試薬を必要としません。したがって、この方法は、一般的なタンパク質の結合および抗体薬物複合体(ADCの)の開発に有用であろう。
Introduction
大腸菌 におけるP -methoxyphenylalanineの遺伝的取り込みが報告されて以来、1、100以上の非天然アミノ酸(UAAs)が正常に様々なタンパク質に組み込まれています。 1-3これらのUAAsの中で、バイオ直交官能基を含むアミノ酸は、広く研究さと最大の割合を表してきました。 UAAsで使用されるバイオ直交官能基は、ケトン、4アジド、5アルキン、6シクロオクチン、7テトラジン、8α、β不飽和アミド、9ノルボルネン、10 transcyclooctene、11およびビシクロ[6.1.0] -nonyneが含まれます。各官能基は、その長所と短所を持っている11が、アジド含有アミノ酸は、最も広範にタンパク質結合に使用されてきました。 P -Azidophenylalanine(AF)、アジド含有アミノ酸の一つは、容易に入手可能であり、その取り込みefficiencyが優れています。このアミノ酸を含有する変異体タンパク質は、銅触媒による付加環化によって、またはSPAACによってcyclooctynesとアルキンと反応させることができます。 12月20日
最近、バイオ医薬品は、製薬業界で大きな注目を集めています。抗体-薬物複合体(ADC)が原因で、ヒトの癌21の治療のための標的治療のためのそれらの能力に有利である治療用抗体のクラスであり、 他の疾患。 50以上のADCは現在臨床試験中であり、その数は急速に増加しています。 ADCの開発では、多くの要因が有効性を最大化し、副作用を最小限にするために考慮される必要があります。これらの要因の中でも、抗体と薬物との間に共有結合を形成するための効率的かつ部位特異的コンジュゲーション反応は重要です。コンジュゲーション反応における所望の効率及び特異性にバイオ直交官能基と結合することによって達成することができます具体的に抗体に組み込まれる非天然アミノ酸。ここで22-26、我々は、部位特異的に組み込むためのプロトコルを報告します 抗体断片にAFとは、生化学的プローブと変異型抗体断片を結合します。
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Protocol
1.プラスミド構築
- 彼の6タグを有する標的抗体遺伝子(のpBAD-HerFab-WT)を発現し、アンバーコドン(TAG)とロイシン-177のコドンに代わる発現プラスミド(のpBAD-HerFab-L177TAG)を構築27、使用して従来の部位特異的変異誘発技術。
材料の表を参照してください。 - 進化したtRNA TyrおよびアミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)ペアの遺伝子を含む別の発現プラスミド(pEVOL-AFRS)を構築します。 UAAsの効率的な取り込みのために、特別に設計されたプラスミドベクター、pEVOLを使用してください。詳細プラスミド情報およびクローニングプロトコルは、以前の報告書に記載されています。 28
- 市販のプラスミド調製キットを用いて高品質のプラスミドDNAを得ました。 〜1.8の260/280比は、精製されたDNAに最適です。必要であれば、DNAの純度を確認するために1%アガロースゲル電気泳動を行います。
- エレクトロポレーション
- 20μL 大腸菌 DH10β株にpEVOL-AFRS 28とのpBAD-HerFab-L177TAGの各1μLのDNAを追加します。ピペットを用いて、穏やかに混合します。プラスミドは、一緒にまたは独立した反応で形質転換することができます。
- 0.1センチメートルキュベットについては、25μFと2.5 kVでのエレクトロポレーションの設定を行います。
- 衝撃的なチャンバーのスライドにキュベットを挿入します。キュベットは、チャンバ電極としっかり接触するまでチャンバー内にスライドを押してください。
- エレクトロポレーションマシンのビープ音まで、パルスボタンを押すことで、一度パルス。
- カタボライト抑制(SOC)培地は、酵母エキス、10mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム(w / v)のトリプトン、0.5%(w / v)の、10mMのMgCl 2を2重量%含有する1mLの超最適ブロス、及び20mMのグルコースを追加キュベットへの迅速かつ試験管に混合物を移します。振盪しながら37℃で1時間、細胞をインキュベートします。
- (pEVOL-AFRSそれぞれのpBAD-HerFab-L177TAGを、選択するための35μgの/ mLクロラムフェニコールおよび100μg/ mLのアンピシリン)適切な抗生物質を含む寒天プレートLB培地(LB)のスプレッド形質転換された大腸菌細胞 。 12時間37℃で培養します。
- 文化の準備
- 抗生物質を含有する5mLのLB培地に単一形質転換コロニーを接種します。振盪しながら37℃で12時間インキュベートします。
HerFab-L177AFの3発現および精製
- HerFab-L177AFの発現
- 振盪しながら37℃でインキュベートし、アンピシリン(100μg/ ml)およびAF(1ミリモル)を含有する200mLのLB培地の中に初代培養物(5ml)に移します。
注:100mMのAFストック溶液(10mL)を100mM塩酸(10mLの最終体積)に206 mgのAFを溶解することによって調製しました。 - (16を1.6 Mアラビノースの2 mLを加え培養物が対数期(OD 550 = 0.8、OD =光学密度)に達するmMの最終濃度)。振盪しながら30℃で12時間インキュベートします。
- 5分間、11,000×gで遠心分離によって細胞を回収します。上清を捨て、-20℃でペレットを凍結します。
- 振盪しながら37℃でインキュベートし、アンピシリン(100μg/ ml)およびAF(1ミリモル)を含有する200mLのLB培地の中に初代培養物(5ml)に移します。
- 細胞溶解
- 30 mMトリス(pHは8.0)、1mMのEDTA、20%スクロース、および0.2 mg / mlでリゾチームを含む20mLのペリプラズム溶解用緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁し、そして37℃で1時間混合物をインキュベートします。
- 15分間4℃で18,000×gで細胞溶解物を遠心。上清を新しいチューブに移し、ペレットを捨てます。
- Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー
- 各遠心分離管(200 mLの培養のための400μL樹脂)へのNi-NTA樹脂懸濁液を追加し、4℃で1時間穏やかに混合します。
- ポリプロピレンカラムにサスペンションを注ぎ、5 mLの洗浄府で樹脂を3回洗浄fferの50mMのNaH 2 PO 4(pH8.0)で、20 mMイミダゾール、および300 mMのNaClを含みます。
- 50mMのNaH 2 PO 4(pHは8.0)、250 mMイミダゾール、および300 mMのNaClを含有する300μLの溶出緩衝液を用いて目的とする抗体を溶出させます。
- Bradfordタンパク質アッセイ29によって、または280nmでの吸光度を測定することにより変異体タンパク質の濃度を決定します。吸光係数(2471 M -1 cm -1 で )AF用を使用して、タンパク質の吸光係数の計算により280 nmでHerFab-L177AFの吸光係数(75866 M -1センチ-1)を計算します。
注:HerFabのアミノ酸配列は、NCBIのウェブサイトで見つけることができます(GI:783282791とGI:783282792)。
ひずみ促進アジド - アルキン付加環を使用してアルキンプローブを用いて精製したHerFab-L177AFの4コンジュゲート(SPAAC)
- (H 2 Oで200のCy5.5-Azadibenzocyclooctyne(のCy5.5-ADIBO)の20μLを追加します。81; 10mMののNa 2 HPO 4(pH7.0)に100mMのNaClを含むリン酸緩衝液中HerFab-L177AFの10μL(最終濃度10μM)の溶液にM最終濃度)。
注:代替、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)およびビシクロ[6.1.0]ノニン(BCN)誘導体も、同じアプリケーションで使用できます。 - 歪み促進付加環化反応は、37℃で6時間進行させます。感光性プローブ( 例えば、Cy5.5の)が使用される場合、アルミニウム箔で反応容器を覆います。
- ステップ5に従って標識HerFabを精製します。
標識HerFab 5.精製
- 遠心分離フィルタースピンカラムにサンプルの500μLを追加します。
- 15分間、4℃、14,000×gでスピンカラムを遠心します。
- フロースルーを捨て、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムから精製されたサンプルを転送します。
- 5.3 5.1-ステップに代わるものとして、purificaを行います同緩衝液に対して透析することによりる。
- 4℃で精製し、標識HerFabを保管してください。
標識HerFabの6 SDS-PAGE分析
- 106 mMトリス・塩酸、141 mMのトリス塩基(pHは8.5)、2%LDS、10%グリセロール、0.51 mMのEDTA、0.22 mMのSERVAブルーG250、および13μLに赤の0.175 mMのフェノールを含む5μLLDSタンパク質サンプルバッファーを追加します。 2μLのジチオスレイトール(DTT、100mMの最終濃度)の( - )の存在(+)または非存在下で標識されたHerFab(7.8μMまたは0.38ミリグラム/ mL)を精製しました。 10分間95℃で混合物をインキュベートします。
- 電気泳動セルに4〜12%のBis-Tris SDS-PAGEゲルカセットを取り付け、バッファを実行して追加します。共役タンパク質試料と前染色分子量マーカーをロードします。 200 Vで35分間電気泳動を行います
注:蛍光体の光退色を最小限にするために全期間の間、暗闇の中での電気泳動セルを保管してください。 - 電気泳動後、転送蛍光ゲルスキャナーにゲル、および適切な波長での蛍光発光をスキャン。 Cy5.5のために、スキャナソフトウェアでCy5のモードを使用します。
- 市販のタンパク質染色でゲルを染色。
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Representative Results
本研究では、抗体断片は、部位特異的フラグメントにアジド含有アミノ酸を組み込んでいると歪みシクロオクチン( 図1)を用いて変異体抗体断片を反応させることにより、フルオロフォアとコンジュゲートしました。 HerFabはAFがアジド含有アミノ酸として組み込んだ標的抗体フラグメントとして選択しました。 AFとの交換のためHerFab中の残留物を選択するには、HerFabのX線結晶構造を分析しました。残留物のための30の重要な要件は、効率的な結合反応のためにその結合親和性と溶媒接近の低下を最小限に抑えるために、抗体結合部位から十分な距離を含みます。残渣を十分に抗体の外部に露出し、2免疫グロブリンドメインの界面近傍に位置しているので、位置177のロイシンは、抗体結合部位から離れている、まともな候補者でした。
コンテンツ"FO:キープtogether.withinページ=" 1 ">最初は、彼の6タグのC末端とHerFabのための発現プラスミドを構築し、アンバーコドンは、サイトによって、AFの導入の位置177に導入しました標的とした突然変異誘発。AFを含む変異HerFabが進化のtRNA TyrおよびアミノアシルtRNAシンテターゼ対を共発現させることによって、1mMのAFの存在下で発現させた。27のNi-NTAアフィニティー精製が存在下で発現変異体タンパク質を行ったとAF、及び以下のSDS-PAGE分析の非存在は、全長抗体フラグメントはAFの存在下でのみ得られたこと( 図2)を示した。次に、AFを含む変異抗体フラグメントのCy5.5とのコンジュゲーション反応を評価しました存在下での結合型アザdibenzocyclooctyne誘導体(のCy5.5-ADIBO)。抗体フラグメントおよびCy5.5の-ADIBO 6時間、リン酸緩衝液中で反応させ、反応混合物をSDS-PAGEによって分析した(+)と不在 ( - )DTT( 図3a)の。 25野生型抗体断片との反応も行い、対照として分析しました。全く結合が野生型フラグメントとの反応において観察されなかった蛍光画像は、明らかに、のCy5.5-ADIBO有する変異抗体フラグメントの結合を示しました。電子スプレーイオン化質量分析(ESI-MS)分析では検出できないコンジュゲートしていない断片( 図3b)との定量的な結合を示しました。全体的に、これらの結果は、AFを含む変異HerFabを効率的かつ簡便に任意の追加試薬なしSPAACにより、歪みcyclooctynesと結合させることができることを示しました。
図1:SPAACにより部位特異的な抗体標識の模式図。「ブランク>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2: 進化したtRNA /のaaRS対の存在下で177位(L177)でAFを含む変異HerFabの発現。進化したtRNA / AFRS対および1 mMのAFを含むLB培地でHerFab-L177AFの発現。 ( - )精製されたサンプルは存在(+)または非存在下でSDS-PAGEにより分析したDTTの、およびゲルは、市販のタンパク質染色で染色しました。コ、W. らから適応図。 27。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3: 結合は、反応Cy5.5-ADIBOとHerFab-L177AFのイオン。 (a)は、野生型HerFabとのCy5.5-ADIBOとHerFab-L177AFの結合反応のSDS-PAGE分析を。 ( - )の反応混合物の存在(+)および非存在下で分析したDTTの、およびタンパク質バンドは、市販のタンパク質染色(左)および蛍光画像(右)により可視化しました。 (b)の ESI-MSはのCy5.5-ADIBO(右)で標識したHerFab-L177AF(左)とHerFab-L177AFの解析:HerFab- L177AFと結合抗体= 1190ダ間の予想される質量差を、= 1190ダ質量差を観察しました。コ、W. らから適応図。 27。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
タンパク質への非天然アミノ酸の遺伝的組込みは、タンパク質修飾のために使用される他の方法に比べていくつかの利点を有しています。 1-3重要な利点の一つは、タンパク質の任意の種類への一般的な適用です。原理的には、標的タンパク質とタンパク質の標的部位を選択するには制限がありません。しかし、UAAと構造的または機能的に重要な残基の置換は、標的タンパク質の構造および機能を変更することをもたらすことができます。一般的に、溶媒に露出されており、他の残基と相互作用しない残基はUAAsの取り込みのために選択されています。したがって、高解像度の結晶構造からの構造情報はUAAの取り込みのための最適の部位を選択するために使用されています。 30 UAAsの取り込みは技術的に容易であり、シンプルな突然変異誘発を必要とするため、複数のサイトが容易に標的タンパク質の所望の機能に最適な残留物を選択するためにスクリーニングすることができます。</ P>
このプロトコルでは、AFは、遺伝子、抗体フラグメントに組み込まれ、そして変異体フラグメントは、部位特異的SPAACを使用して、フルオロフォアで標識されています。この方法の結合収率は、以前の報告の上重要な改善である任意の望ましくない反応、なしに定量的です。 25これは、最適なサイトの選択、反応時間の増加を慎重に構造解析によって達成されました。したがって、UAAの取り込みのためのサイトの選択は、迅速かつ定量的な結合体化のために重要です。また、効率的なUAA組み込みシステム( 例えば 、pEvol-AFRS)の使用は、タンパク質収率および取り込み効率のために重要です。 28
タンパク質結合のための遺伝的組込み法によりタンパク質に組み込ま他UAAsも抗体結合のために使用することができます。反応速度の観点から4-11、銅触媒による付加環化反応、同様テトラジン8と緊張アルケンまたはアルキンを用いた逆電子デマンドディールス・アルダー反応として、 図7は、本研究で使用しSPAACよりも良くなります。しかし、銅触媒による付加環化反応は、多くの場合、合成困難な、そして定量的な結合のために十分に安定ではない、銅(I)イオンおよびリガンド31およびディールス-アルダー反応のアミノ酸を必要とします。ケトンヒドロキシ縮合4はまた、同じ目的のために使用することができます。しかし、適度に酸性条件を必要とし、その反応速度はSPAACよりも遅いです。このような非天然アミノ酸の商業合成アクセシビリティなどの要因を考慮すると、反応速度、バイオ直交反応条件の生体適合性、および非天然アミノ酸の取り込み効率、SPAACを用いる方法と、遺伝的にAFを組み込んだは、変更を開発するために有用であろうなどのADCとしてだけでなく、一般のための治療用タンパク質タンパク質標識。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1. Plasmid Construction | |||
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
2. Culture Preparation | |||
2.1 Electroporation | |||
Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
3.2 Cell Lysis | |||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
5. Purification of Labeled HerFab | |||
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |
References
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