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Biochemistry

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

Published: December 23, 2016 doi: 10.3791/54922

Abstract

그들의 구조와 기능을 연구하는 단백질로 화학 프로브를 소개 할 수 현재 많은 화학 도구가 있습니다. 유용한 방법은 유 전적으로 bioorthogonal 관능기를 함유하는 천연 아미노산을 도입하여 단백질 결합이다. 이 보고서는 사이트 별 항체 결합에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 아 지드 - 함유 아미노산의 유전자 도입하고, 변형 촉진 지드 - 사이클로 알킨 (SPAAC)에 의한 접합 반응의 실험 세부 사항을 포함한다. 이 변형 촉진 반응은 생리적 pH와 온도에서 반응 분자의 단순한 혼합으로 진행하고, 구리 (I) 이온 및 구리 킬레이트 배위자와 같은 추가의 시약을 필요로하지 않는다. 따라서,이 방법은 일반적으로 단백질 결합 항체 약물 접합체 (ADC)는 개발에 유용 할 것입니다.

Introduction

대장균에서 P는 -methoxyphenylalanine의 유전 적 결합이보고 된 이후, 100 개 이상의 비 천연 아미노산 (UAAs가) 성공적으로 다양한 단백질에 통합되었습니다. 이들 중에서도 UAAs 1-3 bioorthogonal 관능기를 함유하는 아미노산은 광범위하게 연구하고, 최대 비율을 표현하고있다. UAAs에 사용되는 bioorthogonal 기능 그룹은 케톤, 4 지드, 5 알킨, 6 cyclooctyne, 7 테트라, 8 α, β 불포화 아미드, 9 노보 넨, 10 transcyclooctene, 11, 시클로 [6.1.0] -nonyne을 포함한다. 각 작용기는 장점과 단점이 있지만 (11), 아 지드 - 함유 아미노산이 가장 광범위 단백질 접합에 사용되어왔다. P -Azidophenylalanine (AF), 아지도 - 함유 아미노산 중 하나가 용이 가능하며, 그 혼입 efficiency이 우수합니다. 이 아미노산을 함유하는 변이체 단백질은 구리 촉매 고리 화하거나 SPAAC 의해 cyclooctynes ​​알킨과 반응 할 수있다. 12-20

최근 바이오 제약 산업에서 큰 관심을 받고있다. 항체 약물 접합체 (ADC)는 의한 인간 암 (21) 및 치료 대상 치료 능력에 유리한 치료 항체의 클래스 기타 질병. 50 개 이상의 ADC는 임상 시험에서 현재 및 수는 급속히 증가하고있다. ADC 제품 개발에 많은 요인 효과를 최대화하고 부작용을 최소화하기 위해 고려되어야한다. 이러한 요인 중 효율적이고 부위 특이 적 결합 반응은 항체와 공유 결합을 형성하고, 약물은 매우 중요하다. 공액 반응에 원하는 효율 및 특이성은 bioorthogonal에서 작용기와 결합함으로써 달성 될 수있다특이 항체로 혼입되는 비 천연 아미노산. 여기에 22 ~ 26, 우리에 대한 프로토콜을보고 사이트를-구체적으로 통합 항체 단편으로 AF 및 생화학 프로브 변이체 항체 단편 공역.

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Protocol

1. 플라스미드 건설

  1. 그의 6 -tag와 대상 항체 유전자 (pBAD-HerFab-WT)을 표현하는 것 발현 플라스미드 (pBAD-HerFab - L177TAG)를 구축하고, 앰버 코돈과 류신-177의 코돈을 대체 (TAG) 27 사용 종래의 부위 특이 적 변이 법.
    재료의 표를 참조하십시오.
  2. 진화의 tRNA 티르와 아미노 아실 tRNA의 합성 (Aars의) 한 쌍의 유전자를 포함하는 또 다른 발현 플라스미드 (pEVOL-AFRS)를 구축합니다. UAAs의 효율적인 통합을 위해 특별히 디자인 된 플라스미드 벡터, pEVOL을 사용합니다. 상세한 정보 및 플라스미드 복제 프로토콜은 이전 보고서에 기재되어있다. (28)
  3. 시중에서 판매하는 플라스미드 준비 키트를 사용하여 높은 품질의 플라스미드 DNA를 얻습니다. ~ 1.8의 280 분의 260 비율은 정제 된 DNA에 최적입니다. 필요한 경우, DNA의 순도를 확인하는 1 % 아가 로스 겔 전기 영동을 수행한다.

  1. 전기
    1. 20 μL 대장균 DH10β 균주에 pEVOL-AFRS 28 pBAD-HerFab - L177TAG 각각 1 μL의 DNA를 추가합니다. 피펫을 사용하여 부드럽게 섞는다. 플라스미드를 함께 또는 독립적 인 반응으로 변형 될 수있다.
    2. 0.1 cm 큐벳를 들어, 25 μF 2.5 kV의에 전기 설정을 설정합니다.
    3. 충격적인 챔버의 슬라이드에 큐벳을 삽입합니다. 큐벳 챔버 전극에 닿을 때까지 챔버로 슬라이드를 밀어 넣습니다.
    4. 일렉트로 기계 경고음까지 펄스 버튼을 눌러 한 번 펄스.
    5. catabolite 억압 (SOC) 배지, 효모 추출물, 10 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을 (/ V W) 트립 톤, 0.5 % (/ V W), 10 밀리미터의 MgCl 2, 2 %를 함유하는 1 ㎖의 슈퍼 최적 국물, 20 mM의 글루코스를 추가 신속 큐벳 및 테스트 튜브에 혼합물을 옮긴다. 진탕하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 세포를 인큐베이션.
    6. (pEVOL-AFRS 각각 pBAD-HerFab - L177TAG을 선택하기위한 35 μg의 / ML의 클로람페니콜과 100 μg의 / ML의 암피실린) 적절한 항생제를 포함하는 판 한천 원성 국물 (LB)의 확산 형질 전환 된 대장균 세포. 12 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
  2. 문화의 준비
    1. 5 ㎖ LB 배지 포함하는 항생제의 단일 변환 식민지의 예방. 진탕 37 ° C에서 12 시간 동안 품어.

3. 발현 및 HerFab-L177AF의 정제

  1. HerFab - L177AF의 발현
    1. 200 mL의 LB 배지에 암피실린을 함유하는 일차 배양 (5 ml)에 전송 (100 μg의 / mL) 및 AF (1 mM)을 진탕하면서 37 ℃에서 배양 하였다.
      주 : 100 mM의 AF 스톡 용액 (10 ㎖)을 100 mM의 염산 (10 ㎖, 최종 부피)을 206 mg의 AF를 용해시켜 제조 하였다.
    2. (16 1.6 M 아라비 노스의 2 mL를 넣고문화 로그 상 (OD 550 = 0.8, OD = 광학 밀도)에 도달 mM의 최종 농도). 진탕 30 ° C에서 12 시간 동안 품어.
    3. 5 분 동안 11,000 XG에 원심 분리하여 수확 세포. 뜨는을 취소하고 -20 ° C에서 펠렛을 동결.
  2. 세포 용해
    1. 30 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 20 % 수 크로스, 0.2 ㎎ / ㎖의 리소자임을 함유하는 20 ㎖ 세포질 용해 완충액에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 37 ° C에서 1 시간 동안 혼합물을 배양한다.
    2. 15 분 동안 4 ℃에서 18,000 × g으로의 세포 용 해물을 원심 분리기. 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
  3. 니켈 NTA 친 화성 크로마토 그래피
    1. 각각의 원심 분리기 튜브 (200 mL의 문화 400 μL 수지)에 니켈 NTA 수지 서스펜션을 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 부드럽게 섞는다.
    2. 폴리 프로필렌 열로 현탁액을 붓고 5 mL로 세척 버퍼와 수지 세 번 씻어ffer의 50 mM의 NaH 2 PO 4 (PH 8.0), 20 mM의 이미 다졸, 및 300 mM의 NaCl을 함유하는.
    3. 50 밀리미터에 NaH 2 PO 4 (PH 8.0), 250 mM의 이미 다졸, 및 300 mM의 NaCl을 함유하는 300 μL 용출 완충액 표적 항체를 용출시켰다.
    4. 브래드 포드 단백질 분석 (29)에 의해 또는 280 nm에서 흡광도를 측정하여 돌연변이 단백질의 농도를 결정합니다. 흡광 계수 (2471 M -1 cm-1)에 대한 AF를 사용하여 단백질 흡광 계수 산출하여 280 nm에서 HerFab-L177AF 대한 흡광 계수 (75,866 M -1 cm-1)를 계산한다.
      주 : HerFab의 아미노산 서열은 NCBI 웹 사이트에서 발견 (GI : 783282791 및 GI : 783282792)을 할 수있다.

스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로을 사용하여 알킨 프로브를 정화 HerFab-L177AF 4. 활용 (SPAAC)

  1. (H 2 O에 200 Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) 20 μL를 추가81, 10 mM의 나트륨 2 HPO 4 (pH 7.0) 및 100mM NaCl을 함유하는 인산염 완충액 HerFab-L177AF 10 μL (10 μM 최종 농도)의 용액에 M, 최종 농도).
    참고 : 대안, 다이 플루오르 cyclooctyne (DIFO) 및 시클로 [6.1.0] nonyne (BCN) 파생 상품은 같은 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다.
  2. 스트레인 승진 고리 화 반응은 37 ℃에서 6 시간 동안 진행 할 수 있습니다. 감광성 프로브 (예, Cy5.5)를 사용하는 경우, 알루미늄 박과의 반응 용기 커버.
  3. 5 단계에 따라 표시 HerFab을 정화.

레이블이 HerFab 5. 정제

  1. 원심 필터 스핀 컬럼에 시료 500 μL를 추가합니다.
  2. 15 분 동안 4 ° C에서 14,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리기.
  3. 폐기 관류 및 전송에 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 스핀 컬럼으로부터 샘플을 정제 하였다.
  4. 대안 5.1 5.3 단계로서, 정수기를 수행동일한 완충액에 대해 투석하여 기.
  5. 4 ° C에서 정제 된 라벨 HerFab를 저장합니다.

레이블이 HerFab 6. SDS-PAGE 분석

  1. 106 mM 트리스 · 염산, 141 mM 트리스베이스 (PH 8.5), 2 % LDS, 10 % 글리세롤, 0.51 mM의 EDTA, 0.22 밀리미터의 Serva 블루 G250, 그리고 13 μL에 빨간색 0.175 mM의 페놀을 포함하는 5 μL LDS 단백질 샘플 버퍼를 추가 존재 (+) 또는 부재 HerFab (7.8 μM 또는 0.38 ㎎ / ㎖)을 표지 된 정제 된 (-) 2 μL 디티 오 트레이 톨 (DTT, 100 mM의 최종 농도). 10 분 동안 95 ℃에서 혼합물을 인큐베이션.
  2. 전기 영동 셀에 4-12% 비스 - 트리스 SDS-PAGE 겔 카세트를 부착하고 버퍼를 실행에 추가합니다. 공액 단백질 샘플 및 사전 스테인드 분자량 마커를로드합니다. 200 V. 35 분간 전기 영동을 수행
    참고 : 형광의 사진 표백을 최소화하기 위해 전체 기간 동안 어둠 속에서 전기 영동 셀을 유지합니다.
  3. 전기 영동 후, 전송형광 젤 스캐너에 젤, 그리고 적절한 파장에서 형광 방출을 검색. Cy5.5 들어 스캐너 소프트웨어에서 Cy5의 모드를 사용한다.
  4. 상업 단백질 얼룩 젤을 얼룩.

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Representative Results

이 연구에서, 항체 단편은 부위 - 특이 적 단편에 아 지드 - 함유 아미노산을 도입하고, 변형 cyclooctyne로 돌연변이 된 항체 단편을 반응시켜 형광 물질과 결합 (도 1)이었다. HerFab은 AF가 지드 - 함유 아미노산으로 통합되었다하는 대상 항체 단편으로서 선택 하였다. AF로 교체 HerFab 잔사를 선택하려면 HerFab의 X 선 결정 구조 분석 하였다. 잔류 물을 30 중요한 요구 사항은 효율적인 결합 반응에 대한 그것의 결합 친화 감소 및 용매 접근성을 최소화하기 위해 항체 결합 부위에서 충분한 거리를 포함한다. 잔류 물이 잘 항체의 외부로 노출 및 항체 결합 부위에서 멀리 떨어져있는 두 개의 면역 글로불린 도메인의 인터페이스 근처에 위치하기 때문에 위치 177에서 류신은 괜찮은 후보이었다.

콘텐츠 "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 처음에, 그의 6 -tag C- 말단과 HerFab의 발현 플라스미드를 구축하고, 황색 코돈이 사이트에 의해 AF 법인에 대한 위치 177에서 도입 -directed 돌연변이 유발. AF를 함유하는 돌연변이 HerFab 공동 발현 진화의 tRNA 티르 및 아미노 아실 tRNA의 신테 쌍 1mM의 AF의 존재하에 발현시켰다. 27의 Ni-NTA 친 화성 정제 존재 하에서 발현되는 돌연변이 단백질 수행 하였다 AF, 다음과 같은 SDS-PAGE 분석의 부재는 전장 항체 단편 AF의 존재 하에서 만 얻었다 (도 2)에 나타냈다. 다음에, AF를 포함하는 돌연변이 항체 단편은 Cy5.5와 공액 반응에 대해 평가했다 존재 -linked 아자 dibenzocyclooctyne 유도체 (Cy5.5-ADIBO). 항체 단편 Cy5.5-ADIBO 6 시간 동안 인산염 완충액으로 반응하고, 반응 혼합물을 SDS-PAGE로 분석 하였다 (+) 및 부재 (-) DTT (그림 3a)의. 25 야생형 항체 단편 물과의 반응은 진행하고 대조군으로 분석 하였다. 더 결합은 야생형 단편과 반응이 관찰되지 않는다 형광 화상이 선명, Cy5.5-ADIBO로 돌연변이 된 항체 단편의 결합을 보여 주었다. 전자 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS) 분석은 탐지되지 접합 조각 (그림 3b)와 양적 활용을 보였다. 전반적으로, 이러한 결과는 AF를 함유하는 돌연변이 HerFab가 추가 시약없이 효율적이고 편리하게 변형하여 SPAAC cyclooctynes과 접합 될 수있는 것으로 나타났다.

그림 1
그림 1 : SPAAC하여 사이트 별 항체 라벨의 도식입니다."빈>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 진화의 tRNA / Aars의 쌍의 존재 위치 177 (L177)에서 AF를 포함하는 돌연변이 HerFab의 식입니다. 진화의 tRNA / AFRS 쌍과 1 mM의 AF를 포함하는 LB 배지에서 HerFab - L177AF의 발현. (-)로 정제 샘플은 존재 (+) 또는 부재하에 SDS-PAGE로 분석 하였다 DTT, 그리고 겔 시판 단백질 염색을 하였다. 코, W. 등의 알에서 적응 그림. 27. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 활용 반응Cy5.5-ADIBO와 HerFab-L177AF의 이온. Cy5.5-ADIBO 야생 형 HerFab 및 HerFab-L177AF의 결합 반응의 (a) SDS-PAGE 분석. (-) 반응 혼합물이 존재 (+) 및 부재하에 분석 하였다 DTT의 단백질 밴드 시판 단백질 얼룩 (왼쪽)와 형광 화상 (오른쪽)에 의해 가시화 하였다. (b)는 ESI-MS는 Cy5.5-ADIBO (오른쪽)으로 표시 HerFab - L177AF (왼쪽)와 HerFab-L177AF 분석 : HerFab- L177AF와 결합 된 항체 = 1190 다, 사이 예상 질량 차이가 질량 차이 = 1190 다 관찰 . 코, W. 등의 알에서 적응 그림. 27. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

단백질에 비 천연 아미노산의 유전 결합 단백질 변성에 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 중요한 장점 중 1-3 하나는 단백질의 종류는 일반적으로 적용됩니다. 원칙적으로, 표적 단백질 및 단백질의 표적 부위를 선택에는 제한이 없다. 그러나 UAA와 구조적 또는 기능적으로 중요한 잔기의 치환은 목적 단백질의 구조와 기능을 변화 될 수있다. 일반적으로, 용매에 노출되는 등 잔류와 상호 작용하지 않는 잔류 물은 UAAs의 통합을 위해 선택된다. 따라서, 고해상도의 결정 구조에서 구조적 정보 UAA 혼입 최적의 위치를 ​​선택하기 위해 사용된다. 30 UAAs의 혼입이 기술적으로 용이하고 간단한 돌연변이가 필요하기 때문에, 여러 사이트가 용이하게 목표 단백질의 원하는 기능을위한 최적의 잔기를 선택 스크리닝 할 수있다. </ P>

이 프로토콜에서, AF는 유전자 항체 단편에 도입되어, 돌연변이 단편 SPAAC를 사용하여 부위 - 특이 적 형광 표지이다. 이 방법의 활용 수율은 이전 보고서를 통해 중요한 개선 원치 않는 반응없이 양적이다. (25) 이는 최적의 위치의 선택 및 반응 시간의 증가에 대한주의 구조 분석에 의해 이루어졌다. 따라서 UAA 혼입에 대한 사이트의 선택은 신속하고 정량적 접합 중요하다. 또한, 효율적인 UAA 혼입 시스템의 사용 (예 pEvol-AFRS)도 단백질 수율 및 혼합 효율이 중요하다. (28)

단백질 결합에 대한 유전자 도입 방법에 의해 단백질에 혼입 다른 UAAs는 항체 결합에 사용될 수있다. 반응 속도의 관점에서 4-11 구리 촉매 고리 화 반응물론 tetrazines 8 변형 알켄 또는 알킨을 사용하여 역 전자 수요 딜스 - 알더 반응으로,도 7은 본 연구에서 사용 된 SPAAC보다 더 좋을 것이다. 그러나, 구리 촉매 고리 화 첨가 반응은 종종 합성 도전 정량적 접합 충분히 안정적이지 구리 (I) 이온과 리간드, (31) 및 딜스 - 알더 반응에 대한 아미노산을 필요로한다. 케톤 히드 록실 축합 4는 또한 동일한 목적을 위해 사용될 수있다. 그러나, 적당한 산성 조건을 필요로하고, 그 반응 속도는 SPAAC보다 느리다. 상업 및 합성 비 천연 아미노산의 접근성, 반응 속도, 생체 직교성, 반응 조건의 생체 적합성 및 비 천연 아미노산의 혼입 효율 유전자 SPAAC 및 사용 방법과 같은 요인을 고려하면 AF 수정 개발 유용 할 혼입 된 치료 등의 ADC 같은 단백질뿐만 아니라, 일반적인 경우와단백질 표지.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture Preparation
2.1 Electroporation
Micro pulser BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF) Bachem F-3075.0001 1 g
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
3.2 Cell Lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% SAMCHUN E0064 1 kg
Sucrose Sigma S9378 500 g
Lysozyme Siyaku 126-0671 1 g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1 kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1 mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500 μL capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12-well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
Typhoon 9210 variable mode imager Amersham Biosciences

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References

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

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생화학 문제 (118) 항체 단백질 활용 아 지드 알킨 부 자연스러운 아미노산 사이클로
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Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H.More

Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).

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